アデノウイルス産生のための効率的な方法
2021年6月10日
ここでは、pAdEasyシステムを用いたアデノウイルス産生プロトコルを紹介する。この技術には、pAdTrackおよびpAdEasy-1プラスミドの組換え、アデノウイルスの包装および増幅、細胞リセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製、ウイルス滴定、およびアデノウイルスの機能試験が含まれる。
ルーマニアのブカレスト出身のニコラエ・シミオネスク細胞生物学・病理学研究所へようこそ。ここでは、ウイルス導入研究室で、Vogelstein教授が開発したAdEasyシステムに基づく最適化された方法論を用いて、アデノウイルス粒子産生の一部を示す。このアデノウイルスを産生する技術の主なステップは、1つは、BJ5183細菌中のpAdEasy-1プラスミドとGFPを含むpAdTrackの組換えである。
2つは、アデノウイルス粒子を包み込む。3つは、AD293細胞におけるアデノウイルスの増幅である。4つは、細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。
5、アデノウイルスのウイルス滴定および機能試験。ここでは、方法論の重要なステップを提示します。細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。
アデノウイルスの精製は、ウイルス産生細胞および培地の採取から始まる。AD293細胞を組換えプラスミドにトランスフェクトし、アデノウイルスをパッケージ化した。次いで、アデノウイルスを、連続した大きな培養によって増幅した。
ここで、25枚のT175プレートを得て、細胞ライセートと培養培地からアデノウイルスの精製を開始した。まず、トランスデューセ細胞で発現するGFPの緑色蛍光を確認した。細胞がまだ付着している場合は、培養皿をタップするか、長いスクレーパーを使用してそれらを取り外します。
細胞および培地が収集される。フラスコはPBSで洗浄され、ファルコンチューブにも採取されます。細胞は遠心分離によってペレット化される。
アデノウイルスをさらに精製するための培地と同様に、細胞ペレットを保管してください。このステップでは、同僚の助けは収穫プロセスを加速するために十分に高く評価される。GFPの発現により、細胞ペレットは緑色です。
ペレットは、細胞の破壊を促進する高トニックトリスバッファーに再懸濁されます。細胞のリシスには液体窒素を使用し、乾燥ガスは37度まで温めます。ウイルスが損傷を受けるため、3 サイクル以上実行しないでください。
細胞破壊の効率を高めるために、細胞を23ゲージの注射針を通して均質化する。細胞のリセートを9、600xgで12分間遠心分離する。新しいチューブに上清を渡し、ペレットを捨てます。
超遠心分離機によるさらなる処理のために氷の上に上清を保ちます。そこで、培養培地を処理して、細胞から放出されたアデノウイルスを単離する。このために、まず、必要量の硫酸アンモニウムを加え、培養液を回収したボトルに添加します。
ボトルは、結晶が完全に溶解するまで激しく揺れます。混合物を室温で2時間及び半分にインキュベートする。次いで沈殿物の懸濁液をファルコンチューブに分割する。
遠心分離機は1,600xgで15分間用いた。遠心分離後、上清は廃棄され、ペレットは10ミリモルトリスバッファーに再懸濁される。超遠心分離工程でアデノウイルスの精製を継続できない場合、沈殿物は、4度で数日間保持することができるが、硫酸アンモニウムを除去するために透析後にのみ維持することができる。
ここでは、透析のステップを発表しました。シリンジを使用して、以前に濡れたカセットに懸濁液を導入します。サンプルは、4度で一晩10ミリモルトリスバッファーに対して透析されます。
精製の最終ステップは、塩化セシウム不連続勾配上の超遠心分離工程で表される。勾配を形成するために、まず、塩化セシウムの高密度溶液の3ミリリットルをピペット化する。この層の上に、低密度塩化セシウムの3ミリリットルを静かに注ぎます。
細胞ライセートまたは培養培地からのアデノウイルス粒子懸濁液は、次いで、勾配の上に重ねられます。チューブはミネラルオイルで満たされ、SW41バケットに導入されています。平衡後、チューブは、超遠心分離機に導入されるローターに対称的にロードされます。
遠心分離機は35,000 RPM、4度を故障なく18時間実行します。超遠心分離後、チューブはバンドを収穫するために後ろに黒い紙を置いてスタンドに置かれます。透明な上相および細胞の破片は、漂白液と廃容器に捨てる。
完全なアデノウイルスを含む最も低いバンドはピペット先端で収穫され、生殖不能のエッペンドルフ管で集められる。透析後、スクロースはウイルス懸濁液に4%の最終濃度に添加され、ウイルスアリコートはマイナス80度で凍結し続ける。結果のセクションでは、得られたアデノウイルスを導入した細胞におけるGFP発現を示した。
導入から48時間後、GFPは蛍光顕微鏡で示されるようにトランスデューセされた細胞によって発現される。GFP発現細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定される。ヒトおよびウシの内皮細胞の約50%が、細胞当たり25の導入単位で導入され、GFP陽性である。
マウス肝細胞に対して同じ伝達収率が得られたのは、細胞当たり5つのトランスダクションユニットしか使用されなかったが、これは細胞感受性による死亡率の上昇と関連している。GFP発現に還元し、特定の受容体の発現が低いため間葉間質細胞の形質転換により得られた。結論的な発言。
これらの手間のかかる技術を最適化して、アデノウイルス粒子の取得に必要な時間、コスト、および労力を削減します。調製されたアデノウイルスは、様々な細胞型に感染し、目的の遺伝子の発現を誘導することができる。
概要
この記事では、pAdEasyシステムを使用してアデノウイルス粒子を生産するための詳細なプロトコルを紹介します。このプロセスには、組換え、パッケージング、増幅、アデノウイルスの精製、機能テストなどの重要なステップが含まれます。
主要な研究構成要素
科学分野
- ウイルス生物学
- 遺伝子治療
- 細胞生物学
背景
- アデノウイルスは、様々な細胞タイプに感染する能力があるため、遺伝子治療で広く使用されています。
- pAdEasyシステムは、アデノウイルス生産のための最適化された方法です。
- 精製プロセスの理解は、高品質のウイルス粒子を得るために重要です。
- GFPのような蛍光マーカーは、導入効率の追跡に役立ちます。
研究目的
- アデノウイルス生産プロトコルを最適化し、効率を向上させること。
- ウイルス導入の研究者のための包括的なガイドを提供すること。
- 生産されたアデノウイルスの遺伝子発現における有効性を示すこと。
使用方法
- 細菌細胞におけるプラスミドの組換え。
- AD293細胞におけるアデノウイルス粒子のパッケージングと増幅。
- 細胞溶解物と培養液からのアデノウイルス粒子の精製。
- GFP発現とフローサイトメトリーを通じた機能テスト。
主要な結果
- アデノウイルス粒子の成功的な精製が達成されました。
- 導入されたヒトとウシの内皮細胞の約50%がGFPを発現しました。
- 異なる細胞タイプ間で導入率は様々でした。
- 最適化により、アデノウイルス生産の時間と労力が削減されました。
結論
- 最適化されたプロトコルは、アデノウイルス粒子の生産に効果的です。
- 様々な細胞タイプでの効率的な遺伝子導入を可能にします。
- この方法論は、遺伝子治療の研究者にとって貴重なリソースとなり得ます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
