抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

この技術は、レプリソーム抗原タグ付きDNA付加体との遭遇の視覚化を容易にし、免疫検出に適したDNA構造または病変を持つ任意のタンパク質との相互作用に拡張することができます。この方法は、集団全体ではなく個々の細胞内の相互作用頻度を評価するために使用でき、細胞に損傷を与えることなく、細胞周期依存的な相互作用をその場で視覚化することができます。手順を実演するのは、サイドマン研究所のポスドクであるイシャニ・マジュムダールです。

実験の前日に、細胞接着溶液で前処理した35ミリリットルのガラス底培養皿に2ミリリットルの培地で10〜5番目の細胞を1.5倍播種した。翌日、各皿の上清を摂氏37度の5マイクロモルDig TMP添加培地で50〜70%コンフルエントな細胞培養液に交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間戻して、Dig TMPを平衡化させます。細胞がインキュベートしている間に、UVボックスを摂氏37度に予熱します。

平衡化の最後に、プレートを予め温めた箱に移し、細胞を5分間の3ジュール/平方センチメートルのUVA光線量にさらし、上清を2ミリリットルの新鮮な予熱した培養培地と交換してから、プレートを細胞培養インキュベーターに1時間戻します。インキュベーションの最後に、培養物をPBSで穏やかに洗浄し、室温で5分間PBS中の1ミリリットルの0.1%ホルムアルデヒドで細胞を固定する。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで1回洗浄してから、RNaseを添加した80マイクロリットルの細胞骨格抽出バッファーで細胞を2回処理し、処理ごとに室温で5分間処理して細胞質を除去します。

2回目のインキュベーション後、細胞を2ミリリットルのPBSで3回洗浄してから、細胞を1ミリリットルの4%ホルムアルデヒドでPBSに室温で10分間固定します。2回目の固定後、実証したように細胞をPBSで3回洗浄し、続いて1ミリリットルの冷たい100%メタノールでマイナス20°Cで20分間処理します。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、続いて摂氏4度で80マイクロリットルの5ミリモルTriton X-100中で10分間インキュベーションする。

インキュベーションの最後に、細胞をPBS中の100マイクロリットルの5ミリモルEDTAで処理し、1ミリリットルあたり100ミリグラムのRNase Aを摂氏37度で30分間補給します。インキュベーションの最後に、細胞をPBSで3回洗浄してから、摂氏4度の湿潤チャンバーでPBSの5%ウシ血清アルブミンと10%ロバ血清に保存します。近接ライゲーションアッセイを実行するには、目的の一次抗体溶液を40マイクロリットルずつプレートの中央に加え、湿潤チャンバー内でプレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、細胞培養インキュベーター内で1時間のインキュベーションのために、40マイクロリットルの新たに調製したPLAプローブ溶液を各皿に加える前に、2ミリリットルのPBSTで細胞を3回洗浄します。インキュベーションの終わりに、室温の傾斜プラットフォーム上で2ミリリットルのバッファーA中で3回の10分間洗浄で細胞を洗浄する。最後の洗浄後、40マイクロリットルの新たに調製したライゲーションミックスを各プレートに加え、摂氏37度で30分間インキュベートした後、傾斜プラットフォーム上のバッファーAで2分間の洗浄を3回行います。

最後の洗浄後、40マイクロリットルの新たに調製した増幅溶液を各プレートに加え、湿潤チャンバー内で摂氏37度で100分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、傾斜プラットフォームでの洗浄ごとに10分間、新鮮なバッファーBで細胞を6回洗浄します。最後のバッファーB洗浄後、細胞を0.01倍バッファーBで室温で1分間1回洗浄した後、適切な二次抗体で湿潤チャンバー内で摂氏37度で30分間標識します。

インキュベーションの最後に、室温でPBSTの傾斜プラットフォームで3回の10分間の洗浄でサンプルを洗浄してから、DAPIを添加した封入剤にサンプルをマウントします。取り付けから4日以内に、実験サンプルと対照サンプルの両方で同じ露光設定を使用して、落射蛍光顕微鏡またはコンディションセルごとに少なくとも100の観察結果を落射蛍光顕微鏡またはコンディションセルでイメージングします。Digタグは免疫蛍光によって視覚化され、核全体の鎖間架橋の存在を明らかにすることができます。

レプリソームと鎖間架橋の相互作用を可視化するために、PLAを適用して、鎖間架橋導入から1時間後のMCM5とDigタグの会合頻度を可視化することができます。複製ストレスがATRキナーゼを活性化するので、pMCM2つのセリン108とDigタグの間のPLAも陽性である。個々の核からのPLAの結果は、核全体のレプリソーム鎖間架橋の遭遇を視覚化することを可能にする3次元再構成で提示することができます。

レプリケーションフォーク分析は、GINS複合体のタンパク質が鎖間架橋でPLAシグナルを示さないため、鎖間架橋の遭遇が予期しない複製再開現象を示すことを示しています。対照的に、CD45を用いたアッセイは陽性であり、他のロッキングタンパク質が保持されていることを示す。細胞をATR阻害剤と一緒にインキュベートすると、再起動が完全に抑制され、GINS Dig PLAが強く陽性になります。

CSK+R処理は、バックグラウンドシグナルを低減するために不可欠です。プレートをセル接着剤でコーティングし、0.1%FAを接頭辞に付けないと、セルがプレートから剥がれます。