Name: In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぶ、超音波ガイド下の子宮内レンチウイルス注入を用いたin vivo CRISPR/Cas9スクリーニング法。マウスの皮膚と口腔における多数の遺伝子機能を同時に評価し、頭頸部がん研究の効率的なツールとして活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、カナダ保健研究所(CIHR 365252)、クレンビル財団、オンタリオ研究基金リサーチエクセレンスラウンド8(RE08-065)からのプロジェクト助成金によって支えられました。サンパス・クマール・ロガナタンは、カナダ癌学会フェローシップ(BC-F-16#31919)の受賞者です。

<ol><li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li>
<li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+squamous+cell+carcinoma%3A+an+epidemiological+review%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li>
<li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pathway+network%2C+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knockout+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.</a> Genome Biology. 15, 554(2014).</li>
<li>Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+and+multiplexed+in+vivo+functional+cancer+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics.</a> Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).</li>
<li>Rogers, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+in+vivo+fitness+landscape+of+lung+adenocarcinoma+tumor+suppression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice.</a> Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).</li>
<li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR%E2%80%93mediated+direct+in+vivo+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508(2018).</li>
<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、遺伝子機能や細胞プロセスを調べるインビトロおよびインビボ研究で広く使用されています。ほとんどの生体内研究では、動物モデル(同種移植片または異種移植片)に移植されたCRISPR/Cas9遺伝子編集細胞を利用しています。これは癌遺伝学と細胞機能を研究するための強力なツールですが、それはまだネイティブの組織微小環境を欠いているし、傷や免疫応答を引き出す可能性があります。
これらの課題を克服するために、いくつかのグループは、過去数年間で複数の多重化オートチソナスマウスモデルを生成する直接in vivo CRISPRアプローチを開拓しました15,16,17,18.これらのプロジェクトは、通常、標的臓器にsgRNAを送達するためにアデノ関連ウイルス(AAV)に依存しています。AAVは非常に高い用剤の生成を...

ゲノム後のがん研究における課題の1つは、因果遺伝子変異のゲノムデータを大量に取り出し、治療的に標的とできる遺伝子ネットワーク内のノードを特定することです。バイオインフォマティクス分析はこれらの目標に非常に役立っていますが、効率的なインビトロおよびインビボモデルを確立することは、生物学的システムと疾患状態の複雑さを解読し、医薬品開発を可能にするための前提条件です。従来のトランスジェニックマウスモデルは、生体内がん遺伝学の研究に広く使用されてきましたが、そのコスト、時間、労働集約的な性質は、現代のゲノミクスによって解明された何百もの推定癌遺伝子の体系的な分析をほとんど禁止してきました。このボトルネックを克服するために、以前に確立された超音波誘導性子宮注射方法論1,2をCRISPR/Cas9(クラスター化された定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復)遺伝子編集技術3と組み合わせて、単一マウスの皮膚および口腔内の何百もの遺伝子の機能喪失変異を同時に誘導および研究した。
ここで説明する方法論は、胚性の日E9.5で生きているマウス胚の羊膜腔に工学的レンチウイルスの超音波誘導注射を利用する。CRISPR/Cas9成分を含むレンチウイルス貨物は、単層表面外膜をトランスデューシングし、後に皮膚の上皮および口腔を生じさせる。皮膚は外側の表皮で構成され、続いて膜と真皮が続く。表皮は、基底膜との接触を維持し、増殖および幹細胞能力を有する内層、基底層から構成される階層化された上皮である。基底層は、上記の分化層(例えば、棘、粒状および角層2、4)を生み出す。系統トレース研究は、この直接in vivo CRISPR/Cas9法が成人期を通じて持続する基底層内の組織に居住する幹細胞を遺伝的に操作することを示している。レンチウイルスは、クローン密度でE9.5表面外膜をトランスデューシングするために滴定することができるので、この方法は、何千もの離散遺伝子ノックアウトクローンを収容するモザイクマウスを生成するために使用することができる。次世代シーケンシングを使用して、それらのクローン内のCRISPR/Cas9媒介遺伝子アブレーションの効果を多重化した方法で分析することができます5.
我々は最近、この方法を用いて、ヒト頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)5における再発性突然変異を示す484遺伝子の機能を評価した。HNSCCは40-50%の高い死亡率を持つ壊滅的な癌であり、それは6番目に世界で最も一般的な癌である6番目に一般的な癌である6 .HNSCCは、上部気道または口腔の粘膜内層で生じ、タバコおよびアルコール消費量またはヒトパピローマウイルス(HPV)感染に関連している。皮膚扁平上皮癌(SCC)は皮膚腫瘍であり、ヒトにおける2番目に多い癌である7。皮SCCとHNSCCは、組織学的および分子的に非常に類似しており、TP53、PIK3CA、NOTCH1、およびHRAS8において変化を示す症例の割合が高い。高頻度で変異する遺伝子はほんの一握りですが、低周波(<5%)で変異した遺伝子は何百種類もあります。長い尾の遺伝子の大半は生物学的または臨床的検証を欠いているため、この生体内CRISPRスクリーニング技術を使用して、p53、Pik3caまたはHrasの感作突然変異を有する腫瘍発生しやすいマウスにおけるこれらの遺伝子の機能喪失をモデル化し、p53、Pik3caまたはHrasと協力するいくつかの新しい腫瘍抑制遺伝子を同定して腫瘍開発を開始した。
ここでは、多重化sgRNAレンチウイルスCRISPR sgRNAライブラリを生成し、CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトスクリーンをマウス表面エクストダームで行う詳細なプロトコルについて説明する。なお、この方法論は、CRISPR活性化(CRISPRa)やCRISPR不活性化(CRISPRi)などの他の遺伝子操作技術を組み込むために適応することができ、または遺伝子機能を研究するためにマウスの他の器官系を標的にするように改変することができる。

<table><tbody><tr><td>0.45ミクロンフィルター</td><td>シグマ</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12kまたは92kオリゴチップ</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm細胞培養プレート</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>アンプリシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>クロミック腸縫合</td>糸 <td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディープシーケンシング (Next-Seq or Hi-Seq)</td><td>イルミナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAクリーンアップキット</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy 血液および組織 DNA抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Enduraエレクトロコンピテントセル</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細血管</td><td>ドラモンド</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>培地技術</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>ミニプレッププラスミドキット</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>マウス酸素麻酔システム</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II マイクロマニピュレーター</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 (BsmBI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>針削りサ</td><td>ッター器具</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>オリゴクリーンアップキット</td><td>Zymo研究</td><td>用D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE精製イルミナシーケンシングプライ</td><td>マーIDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI(ポリエチレンイミン)</td><td>シグマ</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>パーモプラストモデリングクレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>中央開口部のペトリディッシュ</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ポリメラーゼ 2x マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 蛍光定量</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>半円形 シリコンプラグ</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコーン膜</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>超遠心管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2000 超音波システム</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo crispr/cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、遺伝子機能の評価、ヒト疾患のモデル化、治療手段の評価のための前臨床モデルとしての役割を果たしてきました。しかし、時間、労力、コストを要する性質は、遺伝子機能の体系的な分析のための有用性を制限します。ゲノム編集技術の最近の進歩は、これらの限界を克服し、多重化された迅速な方法で特定のマウス器官内で直接特異的な遺伝子摂動の迅速な生成を可能にする。ここでは、CRISPR/Cas9ベースの方法(クラスター化された定期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復)を用いて、マウスの皮膚および口腔の上皮内に何千もの遺伝子ノックアウトクローンを生成し、腫瘍抑制遺伝子に対して直接in vivo CRISPRスクリーンを実行するために必要な手順を詳述するプロトコルを提供する   。このアプローチは、他の臓器またはCRISPR活性化やCRISPR不活性化などの他のCRISPR/Cas9技術に適用して、組織ホメオスタシス中または様々な疾患の設定における遺伝子の生物学的機能を研究することができます。

図1Aは 、1つの12kまたは92kオリゴチップで費用対効果の高い方法で複数のカスタムCRISPRライブラリを多重化するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す。sgRNA(青色の色がコード化された)を選択すると、オリゴヌクレオチドは制限部位(オレンジ色のBsmBI)およびライブラリ固有のPCRプライマーペア(緑色コード化)で設計されます。いくつかのライブラリは、単一のオリゴチップで多重化するためのプライマーペアのユニークな組み合わせを使用して設計することができます。PCRが特定のPCRプライマーペアを使用してライブラリを増幅する場合、常に水のみ陰性制御を含め、アガロースゲル上のすべての反応を実行します。負の制御レーンは100 bpでバンドを持つべきではありませんが、図書館増幅レーンは単一の100 bpバンドを持つべきです。バンドがない場合は、PCR プライマー ペアが適切に選択されていることを確認します。 図1B は、クローン化されたライブラリーの品質管理ステップおよびウイルス産生および濃度手順を示す。sgRNAの等しい...

ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo CRISPR/Cas9スクリーニング方法論を説明し、免疫担当マウスの皮膚および口腔内のいくつかの遺伝子の機能を同時に評価する。

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

このプロトコルは、研究者が従来のノックアウトマウスモデルの数分の一のコストで、頭頸部がんの数百の遺伝子の腫瘍抑制機能を同時に調査できるという点で重要です。この手法は柔軟性があり、遺伝子の発現をカバーするように適応させて、皮膚での遺伝子の機能を研究することができます。この標的CRISPRライブラリーのプロトコールは、他の種類のがんにも適用できます。麻酔をかけた動物の腹側を上にして加熱された手術ステージに置き、手術用テープを使用して前足を所定の位置に保持します。手術が完了するまで、イソフルランと酸素を一定に供給するためにノーズコーン麻酔チューブを適用します。E9.5の妊娠を確認するには、腹部に少量の脱毛クリームを塗布し、綿の先端のアプリケーターを使用して3×3センチ四方の領域に広げます。2〜3分後、ガーゼまたはティッシュでクリームをそっと取り除き、PBSと70%エタノールを使用してその部分をきれいに拭きます。超音波プローブとゲルを使用して、妊娠中のマウスの胚の日E9.5を確認します。これは、手術当日の時間を節約するために、前日のE8.5でも行うことができます。超音波ジェルを取り外し、BPSを使用してその部分をきれいに拭き、次に70%エタノールを使用して拭きます。皮下鎮痛剤を最も多く注入します。次に、鉗子とハサミを滅菌して、皮膚に垂直に切開します。鈍い鉗子を使用して、切開部の周りの皮膚を腹膜から分離します。次に、鉗子とハサミを滅菌して腹膜を切断します。鈍い鉗子を使用して、左右の子宮角をそっと引き出し、胚を数えます。子宮角の大部分を再挿入しますが、3つの胚を含む1つの子宮角の遠位端は露出したままにします。鈍い鉗子を使用して、改変されたペトリ皿のシリコーン膜の開口部を通して、3つの胚で子宮を静かに押したり引いたりします。モデリング粘土の立方体を使用してペトリ皿を安定させます。シリコン型を使用して、シャーレ内の3つの胚で子宮を安定させます。次に、鈍いツールを使用して胚の側面にあるシリコンプラグを平らにします。ペトリ皿に滅菌PBSを入れ、ペトリ皿の底にあるシリコーン膜を妊娠中の母の腹で洗い流し、漏れを防ぎます。超音波ヘッドを上部胚から約0.5センチメートル上のシャーレに移動し、羊水管が超音波ビューではっきりと見えるようにステージを調整します。インジェクターニードルを、変更されたペトリ皿に慎重に合わせます。マイクロマニピュレータを使用して、針の先端を上部胚から5ミリメートル以内に配置し、針を前後に切り替えて、超音波画像で先端が最も明るく見える平面に移動します。マイクロマニピュレーターを使用して、針を子宮壁を通して羊水腔に押し込みます。62ナノリットルのレンチウイルスをsgRNAライブラリーにゆっくりと注入します。Injectボタンを8回押すと、胚あたり合計496ナノリットルになります。他の2つの胚についても同じ手順を繰り返します。次に、超音波ヘッドを持ち上げて、シリコンプラグを取り外します。滅菌綿棒を使用して、3つの胚のうち最初の2つをマウスの腹部にそっと押し込みました。次の3つの胚を引き出し、前に注入した3番目の胚を押し込みます。必要な数の胚が注入されるまで、麻酔が30分を超えないようにして、注入手順を繰り返します。終了したら、超音波ヘッドを持ち上げ、マイクロマニピュレーターを針で取り外し、PBSを吸引してペトリ皿を取り外します。滅菌ワイプを使用して、腹腔内に蓄積した可能性のあるPBSを吸収します。吸収性縫合糸を使用して腹膜切開を閉じます。次に、2つのステープルを使用して腹部の皮膚の切開を閉じます。次に、プラスミドおよびレンチウイルスライブラリー形質導入細胞からのPCR増幅DNAの世代シーケンシングリードは、高い相関を示すはずです。プラスミドDNAから読み取られたsgRNAがsgRNAと同等に発現しない場合は、ウイルスの調製と濃縮手順を慎重に繰り返す必要があります。出生後P0のE9.5 Lox-STOP-Lox紙吹雪マウスの子犬にCreリコンビナーゼを運ぶレンチウイルスの超音波ガイド下注射の結果を以下に示します。ウイルスの力価が高いと、マウスの皮膚の被覆率が大きくなりますが、同じ細胞に複数のsgRNAが形質導入される結果にもなります。このプロットは、プラスミドおよびレンチウイルスライブラリー形質導入細胞からのPCR増幅DNAの次世代シーケンシングリードと、4つの代表的な腫瘍からのリードを示しています。腫瘍抑制因子ADAM10およびRIPK4を標的とするsgRNAガイドは、プラスミドプールや感染細胞と比較して、腫瘍サンプルに豊富に含まれています。E9.5で手術を行うことは非常に重要です。十字架を設定してから9日後に超音波で妊娠を確認し、各雌マウスの胚の時点を特定することを忘れないでください。仔犬が生まれたら、形質導入された細胞を単離し、シングルセルRNAシーケンシングなどの最新の遺伝子プロファイリング技術を使用して広範囲にプロファイリングすることができます。

in-vivo-crisprcas9-screening-to-simultaneously-evaluate-gene-function

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、CRISPR-Cas9を使用してゲノムを改変したトランスジェニックショウジョウバエを特定するためのスクリーニング方法を説明しています。CRISPR-Cas9は、科学者が生物のゲノムを操作する方法に革命をもたらした強力なゲノム編集ツールです。このプロトコル例では、トランス活性化配列の挿入によりブランチレス(bnl)遺伝子の最初のエクソンが置き換えられ、bnl遺伝子特異的なドライバーラインであるbnl-LexAが作られる、CRISPRで生成された変異体を同定する方法を見ていきます。...

ゲノム修飾のスクリーニング:ショウジョウバエのCRISPR生成変異体を同定する方法

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

ノックアウト動物を用いた遺伝子の機能喪失従来は、高価で時間のかかる多くの場合されています。CRISPR 媒介体細胞突然変異誘発のエレクトロポレーション ベースは遺伝子の生体内の機能を理解するための強力なツールです。小脳の細胞増殖にノックアウトの表現型を解析する手法を報告する.

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。...

放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo...

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

学ぶ、超音波ガイド下の子宮内レンチウイルス注入を用いたin vivo CRISPR/Cas9スクリーニング法。マウスの皮膚と口腔における多数の遺伝子機能を同時に評価し、頭頸部がん研究の効率的なツールとして活用できます。

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

さらに動画を探す