Name: 抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶレプリソームとDNA付加体の相互作用可視化法。近接結合アッセイを用いてヒト培養細胞で個別細胞内の相互作用頻度を評価し、細胞周期依存性の応答をin situで観察する技術を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究の一部は、米国国立老化研究所のNIHの壁内研究プログラム(Z01-AG000746–08)によってサポートされました。J.H.は、中国国家自然科学財団(21708007および31871365)の支援を受けています。

1.細胞調製
<ol><li>1日目<ol><li>35 mmガラス底培養皿を細胞接着剤溶液で前処理します。</li>
		<li>処理の1日前に前処理皿中の細胞を平板化する。細胞は実験当日に活発に分裂し、50〜70%コンフルエントでなければなりません。 注:HeLa細胞は、10%ウシ胎児血清、1xペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地DMEMでこの実験で使用されました。接着細胞株に制限はありません。ただし、非接着性細胞は、PLAによる分析の前にスライド上に遠心分離し、固定する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目<ol><li>以前に合成したDig-TMPの凍結アリコートを1:1 EtOH:H2Oに再懸濁することにより、ジゴキシゲニントリメチルソラレン(Dig-TMP)のストック溶液を調製します。 溶解したDig-TMPの100倍希釈(H2O)の250 nmでODを測定することにより、濃度を決定します。Dig-TMPの吸光係数は25,000です。各使用前に250nmでODを測定して濃度を確認し、ストック濃度を計算します:Abs x 100 x 106/25,000 =濃度(μM)。一般的に、ストック溶液は約3mMです。溶液は–20°Cで約1ヶ月間保存できます。 注:Dig-TMPは、ここで説明されている手順に従って、事前に化学合成する必要があります。4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレンをトルエン中で4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミンと窒素下で12時間還流させる。溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより4'-[N-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデカ)]アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン生成物を回収した。生成物をジメチルホルムアミドおよびトリエチルアミン中のジゴキシゲニンNHSエステルに50°Cで18時間結合させます。溶媒を除去し、残渣を分取薄層シリカゲルクロマトグラフィーで精製する。生成物バンドをクロロホルム:メタノール:28%水酸化アンモニウム(8:1:0.1)混合物で溶出します。溶媒を蒸発させ、ペレットを50%EtOH:H2Oに溶解する。</li>
		<li>50%EtOH:H2O中のDig-TMPストックを最終濃度5 μMになるまで細胞培養培地に加え、培地を37°Cにします。 プレートから培地を吸引し、予め温めたDig-TMP含有培地を加え、プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に30分間入れて、Dig-TMPを平衡化させます。</li>
		<li>細胞がインキュベートしている間に、UVボックス( 材料の表を参照)を37°Cに予熱します。</li>
		<li>プレートを予熱したUVボックスに置き、この実験のために細胞を3 J / cm2 のUVA光の線量に5分間さらします。プレートは、照射中、37°Cに維持したサーモブロックの上に置いた。次の式を使用して時間を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61689/61689equ01.jpg"></li>
		<li>ピペットを使用して培地を吸引し、新鮮な予熱培地を加え、プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに1時間戻します。</li>
		<li>メディアを取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皿を少し洗ってください。</li>
		<li>PBSを除去し、PBSに0.1%ホルムアルデヒド(FA)を加え、室温(RT)で5分間添加します。これにより、細胞質要素を抽出し、PLAバックグラウンドを低減するために必要なCSK-R(RNaseを含む細胞骨格抽出バッファー、1.2.9に記載)の前処理中の細胞剥離が防止されます。</li>
		<li>FAを吸引し、PBSで一度皿を洗います。</li>
		<li>CSK-Rバッファーを加え、RTで5分間インキュベートして細胞質を除去します[CSK-Rバッファー:10 mM PIPES、pH 7.0、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl2、0.5%トリトンX-100、300 μg/mL RNase A]。バッファーを吸引し、新鮮なCSK-Rを添加し、RTで5分間インキュベートします。 注:CSKバッファーのストックは4°Cで保存でき、使用直前にトリトンXとRNaseAを添加します。</li>
		<li>PBSで3回洗ってください。</li>
		<li>細胞をPBS中の4%ホルムアルデヒドでRTで10分間固定します。</li>
		<li>細胞をPBSで洗浄します。この手順を 3 回実行します。</li>
		<li>冷した100%メタノールを加え、-20°Cで20分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞をPBSで3回洗浄します。この時点で、細胞は4°Cの湿潤チャンバー内のPBSに最大1週間保存できます。</li>
		<li>細胞を80 μLの5 mM TritonX-100中で4°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>100 μLの5 mM EDTAを添加したPBS中で、1 μLの100 mg/mL RNase Aを添加した細胞を37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞をPBSで3回洗浄します。</li>
		<li>細胞をブロッキングバッファー(PBS中の5%BSAおよび10%ヤギ血清)の湿潤チャンバー内、4°Cで一晩保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.近接ライゲーションアッセイ
注:3日目に近接ライゲーションアッセイを実行します。
<ol><li>抗体染色<ol><li>プレートあたり40 μLの一次抗体溶液を調製:目的の希釈を達成するために適切な量の一次抗体(マウス抗ジゴキシゲニンおよびMCM5、CDC45、PSF1またはpMCM2などのレプリソーム成分に対するウサギ抗体、 材料の表で指定された希釈液)をブロッキングバッファーに追加します(最終容量24 μLに達するため)。軽くたたいて混ぜ、RTで20分間放置します。 複数のサンプルのマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前に軽くたたいて混ぜます。</li>
		<li>ウェルの中央に40 μLの一次抗体溶液を加え、湿潤チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。 染色中は、PLAプローブとブロッキングバッファーを室温まで温めます。</li>
		<li>RTでPBS-T[PBS-T:0.05%トゥイーン-20 in 1X PBS]で細胞を洗浄します。 この手順を3回実行します。</li>
		<li>洗浄しながら、ディッシュあたり40 μLのPLAプローブ溶液を調製します(PLAプローブは、ウサギまたはマウスIgGを認識する二次抗体で構成され、PLUSまたはMINSオリゴヌクレオチドに共有結合しています):8 μLのPLAプローブ抗マウスPLUS+ 8 μLのPLAプローブ抗ウサギ-マイナス抗体+ 24 μLのブロッキングバッファー。混合し、RTで20分間放置します。 複数のサンプル用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混合します。プレート内のウェルの中央に溶液を置きます。</li>
		<li>最後の洗浄液を取り出し、40 μLのPLAプローブ溶液をウェルの中央に加え、湿潤チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。</li>
		<li>バッファーAで、RTの傾斜プラットフォームでそれぞれ10分間、3回洗浄します。洗浄中に、ライゲーションミックスをRTに持ち込みます。</li>
	</ol></li>
	<li>ライゲーションと増幅<ol><li>プレートあたり40 μLのライゲーションミックスを準備します:8 μL(5x)のライゲーションストック+ 31 μLの蒸留水+ 1 μLのリガーゼ。複数のプレート用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混ぜます。</li>
		<li>各プレートに40 μLのライゲーション溶液を加え、湿潤チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞をバッファーAで3回、それぞれ2分間、RTの傾斜プラットフォームで洗浄します。</li>
		<li>ディッシュあたり40 μLの増幅溶液を調製します:8 μL(5x)の増幅ストック+ 31.5 μLの蒸留水+ 0.5 μLのDNAポリメラーゼ。複数のサンプル用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混合します。</li>
		<li>各プレートに40 μLの増幅溶液を加え、37°Cの湿潤チャンバーで100分間インキュベートします。</li>
		<li>増幅溶液を吸引し、バッファーBで洗浄します。 RTの傾斜プラットフォームで、それぞれ6回の洗浄を10分間実行します。</li>
		<li>0.01倍バッファーBでRTで1分間1回洗浄します。</li>
		<li>バッファーBを吸引し、二次抗体であるAlexa Fluor 488抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 568抗ウサギIgGを含むプレートをブロッキング溶液中で、ブロッキングバッファー中の適切な希釈率で、湿潤チャンバー内で、37°Cで30分間、または4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>細胞をPBS-Tで3回、RTの傾斜プラットフォームでそれぞれ10分間洗浄します。</li>
		<li>PBS-Tを吸引し、DAPIで封入剤にマウントします。取り付けたプレートは、すぐにイメージングすることも、イメージング前に4°Cで暗所で4日以内保存することもできます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. イメージングと定量
<ol><li>エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でイメージングを実行します(3Dイメージングが望ましい場合は、15スタックで少なくとも3 μmをカバーします)。3連で実験を実行し、サンプルまたは条件ごとに少なくとも100個の観測を行うのに十分な数のフィールドを画像化します。コントロールを含むすべてのフィールドとサンプルを、同じ露出設定で画像化します。</li>
	<li>適切な画像解析ソフトウェアを使用して定量化します(単一または複数の平面画像でこの解析を実行できるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては、 部品表 を参照してください)。<ol><li>DAPI染色に基づいて細胞核をセグメント化します。核PLAドットの検出を実行します。PLAドットを対応する核に割り当てます。核ごとのPLAドットをcsvファイルとしてエクスポートします(補足ファイル1および補足ファイル2を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>統計分析(推奨されるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては 、資料表 を参照してください)。<ol><li>サンプルが正規分布に従うかどうかをシャピロ-ウィルク検定で確認します。</li>
		<li>Student-t検定(正規分布の仮定が満たされた場合)またはWilcoxon-Rank Sum検定(サンプルの正規分布の仮定に違反している場合)を使用して、2つのサンプル間に有意差があるかどうかを判断します。</li>
	</ol></li>
	<li>データの視覚化:箱ひげ図と組み合わせてドットプロットを生成し、さまざまなサンプルのデータ分布、中央値(Q2)、25パーセンタイル(Q1)、および75パーセンタイルを視覚化します(推奨されるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては、資料の表を参照してください)。</li>
</ol>4.3D pMCM2の表示:ICL相互作用
<ol><li>PLAプレートをスピニングディスク共焦点顕微鏡で、プラン蛍光60倍/1.25開口オイル対物レンズを使用して画像化します。1.6 mmをカバーする16のスタックを取得し、適切な画像解析ソフトウェアを使用して3D再構成を生成します( 材料表を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li>
<li>Wright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+reagents+and+protocols+for+engineering+zinc+finger+nucleases+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+fidelity+of+the+repair+of+Cas9-induced+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks.</a> Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).</li>
<li>Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+An+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24(2020).</li>
<li>Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+method+provides+direct+evidence+of+persistent+DNA+damage+in+senescent+cells+and+aged+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues.</a> Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).</li>
<li>Vitelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advancements+in+DNA+damage-transcription+crosstalk+and+high-resolution+mapping+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).</li>
<li>Canela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breaks+and+end+resection+measured+genome-wide+by+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing.</a> Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).</li>
<li>Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslink+repair+in+mammalian+cells%3A+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).</li>
<li>Nejad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrand+DNA+cross-links+derived+from+reaction+of+a+2-aminopurine+residue+with+an+abasic+site%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).</li>
<li>Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanconi+anaemia+and+the+repair+of+Watson+and+Crick+DNA+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks.</a> Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).</li>
<li>Kaushal, S., Freudenreich, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fork+stalling+and+DNA+structures+in+causing+chromosome+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).</li>
<li>Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+interstrand+cross-link+repair+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).</li>
<li>Klein, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPF-ERCC1+acts+in+Unhooking+DNA+interstrand+crosslinks+in+cooperation+with+FANCD2+and+FANCP%2FSLX4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4.</a> Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).</li>
<li>Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+RAD51-dependent+DNA+interstrand+cross-link+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair.</a> Science. 333 (6038), 84-87 (2011).</li>
<li>Benedetto, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psoralens.+An+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">The psoralens. An historical perspective.</a> Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>O'Donnell, M. E., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ring-shaped+hexameric+helicases+that+function+at+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).</li>
<li>Koos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+interactions+in+situ+by+proximity+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+Interstrand+Crosslink+Proximal+Replisomes+Is+Dependent+on+ATR%2C+FANCM%2C+and+FANCD2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2.</a> Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+analysis+of+laser+localized+psoralen+adducts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55541(2017).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+ATR%3A+ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minichromosome+maintenance+proteins+are+direct+targets+of+the+ATM+and+ATR+checkpoint+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).</li>
<li>Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+classification+of+cell+cycle+phases+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted%22%5BJournal%5D)">Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging.</a> Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NPAT%2C+a+novel+substrate+of+cyclin+E-CDK2%2C+promotes+S-phase+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry.</a> Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

人民解放軍は非常に強力な技術ですが、明確で再現性のある結果を得るために解決しなければならない技術的な懸念があります。抗体は高い親和性と特異性でなければなりません。さらに、非特異的なバックグラウンド信号をできるだけ減らすことが重要です。膜や細胞の破片が背景に寄与していることを発見し、可能な限り除去しました。固定前のバッファーを含む洗剤による洗浄、および固定後のメタノールによる洗浄は、非特異的結合を減らすのに役立ちます。注意点は、固定前の洗剤処理は細胞剥離を引き起こす可能性があることです。CSK処理の前にプレートを細胞接着剤で処理し、0.1%FAを接頭辞にすることで、この問題が軽減されることがわかりました。
また、S期固有の事象をモニターする際に、非S期セルを識別することも有用です。これは、PCNAやNPAT24,25などの細胞周期マーカーによるPLA後染色によって行うことができます。これらのマーカーは、S期の現象を確認するだけでなく、非特異的相互作用の内部生物学的制御...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>.
The Authors section was updated from:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally
to:
Jing Zhang*1 
Jing Huang*2 
Ishani Majumdar1 
Ryan C. James3 
Julia Gichimu1 
Manikandan Paramasivam4 
Durga Pokharel5 
Himabindu Gali6 
Marina A. Bellani1 
Michael M Seidman1 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health 
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University 
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen 
5Horizon Discovery 
6Boston University School of Medicine 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/6517">Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

二本鎖切断に対する細胞応答は、切断を特定のゲノム部位に向けるための一連のますます強力な方法のために十分に文書化されています1,2,3。位置の確実性により、部位に蓄積してDNA損傷応答(DDR)に関与するタンパク質やその他の要因の明確な特性評価が可能になり、それによって切断を修復する非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)経路が促進されます。もちろん、特定の配列を攻撃しない放射線や化学種などの薬剤によって多くのブレークが導入されます4。ただし、これらのために、端をタグ付けとローカリゼーションに適した構造に変換できる手順があります5,6。ブレークは、免疫グロブリンの再配列などの生物学的プロセスによっても導入され、最近の技術では、それらの局在化も可能になっています7。次に、応答因子とそれらのサイトとの関係を決定できます。
ブレークは、固有のブレーカーではないが転写や複製などのDNAトランザクションを妨害する化合物によって形成される付加物の間接的な結果としても現れます。それらは、おそらく修復中に、またはヌクレアーゼ攻撃に対して脆弱な構造を誘発するために、これらの障害物に対する細胞応答の特徴として形成され得る。通常、付加体、ブレーク、および応答因子との関連の間の物理的関係は推論的です。例えば、ICLは、シスプラチンおよびマイトマイシンC8などの化学療法剤によって、および非塩基性部位9の反応生成物として形成される。ICLは、複製フォーク10に対する強力なブロックとしてよく知られており、それによってヌクレアーゼ11によって切断され得るフォークを失速させる。鎖間の共有結合は、中間体12,13として絶対的な切断を有する経路によってしばしば緩和され、複製フォーク14を再構築するために相同組換えを必要とする。ほとんどの実験では、研究者は、レプリケーションフォークとICLの衝突の下流に形成されるブレークに対する関心のある要因の応答を追跡します。しかし、誘発性病変の局在化のための技術がなかったため、リプリソームとその構成部分がICLに近接していることしか想定できません。
私たちは、ICLによってここに示されているように、非配列特異的共有付加体とのタンパク質関連の分析を可能にする戦略を開発しました。私たちのシステムでは、これらは皮膚疾患の治療薬として何千年もの間使用されている光活性天然物であるソラレンによって導入されます15。私たちのアプローチは、ソラレンの2つの重要な特徴に基づいています。1つ目は、シスプラチンやマイトマイシンC 8,16などの一般的な化合物によって形成される10%未満とは対照的に、付加物の90%を超える可能性のある架橋形成の頻度が高いことです。2つ目は、架橋能力を失うことなく、化合物のコンジュゲート化へのアクセシビリティです。私たちは、トリメチルソラレンを、古くから確立された免疫タグであるジゴキシゲニン(Dig)と共有結合させました。これにより、Digタグの免疫染色によるゲノムDNA中のソラレン付加体の検出、および従来の免疫蛍光法による可視化が可能になります17。
この試薬は、以前の研究で、DNAファイバーベースのアッセイ16を使用して、ICLとの複製フォークの遭遇の分析に適用されました。その作業では、レプリケーションが無傷のICLを過ぎても継続できることがわかりました。これは、複製ストレスによって活性化されるATRキナーゼに依存していた。複製の再開は、CMG複製ヘリカーゼの構造を考えると予想外でした。これは、GINS複合体(G、PSF1、2、3、およびSLD5からなる)およびCDC45(C)18のタンパク質によってロックされた、リーディングストランド合成のためのテンプレート鎖の周りにオフセットギャップリングを形成するMCMヘテロ六量体(M)で構成されています。複製がリプリソーム衝突の側のICL遠位側で再開できるという提案は、レプリソームの構造の変更を主張した。ICLとの遭遇時にどのコンポーネントが応答に含まれていたかという問題に対処するために、ここで説明するアプローチを開発しました。近接ライゲーションアッセイ(PLA)19 のパートナーとしてDigタグを利用して、ICLとレプリソーム20のタンパク質との密接な関連を調べました。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568、ヤギ抗ウサギIgG(H + L)交差吸着二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-10011</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>35 mmプレート、ガラス付き1.5カバースリップ</td><td>MatTek</td><td>P35-1.5-14-C</td><td>ガラス底マイクロウェルディッシュ35mmペトリ皿マイクロウェル</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488、ヤギ抗マウスIgG(H + L)交差吸着二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-10001</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>SeraCare</td><td>1900-0012</td><td>ブロッキング溶液、試薬は4°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>CDC45抗体(ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab126762</td><td>1 in 200</td></tr>細胞<tr><td>接着剤</td><td>ライフサイエンス</td><td>354240</td>細胞<td>TAK溶液</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td>ニッ<td>コン</td><td>ニコンTE2000回転ディスク顕微鏡</td><td>Volocityソフトウェア</td></tr><tr><td>ジゴキシゲニン(Dig)抗体(マウス)</td><td>Abcam</td><td>ab420</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Dig-TMP</td><td>で合成Seidman Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duolink増幅試薬(5回;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82010</td><td>試薬は-20°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>Duolink in situ検出試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92007</td><td>試薬は-20°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>Duolink in situ オリゴヌクレオチド PLA プローブ MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>抗マウス MINUS、試薬は 4 °C で保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>Duolink in situ オリゴヌクレオチド PLA プローブ PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>抗ウサギ PLUS、試薬は 4 °C で保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>Duolink in situ 洗浄バッファー A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink 洗浄バッファー、試薬は 4 °C で保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>Duolink in situ洗浄バッファー B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink洗浄バッファー、試薬は4°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>エピ蛍光顕微鏡</td><td>ツァイ</td>ス <td>アクシオーバート 200M顕微鏡</td><td>アクシオビジョンソフトウェアパッケージを装備(ツァイス、ドイツ)</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 16%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI28906</td><td>固定溶液</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>サーモ</td><td>31873</td><td>ブロッキング溶液、試薬は4°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>オープンソース</td><td>セルプロファイラー</td><td>は、単一平面画像の解析に対応</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェアのライセンスが必要</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td>Cell Biology モジュールが必要です。画像スタック内のPLAドット/核を定量化(3D)し、3D再構成を行うことができます</td></tr><tr><td>Ligase (1 unit/&mu;l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>試薬は-20°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>ライゲーション試薬 (5回;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>試薬は-20°Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>MCM2 抗体 (ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab4461</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>MCM5 抗体 (ウサギモノクローナル)</td><td>Abcam</td><td>Ab75975</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Lab ALLEY</td><td>A2076</td><td>pre-cold at -20°C;C 使用前の</td></tr><tr><td>リン酸化MCM2S108 抗体 (ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab109271</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>ポリメラーゼ (10 unit/&mu;l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>試薬は-20°Cで保存する必要があります。DAPI</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSF1 抗体 (ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab181112</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>RNAse A 100 mg/ml</td><td>Qiagen</td><td>19101</td> 試薬を含む C Prolong 金封入剤<td>は、4 °Cで保存する必要があります。C</td></tr><tr><td>統計解析・データ可視化ソフト</td><td>オープン・ソース</td><td>R studio</td><td>ggplot2 ドットプロット・ボックスプロット生成パッケージ</td></tr><tr><td>統計解析・データ可視化ソフトウェア-ライセンスが必要</td><td>Systat ソフトウェア</td><td>Sigmaplot V13</td><td></td></tr><tr><td>TMP (トリオキサレン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137_1G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787_250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416_100ML</td><td></td></tr><tr><td>UV box</td><td>Southern New England Ultraviolet</td><td></td><td>販売終了。可能な交換用UVテストチャンバーとしてOpsytec UVテストチャンバーを参照してください</td></tr><tr>UV<td>テストチャンバー</td><td>Opsytec</td><td>UVテストチャンバー BS-04</td><td></td></tr><tr><td>VE-821</td><td>Selleckchem</td><td>S8007</td><td>最終濃度は1&microです。メートル</td></tr></tbody></table>

抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

ヌクレアーゼ、放射線、およびその他のDNAブレーカーによって誘発される二本鎖切断(DSB)に対する細胞応答については、かなりの洞察が存在します。部分的には、これは、ブレークサイトを特定するための方法の利用可能性、およびそれらのシーケンスでDSBに採用された要因の特性評価を反映しています。ただし、DSBは、切断を直接引き起こさず、特定の配列部位で反応しない化合物によって形成されるDNA付加体の処理中に中間体としても現れます。したがって、これらの薬剤のほとんどについて、応答因子および修復タンパク質との結合相互作用の解析を可能にする技術は不明である。たとえば、DNA鎖間架橋(ICL)は、複製フォークに遭遇した後に切断を引き起こす可能性があります。がん化学療法薬として広く使用されている薬剤によって形成されていますが、複製タンパク質との相互作用をモニタリングするための方法論はありませんでした。
ここでは、これらの困難な付加体とのフォーク衝突に対する細胞応答を追跡するための戦略について説明します。我々は、ステロイド抗原を、生細胞の核内で光活性化依存性ICLを形成するソラレンに結合させた。ICLは、抗原タグに対する免疫蛍光によって視覚化されました。タグは、2つの抗原の密接な関連を報告する近接ライゲーションアッセイ(PLA)のパートナーにすることもできます。PLAは、タグ付けされたICLと密接に関連しているタンパク質とそうでないタンパク質を区別するために利用されました。ICLとの遭遇後に保持されたレプリソームタンパク質を定義し、失われた他のタンパク質を特定することができました。このアプローチは、免疫学的に検出できるあらゆる構造またはDNA付加体に適用できます。

レプリソームタンパク質を用いたDig-TMPのPLA Dig-TMPの構造を図1に示します。トリメチルソラレンをグリコールリンカーを介してジゴキシゲニンに結合させた合成の詳細は、以前に議論されている17,21。細胞を化合物と一緒にインキュベートした後、365 nm光(UVA)に曝露すると、化合物が光活性化され、架橋反応が促進されます。付加物の90%強がICLです16。Digタグは、核全体にICLが存在することを示す免疫蛍光法によって視覚化できます(図2)。MCM2などのレプリソームタンパク質の免疫蛍光も、ICLの導入の影響を受けない分布である核全体の分布を示しています。これらの結果は、DSBに対するDNA損傷応答(DDR)に見られるような応答タンパク質の焦点の出現は、レプリソームの特徴ではないことを示しました:ICL...

DNA付加体との複製フォーク衝突は二本鎖切断を誘発する可能性がありますが、レプリソームとブロッキング病変の間の相互作用についてはあまり知られていません。近接ライゲーションアッセイを使用して、これらの遭遇を視覚化し、レプリソーム組成の結果を特徴付けました。

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

この技術は、レプリソーム抗原タグ付きDNA付加体との遭遇の視覚化を容易にし、免疫検出に適したDNA構造または病変を持つ任意のタンパク質との相互作用に拡張することができます。この方法は、集団全体ではなく個々の細胞内の相互作用頻度を評価するために使用でき、細胞に損傷を与えることなく、細胞周期依存的な相互作用をその場で視覚化することができます。手順を実演するのは、サイドマン研究所のポスドクであるイシャニ・マジュムダールです。実験の前日に、細胞接着溶液で前処理した35ミリリットルのガラス底培養皿に2ミリリットルの培地で10〜5番目の細胞を1.5倍播種した。翌日、各皿の上清を摂氏37度の5マイクロモルDig TMP添加培地で50〜70%コンフルエントな細胞培養液に交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間戻して、Dig TMPを平衡化させます。細胞がインキュベートしている間に、UVボックスを摂氏37度に予熱します。平衡化の最後に、プレートを予め温めた箱に移し、細胞を5分間の3ジュール/平方センチメートルのUVA光線量にさらし、上清を2ミリリットルの新鮮な予熱した培養培地と交換してから、プレートを細胞培養インキュベーターに1時間戻します。インキュベーションの最後に、培養物をPBSで穏やかに洗浄し、室温で5分間PBS中の1ミリリットルの0.1%ホルムアルデヒドで細胞を固定する。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで1回洗浄してから、RNaseを添加した80マイクロリットルの細胞骨格抽出バッファーで細胞を2回処理し、処理ごとに室温で5分間処理して細胞質を除去します。2回目のインキュベーション後、細胞を2ミリリットルのPBSで3回洗浄してから、細胞を1ミリリットルの4%ホルムアルデヒドでPBSに室温で10分間固定します。2回目の固定後、実証したように細胞をPBSで3回洗浄し、続いて1ミリリットルの冷たい100%メタノールでマイナス20°Cで20分間処理します。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、続いて摂氏4度で80マイクロリットルの5ミリモルTriton X-100中で10分間インキュベーションする。インキュベーションの最後に、細胞をPBS中の100マイクロリットルの5ミリモルEDTAで処理し、1ミリリットルあたり100ミリグラムのRNase Aを摂氏37度で30分間補給します。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで3回洗浄してから、摂氏4度の湿潤チャンバーでPBSの5%ウシ血清アルブミンと10%ロバ血清に保存します。近接ライゲーションアッセイを実行するには、目的の一次抗体溶液を40マイクロリットルずつプレートの中央に加え、湿潤チャンバー内でプレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞培養インキュベーター内で1時間のインキュベーションのために、40マイクロリットルの新たに調製したPLAプローブ溶液を各皿に加える前に、2ミリリットルのPBSTで細胞を3回洗浄します。インキュベーションの終わりに、室温の傾斜プラットフォーム上で2ミリリットルのバッファーA中で3回の10分間洗浄で細胞を洗浄する。最後の洗浄後、40マイクロリットルの新たに調製したライゲーションミックスを各プレートに加え、摂氏37度で30分間インキュベートした後、傾斜プラットフォーム上のバッファーAで2分間の洗浄を3回行います。最後の洗浄後、40マイクロリットルの新たに調製した増幅溶液を各プレートに加え、湿潤チャンバー内で摂氏37度で100分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、傾斜プラットフォームでの洗浄ごとに10分間、新鮮なバッファーBで細胞を6回洗浄します。最後のバッファーB洗浄後、細胞を0.01倍バッファーBで室温で1分間1回洗浄した後、適切な二次抗体で湿潤チャンバー内で摂氏37度で30分間標識します。インキュベーションの最後に、室温でPBSTの傾斜プラットフォームで3回の10分間の洗浄でサンプルを洗浄してから、DAPIを添加した封入剤にサンプルをマウントします。取り付けから4日以内に、実験サンプルと対照サンプルの両方で同じ露光設定を使用して、落射蛍光顕微鏡またはコンディションセルごとに少なくとも100の観察結果を落射蛍光顕微鏡またはコンディションセルでイメージングします。Digタグは免疫蛍光によって視覚化され、核全体の鎖間架橋の存在を明らかにすることができます。レプリソームと鎖間架橋の相互作用を可視化するために、PLAを適用して、鎖間架橋導入から1時間後のMCM5とDigタグの会合頻度を可視化することができます。複製ストレスがATRキナーゼを活性化するので、pMCM2つのセリン108とDigタグの間のPLAも陽性である。個々の核からのPLAの結果は、核全体のレプリソーム鎖間架橋の遭遇を視覚化することを可能にする3次元再構成で提示することができます。レプリケーションフォーク分析は、GINS複合体のタンパク質が鎖間架橋でPLAシグナルを示さないため、鎖間架橋の遭遇が予期しない複製再開現象を示すことを示しています。対照的に、CD45を用いたアッセイは陽性であり、他のロッキングタンパク質が保持されていることを示す。細胞をATR阻害剤と一緒にインキュベートすると、再起動が完全に抑制され、GINS Dig PLAが強く陽性になります。CSK+R処理は、バックグラウンドシグナルを低減するために不可欠です。プレートをセル接着剤でコーティングし、0.1%FAを接頭辞に付けないと、セルがプレートから剥がれます。

visualization-replisome-encounters-with-an-antigen-tagged-blocking

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin...

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation...

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ...

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、...

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded...

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

学ぶレプリソームとDNA付加体の相互作用可視化法。近接結合アッセイを用いてヒト培養細胞で個別細胞内の相互作用頻度を評価し、細胞周期依存性の応答をin situで観察する技術を解説します。

抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

さらに動画を探す