Name: マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶ マウス上端体脂肪組織から脂肪前駆細胞をFACSで調製する方法。高生存率・高純度の細胞を単一細胞RNAシーケンスなどの感度の高い下流解析に利用できます。

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我々は、FACS選別の支援のためのメイヨークリニック顕微鏡細胞分析コアフローサイトメトリー施設を認める。

すべての動物実験手順は、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。
1. ソリューションの準備 
<ol><li>コラゲナーゼII 2 gを100 mLハンクスバランス塩溶液(HBSS)に溶解して2%(w/v)溶液を調製します。アリコート 200 μL 各用途に適しています。</li>
	<li>84 mL F-12培地、15 mL馬血清、および1 mLペニシリン/ストレプトマイシンを混合して中和培地を調製します。</li>
	<li>500 mgのウシ血清アルブミン(BSA)と400 μLの0.5 M EDTAをダルベックコのリン酸緩衝生理食塩基(DPBS)の100 mLに溶解してフローサイトメトリーバッファーを調製します。</li>
</ol>2. 上端体脂肪パッドの解離と組織解離
<ol><li>人道的に安楽死させる(イオブルラン/子宮頸部脱臼)1つの雄マウス。このプロトコルでは、4か月のFVBマウスが使用されました。</li>
	<li>腹部に70%エタノールを塗布/スプレーし、きれいなはさみと鉗子を使用して下腹腔を露出させます。</li>
	<li>精巣上体脂肪パッド(近位/精巣に付着)を見つける。精巣と上体脂肪パッドの間の接合部を鈍い鉗子で保持し、優しく引っ張って上体脂肪パッドを解放する。</li>
	<li>5 mL の HBSS ではさみと精巣上体脂肪パッドを使用して切断して精巣を取り除き、50 mL の円錐管で 15 分間の温度で BSA を補います。</li>
	<li>遠心分離機 150 x g で 4 °C で 7 分間</li>
	<li>50 mL円錐管から浮遊精液脂肪パッドを取り、きれいなはさみを使用して組織を細かくミンチ。</li>
	<li>200 μL コラゲナーゼ 2% 溶液を 13 mL の培養チューブで 3.8 mL の HBSS に加えます。ひき肉を加え、37°Cで1時間5rpmで回転インキュベーターにインキュベートします。 回転インキュベーターの代わりに、37°Cでの細胞培養インキュベーターを、時折攪拌して使用することができる。</li>
	<li>内容物全体を50 mL円錐形チューブに移し、10mLの中和媒体を加えます。チューブを2~3回反転して軽く混ぜます。</li>
	<li>70 μmのセルストレーナーを取り付けた別の 50 mL 円錐形チューブを準備します。細胞のストレーナーを使用して、消化された組織を新しいチューブにフィルターします。</li>
	<li>フロースルーを15mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を350 x g で4°Cで10分間移動します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、5 mLのDPBSで細胞ペレットを再懸濁します。遠心分離機 350 x g で 4 °C で 10 分間</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、50 μLのフローサイトメトリーバッファーを追加します。穏やかにピペットでよく混ぜ、氷の上に細胞を保ちます。細胞ペレットの体積と残留上清の量が少ないため、フローサイトメトリーバッファー内の細胞の総体積は50μL(約100 μL)を超えます。</li>
</ol>抗体標識と蛍光活性化細胞分類(FACS)
<ol><li>穏やかなピペットで細胞をよく混合した後、細胞懸濁液の54 μLを1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。6 μLのFcRブロッキング試薬を加え、軽くピペットでよく混ぜます。4°Cで10分間インキュベートします。54 μLを取った後に残った細胞を保存し、ステップ3.5およびステップ3.6で未染色コントロールとして使用するために氷の中に保管します。</li>
	<li>ステップ3.1のインキュベーション中に、抗Sca1-APC、抗テル119-FITC、抗CD31-FITC、抗CD45-FITC抗体をマイクロ遠心チューブに組み合わせて抗体カクテルを調製します。穏やかなピペットでよく混ぜ、光から保護された氷の上に保ちます。</li>
	<li>FcRブロッキング試薬を10分間インキュベートした後、40 μLの抗体カクテルを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。4°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>染色された細胞に、1 μg/mL の DAPI を加えたフローサイトメトリーバッファーを 500 μL 加えます。セルストレーナースナップキャップを用いた5mL試験管を使用して、穏やかなピペットとフィルターセルでよく混ぜます。細胞を氷の上に置いておきなさい。</li>
	<li>ステップ3.1の残りの細胞に500μLのフローサイトメトリーバッファーを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。5 mL の試験管を使用して、セルストレーナー スナップ キャップを使用してセルをフィルター処理します。これらの細胞を氷の上に保管し、次の手順で未染色のコントロールとして使用します。</li>
	<li>FACS分析または選別器具に染色された細胞と未染色の制御を取ります。<ol>
<li>図 1に示すギャティング戦略を使用して、APC+/FITC-/DAPI-母集団を特定し、分離します。これらの細胞は、生存可能なSca1+ /Ter119-/CD31- /CD45- 細胞を表す。残骸と細胞の凝集体は、前方(FSC)および側面散布(SSC)プロットを使用して枯渇します。次に、DAPI-母集団がゲートされ、続いてAPC+/FITC-集団のゲーティングが続きます。不染色コントロールは、ギャティングパラメータの設定を支援するために使用する必要があります。</li>
		<li>細胞を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ内のフローサイトメトリーバッファーの500 μLに回収します。今後、汚染を最小限に抑えるために、すべての手順を無菌条件下で行う必要があります。1つのマウスから約50,000~10万個の細胞が採取されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞の生存率を評価するために、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数える。細胞凝集体はさらなる下流分析を妨げる可能性があるため、細胞凝集体の存在も評価され、これらの凝集体の存在を最小限に抑えます(生存可能な細胞数の5%)。</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は、単一細胞レベルで多様な細胞集団を同時に研究する強力なツールとして急速に牽引力を得ています。サンプル調製と高スループットシーケンシングに関連するコストが高いため、実験の成功の可能性を高めるためには、細胞入力(高い生存率と純度)を最適化することが不可欠です。一部の細胞調製プロトコルは、FACSソート14を使用せずに、低スピン化しカラムベースの分離を使用して死んだ細胞および破片の除去に依存している。しかし、これらの方法の多くは、生存可能な回収細胞の数を大幅に減少させ、そして多くの場合、死細胞は完全に除去されない14。このプロトコルは、最小限の細胞残骸、細胞ダブレット、および死細胞を含む非常に生存性の高いSca1+脂肪前駆細胞を分離する簡単な方法を概説する。このプロトコルを使用して分離された細胞は高い生存率を示しましたが、高い生存率を維持するために、細胞の単離とさらに下流分析の間の時間を最小限に抑えることをお勧めします。さらに、高純度のSca1+脂肪前駆細胞を</s...

脂肪組織は、エネルギー代謝に重要な役割を果たしています。.過剰なエネルギーは脂質の形で貯蔵され、脂肪組織は栄養状態およびエネルギー需要に応じて有意な膨張または引き込みが可能である。脂肪組織の拡張は、脂肪細胞サイズの増加(肥大)および/または脂肪細胞数の増加(過形成)から生じる可能性があります。後者のプロセスは、脂肪前駆細胞1,2の増殖と分化によって厳しく調節される。肥満の間、脂肪組織は過度に拡大し、低酸素症、炎症、インスリン抵抗性を含む組織機能不全は、しばしば3、4を発症する。これらの合併症は高血圧、糖尿病、心血管疾患、脳卒中、および癌5を含む多くの慢性疾患への危険因子である。したがって、制御されていない脂肪組織の拡張を制限し、脂肪組織の病理を緩和することは、生物医学研究の最優先事項である。脂肪組織の拡張中に、生体脂肪組織由来幹細胞(ASC)は増殖し、順次に前駆細胞(コミット前駆細胞)に増殖し、次いで成熟脂肪細胞に分化する。最近の単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)研究は、これらの脂肪前駆細胞(APCおよび予後細胞)集団が実質的な分子および機能的ヘテロジニアリティ7、8、9、10、11、12を示していることを示している。例えば、ASCは、減少した有数分化能力を示す一方で、より高い増殖および拡張能力を示す一方で、前置細胞7と比較して。ASCとプリデポサイト集団内でさらなる分子差が報告されるが、これらの違いの機能的関連性は依然として不明である7。これらのデータは、脂肪の前駆細胞プールの複雑さを強調し、これらの重要な細胞集団をよりよく理解し、操作するためのツールを開発し、標準化する必要性を強調しています。
このプロトコルは、単一細胞研究(scRNA-シーケンシング)および細胞培養を含む、敏感な下流分析に適したマウス上端体脂肪パッドからの高生存率Sca1+脂肪前駆細胞集団の分離を詳述する。上端体脂肪パッドの単離および解離は、前述の7,13と同様に、単離されたAPCの生存率を向上させるわずかな改変を伴って行った。簡単に言えば、上端体脂肪パッドからの解離細胞は、Sca1に対する抗体、ASCおよび予読細胞6、7、および他の系統(Lin)マーカーの両方に対する抗体で染色される:Ter119(エリスロイド細胞)、CD31(内皮細胞)、およびCD45(白血球)。生存可能なSca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-細胞は、蛍光活性化細胞分類(FACS)によってソートされます。重要なことに、このプロトコルは、ASCおよび予後細胞内の機能的に不均一な亜集団を同定した最近の単一細胞RNAシーケンシング研究で報告された、実行可能なSca1+ /Linの脂肪化前駆細胞の分離および分析に成功して検証された。

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL 培養チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL 試験管(セルストレーナースナップキャップ付き</td><td>) サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31-FITC抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45-FITC抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>抗Sca1-APC抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>抗Ter119-FITC抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム溶液</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>〒130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

肥満および代謝障害(糖尿病、心臓病、癌など)は、すべて劇的な脂肪組織リモデリングに関連している。組織に住む脂肪前駆細胞(APC)は脂肪組織恒常性において重要な役割を果たし、組織病理に寄与し得る。単一細胞RNAシーケンシングや単細胞プロテオミクスを含む単細胞解析技術の使用が増え、集団または組織全体の変化の中で個々の細胞発現変化の前例のない解決を可能にすることで、幹細胞/前駆細胞分野を変革しています。本稿では、マウスの上端体脂肪組織を解剖し、単一の脂肪組織由来細胞を分離し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行して、実行可能なSca1+/CD31 - /CD45-/Ter119- APCを濃縮するための詳細なプロトコルを提供します。これらのプロトコルにより、研究者は単一細胞RNAシーケンシングなどの下流解析に適した高品質のAPCを準備することができます。

この実験では、生後4ヶ月の雄FVBマウスを用いた。FSC/SSCプロットを使用して破片およびダブレットを除外した後、生存可能な細胞(DAPI- 母集団)をゲートし、続いてAPC+/FITC- 母集団の選択を行った(図1)。DAPI、APC、およびFITCのゲートは、未染色の制御に基づいて描かれました。ギャティング戦略を 図 1に示します。
1時間の選別後、分離の質をフローサイトメトリー解析により定量的に評価した(図2、3)。細胞を、生存性染色のためにヨウ化プロピジウム溶液(1:100)で染色した。同じ格子化を使用して、細胞は高い生存率と純度を維持しました:92.6±2.2%単一細胞( 図2の3番目のパネル)、86.4±3.0%生存率(PI- 細胞)、86.0±2.8%APC+...

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

このプロトコルにより、マウス精巣上体脂肪組織から高品質の脂肪前駆細胞を単離し、高感度な下流分析を行うことができます。この技術は、非常に生存率の高い脂肪前駆細胞を作製し、最近のシングルセルRNAシーケンシング研究で検証されています。オスのマウスを安楽死させた後、精巣上体脂肪パッドを見つけ、鈍い鉗子で優しく引っ張って熟考します。はさみを使用して精巣を取り外し、精巣上体脂肪パッドを5ミリリットルのHBSSに5ミリリットルのHBSSでインキュベートし、50ミリリットルの円錐管に15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを150 x gで4°Cで7分間遠心分離します。浮遊している精巣上体脂肪パッドを円錐形のチューブから取り出し、清潔なハサミで細かく刻みます。13ミリリットルの培養チューブ内の3.8ミリリットルのHBSSに200ミリリットルの2%コラゲナーゼ溶液を加えます。次に、みじん切りにした組織を加え、回転インキュベーターで5回転のインキュベーターで摂氏37度で1時間インキュベートします。内容物全体を50ミリリットルの円錐管に移し、10ミリリットルの中和媒体を追加します。チューブを2〜3回反転させて穏やかに混ぜます。70マイクロメートルのセルストレーナーを取り付けた別の50ミリリットルの円錐形チューブを準備し、消化された組織を新しいチューブにろ過します。流れを15ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で10分あたり350 x gで遠心分離します。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのDPBSで再懸濁します。その後、チューブをさらに10分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、50マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーを追加します。ピペッティングで穏やかに細胞を混合し、氷の上に保ちます。フローサイトメトリーバッファー中の細胞の総量は約100マイクロリットルになります。細胞を混合した後、54マイクロリットルの細胞懸濁液を1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。6マイクロリットルのFCRブロッキング試薬を加え、ピペットで静かに混合します。次に、チューブを摂氏4度で10分間インキュベートします。残った細胞は氷上に保管して、染色されていないコントロールとして使用します。インキュベーション中に、抗Sca1-APC、抗Ter119-FITC、抗CD31-FITC、および抗CD45-FITC抗体を各11μLの微量遠心チューブに組み合わせて抗体カクテルを調製します。混合物をそっとピペットで動かし、光から保護して氷の上に保ちます。FCRブロッキング試薬とのインキュベーション後、40マイクロリットルの抗体カクテルを加え、穏やかなピペッティングでよく混合します。細胞を摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。500マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPIを添加して染色細胞に加えます。よく混合し、セルストレーナースナップキャップ付きの5ミリリットルの試験管を使用してセルをろ過します。次に、細胞を氷の上に保ちます。未染色の細胞に500マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。セルストレーナースナップキャップ付きの5ミリリットルの試験管を使用して、細胞をろ過し、氷上に保ちます。染色した細胞と未染色のコントロールをFACS分析装置またはソーティング装置に輸送します。APC陽性、FITC陰性、DAPI陰性の集団を、本文原稿に記載されているゲーティング戦略を用いて同定し、分離します。汚れていないコントロールを使用して、ゲートパラメータの設定に役立てます。FSC-SSCプロットを用いてデブリおよびダブレットを除外した後、生存細胞をゲート化し、続いてAPC陽性およびFITC陰性の集団を選択しました。DAPI、APC、および FITC ゲートは、未染色のコントロールに基づいて描画されました。以下の結果は、4ヶ月齢の雄FVBマウスからの脂肪前駆細胞の単離を示しています。1時間のソーティング後、単離の品質をフローサイトメトリー分析により定量的に評価し、細胞が高い生存率と純度を維持していることを実証しました。このプロトコールの後には、シングルセルRNAシーケンシング、定量的リアルタイムPCR、フローサイトメトリーなどの高感度ダウンストリーム解析を行うことができます。これにより、脂肪前駆細胞のさらなる特性評価が可能になります。脂肪前駆細胞は不均一な集団であり、さらなる単一細胞研究が必要です。この方法により、シングルセル研究に適した細胞を単離することが可能になります。

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、マウスの大動脈周囲弓脂肪組織から蛍光標識された神経堤由来脂肪由来幹細胞(ADSC)を単離および培養する技術を示しています。単離後、NCADSCsを検出し、蛍光活性化細胞ソーティング法を用いて選別した後、プレート上で培養することで細胞増殖を促進します。...

マウス腹膜脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離

ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム...

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。...

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

この報告書は、新生児マウスからの原発性褐色および白色の前突細胞の同時分離のためのプロトコルを記述する。単離された細胞は培養中に増殖させ、完全に成熟した白および褐色のアディポサイトに分化するように誘導することができる。この方法は、培養中の一次脂肪細胞の遺伝的、分子的、機能的特徴付けが可能となる。...

新生児マウスからの白色および褐色の前読細胞の分離と分化

このプロトコルは、皮下脂肪からのマウス前駆脂肪細胞の単離、成熟脂肪細胞への分化、およびインスリン抵抗性の誘導について説明しています。インスリン作用は、ウェスタンブロットを介したインスリンシグナル伝達経路のメンバーのリン酸化/活性化によって評価されます。この方法は、初代脂肪細胞におけるインスリン抵抗性/感受性の直接決定を可能にする。...

初代培養における分化マウス脂肪細胞:インスリン抵抗性のモデル

新生仔マウスの肩甲間褐色脂肪組織の間質血管分画から前駆脂肪細胞を単離し、脂肪滴を蓄積する細胞に分化し、分子マーカーを発現し、成熟した褐色脂肪細胞のミトコンドリア形態を示します。これらの細胞は、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡法によってさらに分析されます。...

新生仔マウスの肩甲間脂肪組織の間質血管画分からの褐色脂肪細胞の分化とイメージング

脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。...

マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価

成熟した脂肪細胞のサイズと脆弱性は、その研究と分離に利用できる技術とツールを制限しています。ここでは、成熟したマウス脂肪細胞の単離のためのプロトコルが記載されており、これは異なる脂肪貯蔵庫およびマウスの食事療法に容易に適応することができる。...

赤身および肥満マウスからの初代マウス脂肪細胞の単離と培養

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

学ぶ マウス上端体脂肪組織から脂肪前駆細胞をFACSで調製する方法。高生存率・高純度の細胞を単一細胞RNAシーケンスなどの感度の高い下流解析に利用できます。

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

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