膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離
2020年11月5日
膵液は、ヒト膵臓がんのバイオマーカーの貴重な供給源です。ここでは、術中収集手順の方法について説明します。マウスモデルでこの手順を採用するという課題を克服するために、代替サンプルである腫瘍間質液を提案し、ここではその分離のための2つのプロトコルについて説明します。
ここで説明する方法は、ヒトとマウスの両方で近位液を単離するために、膵臓がんの微小環境を研究して疾患の新しいバイオマーカーを特定するために適用できます。この簡単なプロトコルを使用して、膵液からの臨床所見をPDACのマウスモデルに変換して、メカニズム研究を行うことができます。膵液は、ほとんど未踏の体液であり、術前の診断や患者のプロファイリングに役立つ貴重なバイオマーカーの供給源として有望視されています。
私はプロトコールの最初の部分を実演し、私たちの研究室のポスドクであるMarialuisa Barbagalloは、プロトコールの2番目の部分を実演します。イメージング中に取得した測定値を使用して、膵管の位置を推定します。次に、膵臓の前面を触診して、その正確な位置を特定します。
膵臓の頭を下から十二指腸に持ち、左手で持ち上げて、膵管の位置を最初の数字でマークします。右手を使って、25ゲージの針が付いた3ミリリットルの注射器を、左手の親指のすぐ遠位にある膵臓に挿入します。針の貫通の深さと傾斜の程度は、術前の測定と管壁を貫通したという認識に基づいて決定します。
シリンジでジュースを引き出します。ジュースを取り出すことができない場合は、針を移動させて ?? 管をカニューレ状にしてください。.膵液が回収されたら、滅菌フィールドの外に移動し、3ミリリットルのEDTA真空試験管に移します。
サンプルがラボに移されるまで、チューブを摂氏4度に保ちます。膵液を処理するには、400G、摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞や破片を取り除きます。上清を回収し、分注し、さらなる分析まで摂氏80度で保管します。
腫瘍間質液またはTIFを分離するには、遠心分離により腫瘍を半分に切断し、2つの部分をPBSですすぎ、濾紙で穏やかに拭き取り、腫瘍からの蒸発を避けるためにできるだけ速く移動します。直ちに腫瘍を50ミリリットルの円錐管に固定した20マイクロメートルのナイロンセルストレーナーに移します。チューブを400Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
チューブの底からTIFを回収し、分注してすぐにドライアイスで凍結します。さらなる分析まで摂氏80度で保管してください。溶出を使用してTIFを分離するには、はさみまたはメスで腫瘍を細かく切り、冷たいPBSで慎重にすすいでください。
腫瘍片を1.5ミリリットルのチューブに移し、500マイクロリットルのPBSをプロテアーゼ阻害剤カクテルとともに追加して、分析物の劣化を防ぎます。組織を摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で一連の遠心分離ステップを実行して、サンプルから細胞を除去します。
各遠心分離後に上清を回収し、新しいチューブに移します。最後の遠心分離後、すぐにTIFサンプルを分注し、ドライアイス上で凍結します。さらに分析するまで、摂氏80度で保管してください。
このプロトコルは、PDACおよび他の良性膵臓疾患の患者から膵液を採取するために使用されました。高分子の広範なNMRシグナルをフィルタリングした後、低分子量代謝物からのシグナルが明らかになりました。教師付きOPLS-DA分析は、膵液中の代謝プロファイルがPDAC患者と非PDAC患者を82.4%の精度で識別できたことを示しました興味深いことに、同じ患者の血漿サンプルに対して行われたメタボローム分析は、同じ識別力をもたらさなかった。
腫瘍間質液含有量が腫瘍微小環境の変化を確実に反映することを実証するために、解糖速度が反対の2つの膵臓がん細胞株をマウスに皮下注射しました。腫瘍を切除した後、グルコースと乳酸の濃度を定量化しました。高解糖性腫瘍由来の腫瘍間質液は、低解糖性腫瘍と比較してグルコースが少なく、乳酸が多く含まれていました。
本研究では、メタボロミクス解析を行いました。しかし、この近位流体は、質量分析やマイクロRNAプロファイリングなど、他の多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。
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概要
本記事では、膵がんのバイオマーカーの貴重なソースとなる膵液を術中に採取する方法について提示します。さらに、代替サンプルとして腫瘍間質液を紹介し、マウスモデルにおけるその分離プロトコルについても解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- バイオマーカー探索
背景
- 膵液はバイオマーカーのソースとして十分に研究されていません。
- 術前診断を支援する可能性があります。
- 膵癌の微小環境を理解することは極めて重要です。
- ヒト研究で得られた知見をマウスモデルに適用することで、研究を深化させることができます。
研究目的
- バイオマーカー同定のために、膵液および腫瘍間質液を分離すること。
- ヒトおよびマウスの両モデルに適用可能なプロトコルを提供すること。
- 膵癌のメカニズム研究を促進すること。
使用した手法
- 術中の膵液採取。
- 腫瘍間質液の分離。
- 膵管を特定するためのイメージング技術。
- 正確な同定のための膵臓の触診。
主な結果
- 体液分離の実証済みプロトコルを提示した。
- バイオマーカー源としての膵液の可能性を強調した。
- 臨床的知見をマウスモデルへ展開する妥当性を示した。
- 将来的なメカニズム研究の基盤を提供した。
結論
- 膵液および腫瘍間質液は、バイオマーカー研究において有望です。
- これらのプロトコルは、膵癌への理解を深めるのに役立ちます。
- これらの液体の潜在能力を最大限に活用するためには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
業界における重要性
近位液体の分離により、膵管腺癌の微小環境を直接的に解析することが可能となり、臨床的な観察と前臨床的なメカニズム研究を橋渡しするバイオマーカー探索の道が開かれます。ヒトおよびマウスの両システムにおいて、膵液および腫瘍間質液を回収するための技術的に実行可能な手法を提供することで、本プロトコルは微小環境の変化に焦点を当てたターゲット検証およびアッセイ開発を支援します。このアプローチは、間質と腫瘍細胞の相互作用を反映した疾患関連液体を得ることで、初期探索における予測の信頼性を高め、膵癌の創薬プログラムにおけるGo/No-go決定に有用な情報を提供します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 腫瘍微小環境のバイオマーカーが濃縮された液体を単離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 近位液バイオマーカーを用いて、機能的ターゲット検証のための疾患関連システムを提供する。
- 科学的価値： TIF中のグルコースおよび乳酸の定量による糖新生腫瘍表現型の比較分析を通じて、メカニズムのリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 質量分析やmicroRNAプロファイリングなどのダウンストリームアプリケーションに向けて、検証済みの生物学的流体を調製します。
- 運用的価値： アッセイのスケールアップに適した、標準化され再現性のある分離プロトコル（遠心分離および溶出）を提供します。
- 科学的価値： 定量的な代謝物リードアウトを導出し、識別能の高い（OPLS-DAにおいて82.4%の精度）スクリーニング可能なバイオマーカー検出を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ヒトの膵液における知見をマウスTIFモデルに変換することで、疾患に関連するシステムの連続性を確立する。
- 運用の価値：微小環境の変化を反映した皮下腫瘍モデルからTIFを単離することにより、前臨床検証を促進する。
- 戦略的価値：液体バイオマーカーのプロファイルと腫瘍表現型を関連付けることで、リスク調整後の進展に関する意思決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、メカニズム研究やバイオマーカー主導のスクリーニングキャンペーンに不可欠な微小環境プロファイリングを可能にします。
- 探索生物学：PDACにおける間質・腫瘍相互作用を反映する液体を分離することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的メタボライトおよび核酸出力を得られる標準化されたTIFおよび膵液の分離により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析学：比較条件分析および表現型スクリーニングのための測定可能なバイオマーカー（glucose、lactate、メタボライト）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：マウスモデルにおいてTIFが腫瘍の糖新生状態を反映していることを示すことで、探索研究から前臨床への継続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：ヒトおよびマウス系全体における近接液体分離の再利用可能な能力を確立し、モデル間のトランスレーション障壁を低減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：PDACにおける微小環境バイオマーカーの検出およびターゲットバリデーションによる予測精度の向上。
- 運用上の価値：簡便な遠心分離および溶出技術を用いたTIF単離による、標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：液性バイオマーカーと腫瘍表現型を関連付けることで、go/no-go判断を改善し、後期段階における生物学的リスクを低減。
- ポートフォリオへの影響：バイオマーカーによる識別可能な液性プロファイル（PDAC対非PDACで82.4%の精度）に基づいた、リスク調整後の優先順位付け。
実施上の検討事項
- 近位液の単離には、外科的な液体ハンドリングおよび腫瘍切除の専門知識が必要です。
- 膵液およびTIFの処理には、遠心分離装置（400 G, 4°C）と、無菌的な液体ハンドリングが必要です。
- サンプルの完全性を維持するため、外科、病理、および分析チーム間での標準化が求められます。
- 組織サイズおよび下流のアプリケーションに基づき、遠心分離または溶出によるマウスTIF単離の適応検討が含まれます。
- マウスの膵液採取における技術的困難などの実用的制限があり、代替としてTIFを用いる必要があります。
