膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

ここで説明する方法は、ヒトとマウスの両方で近位液を単離するために、膵臓がんの微小環境を研究して疾患の新しいバイオマーカーを特定するために適用できます。この簡単なプロトコルを使用して、膵液からの臨床所見をPDACのマウスモデルに変換して、メカニズム研究を行うことができます。膵液は、ほとんど未踏の体液であり、術前の診断や患者のプロファイリングに役立つ貴重なバイオマーカーの供給源として有望視されています。

私はプロトコールの最初の部分を実演し、私たちの研究室のポスドクであるMarialuisa Barbagalloは、プロトコールの2番目の部分を実演します。イメージング中に取得した測定値を使用して、膵管の位置を推定します。次に、膵臓の前面を触診して、その正確な位置を特定します。

膵臓の頭を下から十二指腸に持ち、左手で持ち上げて、膵管の位置を最初の数字でマークします。右手を使って、25ゲージの針が付いた3ミリリットルの注射器を、左手の親指のすぐ遠位にある膵臓に挿入します。針の貫通の深さと傾斜の程度は、術前の測定と管壁を貫通したという認識に基づいて決定します。

シリンジでジュースを引き出します。ジュースを取り出すことができない場合は、針を移動させて ?? 管をカニューレ状にしてください。.膵液が回収されたら、滅菌フィールドの外に移動し、3ミリリットルのEDTA真空試験管に移します。

サンプルがラボに移されるまで、チューブを摂氏4度に保ちます。膵液を処理するには、400G、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞や破片を取り除きます。上清を回収し、分注し、さらなる分析まで摂氏80度で保管します。

腫瘍間質液またはTIFを分離するには、遠心分離により腫瘍を半分に切断し、2つの部分をPBSですすぎ、濾紙で穏やかに拭き取り、腫瘍からの蒸発を避けるためにできるだけ速く移動します。直ちに腫瘍を50ミリリットルの円錐管に固定した20マイクロメートルのナイロンセルストレーナーに移します。チューブを400Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。

チューブの底からTIFを回収し、分注してすぐにドライアイスで凍結します。さらなる分析まで摂氏80度で保管してください。溶出を使用してTIFを分離するには、はさみまたはメスで腫瘍を細かく切り、冷たいPBSで慎重にすすいでください。

腫瘍片を1.5ミリリットルのチューブに移し、500マイクロリットルのPBSをプロテアーゼ阻害剤カクテルとともに追加して、分析物の劣化を防ぎます。組織を摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で一連の遠心分離ステップを実行して、サンプルから細胞を除去します。

各遠心分離後に上清を回収し、新しいチューブに移します。最後の遠心分離後、すぐにTIFサンプルを分注し、ドライアイス上で凍結します。さらに分析するまで、摂氏80度で保管してください。

このプロトコルは、PDACおよび他の良性膵臓疾患の患者から膵液を採取するために使用されました。高分子の広範なNMRシグナルをフィルタリングした後、低分子量代謝物からのシグナルが明らかになりました。教師付きOPLS-DA分析は、膵液中の代謝プロファイルがPDAC患者と非PDAC患者を82.4%の精度で識別できたことを示しました興味深いことに、同じ患者の血漿サンプルに対して行われたメタボローム分析は、同じ識別力をもたらさなかった。

腫瘍間質液含有量が腫瘍微小環境の変化を確実に反映することを実証するために、解糖速度が反対の2つの膵臓がん細胞株をマウスに皮下注射しました。腫瘍を切除した後、グルコースと乳酸の濃度を定量化しました。高解糖性腫瘍由来の腫瘍間質液は、低解糖性腫瘍と比較してグルコースが少なく、乳酸が多く含まれていました。

本研究では、メタボロミクス解析を行いました。しかし、この近位流体は、質量分析やマイクロRNAプロファイリングなど、他の多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。