Name: 4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングと解析を用いた生体細胞における3次元cAMP分布の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶ4次元ハイパースペクトルFRETイメージングと線形スペクトルアンミキシングを用いた生体細胞内の3次元cAMP分布測定法。フォルスコリン処理による細胞応答の可視化と高解像度シグナリング動態解析に有用です。

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著者らは、H188 cAMP FRETバイオセンサーとケニー・トリン(南アラバマ大学工学部)が独自に開発したプログラミングスクリプトを実行するのに要する時間を短縮するための技術的支援を提供したキース・ジャリンク博士(オランダ癌研究所とファン・レーウェンフック先端顕微鏡センター、アムステルダム、オランダ)を認めたいと考えています。
著者らは、資金源を認めたい:アメリカ心臓協会(16PRE27130004)、国立科学財団。(1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

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<li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li>
<li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cyclic+Nucleotide+Research%22%5BJournal%5D)">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li>
<li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2%2B+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li>
<li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li>
<li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li>
<li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li>
<li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li>
<li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li>
<li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+%CE%B2-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031(2017).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanciful+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li>
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<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+by+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).</li>
<li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li>
<li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling%3A+role+of+CREB+and+CREM%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li>
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<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).</li>
<li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signaling+compartmentation%3A+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIem-spFRET%3A+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).</li>
<li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRET%3A+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li>
<li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453(2017).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).</li>
</ol>

リーブズリー博士とリッチ博士は、スペクトルイメージング技術を商業化するために設立された新興企業SpectraCyte,LLCに対する金銭的関心を開示しています。しかし、このプロトコルに記載されているすべての手順は、SpectraCyte, LLCに関連しない市販の製品を使用して実施した。

FRETバイオセンサーの開発により、単一細胞における環状ヌクレオチドシグナルの測定と可視化が可能となり、細胞内シグナル伝達事象13,22,37,38を可視化する大きな約束がある。しかし、FRETバイオセンサーの使用は、多くの蛍光タンパク質ベースのFRETレポーターの低いシグナル間特性およびFRETレポーターの弱いトランスフェクションまたは発現効率(これはPMVECなどの特定の細胞株において特に困難である可能性がある)23,24を含むいくつかの制限を提示する。微弱発現蛍光タンパク質のイメージングは、レシオメトリックFRET計算と組み合わせることで、多くの場合、計算されたFRET効率において高い不確実性または変動をもたらす。FRET測定の信頼性を向上させるために、我々およ...

環状アデノシン一リン酸(cAMP)は、細胞分裂、カルシウム流入、遺伝子転写、シグナル伝達を含む主要な細胞および生理学的プロセスに関与する第二のメッセンジャーである。証拠の成長体は、シグナル特異性が達成される細胞内のcAMPコンパートメントの存在を示唆しています1,2,3,4,5,6,7.最近まで、cAMP区画化は、異なるG結合受容体アゴニスト8、9、10、11によって誘発される明確な生理学的または細胞的効果に基づいて推測された。より最近では、FRETベース蛍光イメージングプローブは、細胞12、13、14におけるcAMP信号の直接測定および観察のための新しいアプローチを提供している。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、分子が近接15,16の場合にドナー分子とアクセプター分子間でエネルギー移動が起こる物理的現象である。FRETベース蛍光指標の開発に伴い、この物理現象は、タンパク質相互作用17、タンパク質共局在18、Ca+2シグナル伝達19、遺伝子発現20、細胞分裂21および環状ヌクレオチドシグナル伝達を研究する生物学的応用において使用されてきた。FRET ベースの cAMP 指標は、通常、cAMP 結合ドメイン、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア22から構成されます。例えば、この方法論で使用されるH188 cAMPセンサ12,22は、Epacから得られたcAMP結合ドメインから成り、ターコイズ(ドナー)と金星(アクセプター)フルオロフォアの間に挟まれる。基礎条件(非結合)では、ターコイズとヴィーナスは、蛍光色素間でFRETが発生するような向きである。結合ドメインにcAMPを結合すると、ターコイズとヴィーナスが離れて移動するような立体構造変化が起こり、FRETが減少する。
FRETベースのイメージングアプローチは、細胞内のcAMP信号を調査し、可視化するための有望なツールを提供します。しかし、現在のFRETベースの顕微鏡イメージング技術は、多くの場合、細胞内空間的明瞭度でFRETを測定するのに十分な信号強度を達成するのに部分的にしか成功していない。これは、多くのFRETレポーターの信号強度の制限、FRET効率の変化を正確に定量するために必要な高い精度、および細胞自家蛍光23、24などの交易因子の存在を含むいくつかの要因によるものである。その結果、多くの場合、弱いSNRに悩まされているFRET画像であり、FRETにおける細胞内変化の視覚化は非常に困難になります。さらに、空間的に局在したcAMP信号の調査は、ほぼ2つの空間次元でほぼ独占的に行われ、軸方向のcAMP分布はめったに25と考えられてはなされていない。これは、SNR が低いために cAMP 勾配を 3 つの空間次元で測定および視覚化する機能が妨げられたためです。低SNRを有するFRETセンサの使用の限界を克服するために、我々は、単一細胞25、26、27でFRETを測定するためのハイパースペクトルイメージングおよび分析アプローチを実施した。
ハイパースペクトルイメージングアプローチは、衛星画像28,29に存在する地上の物体を区別するためにNASAによって開発された。これらの技術は、その後、蛍光顕微鏡観察分野30に翻訳され、いくつかの商業的共焦点顕微鏡システムがスペクトル検出器を提供する。従来の(非スペクトル)蛍光イメージングでは、サンプルはバンドパスフィルタまたはレーザーラインを使用して励起され、発光は2番目のバンドパスフィルタを使用して収集され、フッ素フォロアのピーク発光波長に合わせて選択されることがよくあります。対照的に、ハイパースペクトルイメージングアプローチは、特定の波長間隔で蛍光発光26、31、32または励起33、34のいずれかの完全なスペクトルプロファイルをサンプリングすることを求める。我々のこれまでの研究では、ハイパースペクトルイメージングおよび解析アプローチは、従来のフィルタベースのFRETイメージング技術26と比較して、細胞内のFRET信号の定量化を改善できることを示した。ここでは、4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングおよび解析を行い、cAMP分布を3つの空間次元で測定および可視化する方法論を提示する。これらのアプローチは、単一細胞25におけるアゴニスト誘発cAMP空間勾配の可視化を可能にした。興味深いことに、アゴニストによっては、cAMP勾配が細胞内で明らかである可能性がある。ここで提示される方法論は、FRET測定の精度を向上させるために、不均一な背景および細胞自家蛍光のスペクトルの非混合を利用する。この方法論は、cAMP FRETバイオセンサーを用いた肺微小血管内皮細胞(PMVEC)で実証されているが、この方法論は、代替FRETレポーターまたは代替細胞株で使用するために容易に変更することができる。

<table><tbody><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td>Attofluorには、スチール製のセルチャンバーとゴム製のOリングが含まれています。細胞室はカバーガラスを保持し、Oリングは、漏れのない細胞室内の緩衝液を保持するためのロックイン機構を提供します</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP231-100</td><td>溶剤 原液forskolinを調製するために使用されます。</td></tr><tr><td>DRAQ5 蛍光プローブ溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>62252</td><td>核ラベル</td></tr><tr><td>ダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>培養皿内で細胞が増殖および分裂するための栄養素と成長因子が含まれています。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td>培地に添加される成長因子の供給、DMEM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td>アデニーリーシクラーゼ活性化剤。</td></tr><tr><td>H188 Cyclic AMP FRETバイオセンサー</td><td>オランダがん研究所、Dr. K. Jalink</td><td>Gift</td><td>Plasmid Encoding Turquoise (ドナー蛍光色素分子)、Venus (アクセプター蛍光色素分子)、およびEpacから取得した結合ドメイン。</td></tr><tr><td>画像J</td><td>image.net</td><td>無料ダウンロード</td><td>スペクトル情報の抽出と画像処理に使用される別の画像処理プラットフォーム。</td></tr><tr><td>積分球</td><td>オーシャンオプティクス</td><td>FOIS-1</td><td>さまざまなレーザー強度(?)でのレーザーラインの照明強度を測定するために使用されます。</td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein, Natural</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>カバースリップはラミニンでコーティングされており、細胞の接着、成長、および細胞の運動性に役立ちます。</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>H188 FRETバイオセンサーで細胞をトランスフェクションするために使用されるトランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2019a</td><td>画像処理操作(線形アンミキシングおよびFRET効率計算)は、MATLABプログラミング環境でカスタムプログラムを作成することによって実行されます</td></tr><tr><td>ニコンA1R共焦点顕微鏡</td><td>ニコンインスツルメン</td><td>ツ ニコンA1R</td><td>スペクトル画像の取得は、共焦点顕微鏡を使用して行われます。</td></tr>Nikon Elementsソフトウェア Nikon A1R <tr><td>NISTトレーサブルキャリブレーションランプ</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td> 標準PBS pH 7.4 (1X)<td>として使用するための既知のスペクトルを持つランプ</td></tr> 細胞<tr><td></td><td></td><td></td><td>培養</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>をバッファとして使用したnd2画像ファイル(多次元画像ファイル)のエクスポートと処理に使用されるソフトウェアドングル肺微小血管内皮細胞(PMVECs)</td><td>社内 - 細胞培養コア、南アラバマ大学</td><td>ラット肺微小血管系から単離された</td><td>PMVECsは、血管の内層を形成します。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>抗生物質を培養液に添加し、細胞の汚染を防ぎます。</td></tr><tr><td>Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides</td><td>Clay Adams</td><td>3010</td><td>細胞固定に使用される顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>サンプルが退色防止封入剤を使用して固定されている場合、後者は蛍光色素と発色団を退色から保護します。</td></tr><tr><td>分光計</td><td>オーシャンオプティクス</td><td>QE65000</td>光源<td>(?)</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>細胞と細胞マトリックスとの間のタンパク質間結合を消化し、細胞プレーティング中に細胞をディススコシエートして持ち上げるのを助けます。</td></tr><tr><td>タイロデスバッファー</td><td>自社製</td><td></td><td>タイロデスバッファーは、ワーキングソリューションの作成や、画像取得時の水溶液中の細胞の維持に使用されます。</td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>ラミニンコーティングされたカバースリップを6ウェル培養ディッシュ(1つのカバーリスプ/ウェル)に入れます。細胞と培地を各ウェルに加えます。</td></tr><tr><td>25 mm丸型顕微鏡カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12545102</td><td>丸型ガラスカバースリップで細胞を成長させました</td></tr><tr><td>60X Ojective</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td>プラン Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>水浸と細胞の一般的に使用される対物レンズ</td></tr></tbody></table>

4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルfretイメージングと解析を用いた生体細胞における3次元camp分布の測定

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

サイクリックAMPは、細胞および生理活性の広い範囲に関与している第二のメッセンジャーです。いくつかの研究は、cAMP信号が区画化され、区画化がcAMPシグナル経路内のシグナル特異性に寄与することを示唆している。Fӧrster共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのバイオセンサーの開発は、細胞内のcAMP信号を測定し、可視化する能力を高めています。ただし、これらの測定値は、多くの場合、2 つの空間次元に限定され、データの誤解釈につながる可能性があります。これまで、3空間次元(x、y、z)でのcAMP信号の測定は非常に限られており、本質的に低信号対雑音比(SNR)を示すFRETセンサの使用に関する技術的な制限によりあります。さらに、従来のフィルタベースのイメージング手法は、スペクトルクロストーク、限定的な信号強度、自己蛍光などのさまざまな要因により、局在化した細胞下領域でcAMP信号を正確に測定するのには効果的でないことがよくあります。これらの制限を克服し、FRETベースのバイオセンサーを複数の蛍光ホルで使用できるようにするために、FRET効率を計算するためのスペクトル特異性と、FRET信号を同時交流自発および/または追加の蛍光標識からのシグナルからスペクトル的に分離する能力を提供するハイパースペクトルFRETイメージングおよび分析アプローチを開発しました。ここでは、ハイパースペクトルFRETイメージングを実装するための方法論と、スペクトルアンミックスを行うためにアンダーサンプリングもオーバーサンプリングもしない適切なスペクトルライブラリを構築する必要性を提示する。この方法論は、肺微小血管内皮細胞(PMVEC)における3次元cAMP分布の測定に用いるが、この方法論は、細胞タイプの範囲におけるcAMPの空間分布を研究するために使用することができる。

このプロトコルは、ハイパースペクトルFRETイメージングの使用と、生細胞における3つの空間次元におけるcAMP勾配を測定するための分析アプローチについて説明する。これらの結果の生成には、データの分析と定量を行う際に細心の注意が必要な重要なステップがいくつかあります。これらの主要なステップには、適切なスペクトルライブラリの構築、バックグラウンドスペクトルの非混合、セル境界を識別するためのしきい値、FRET効率計算などがあります。 図1 は、生細胞におけるFRET効率およびcAMPレベルの測定に関与するすべてのステップの概略的な流れを示す。これらのイメージングと解析のステップを適切に実行すると、FRET効率の測定と、非均一なバックグラウンド信号を考慮しながら、セル内の3次元のcAMP空間勾配の推定が可能になります。
図2 は、基準条件でニコンA1R共焦点顕微鏡を用いて取得した偽色の生ハイパースペクトル画像データの3次元図(図2...

Fӧrster共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのセンサの信号対雑音比(SNR)が低いため、cAMP信号の測定は特に3つの空間次元において困難でした。ここでは、3つの空間次元でcAMP分布を測定できるハイパースペクトルFRETイメージングおよび解析方法論について述べる。

4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングと解析を用いた生体細胞における3次元cAMP分布の測定

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

このプロトコルは、個々の細胞の3空間次元でFRETまたはサイクリックAMP信号を測定および視覚化する方法を提供するという点で重要です。サイクリックAMP分布は、横方向だけでなく軸方向にも発生する場合があり、これらの分布をサンプリングするには、FRETサイクリックAMP画像データを3次元で取得することが重要です。イメージングの日には、温かいTyrodesを水浴中で摂氏37度に緩衝し、目的のトランスフェクションされた細胞と一緒に座ったカバースリップを細胞チャンバーに取り付けます。漏れを防ぐためにチャンバーの上部を取り付けガスケットで固定し、繊細なタスクワイパーを使用して、カバースリップの底から余分な培地または付着細胞を取り除きます。800マイクロリットルの作業緩衝液と4マイクロリットルの5ミリモル核標識を細胞チャンバーに加え、チャンバーを5〜10秒間静かに揺さぶる。次に、細胞チャンバーをアルミホイルで覆い、室温で10分間インキュベートします。細胞をイメージングするには、スペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡で60倍水浸対物レンズを選択し、対物レンズに水滴を追加します。ロードしたセルチャンバーを顕微鏡ステージに置き、フィルターノブを調整して適切なフィルターセットを選択します。蛍光広視野モードを選択し、接眼レンズを使用して、FRETサイクリックAMPセンサーを発現する細胞を含む視野を選択します。イメージングソフトウェアを開き、共焦点モードを選択して、レーザーインターロックボタンのロックを解除します。A1設定メニューを開きます。405 ナノメートルと 561 ナノメートルのレーザーラインに対応するボックスにチェックを入れ、これらのスペクトル検出を SD、分解能を 10、チャンネルを 32 に設定します。波長範囲を設定するには、波長の開始値と終了波長の値を選択します。A1設定メニューを開いて、ビニングスキップアイコンを選択します。数字の 15 ボックスを選択し、[OK] をクリックします。レーザー強度を 405 ナノメートル レーザーの場合は 8% に、561 ナノメートル レーザーの場合は 2% に設定します。検出器のゲインを 149 に、ピンホールの半径を 2.4 エアリー ディスク ユニットに設定します。スキャン速度を 25 スペクトル フレーム/秒に設定し、単方向スキャン方向を選択します。カウントを 4 に設定し、スキャン サイズを 1024 x 1024 に設定します。z-stack アクイジション パラメータを定義するには、[表示]、[アクイジション制御]、[ND アクイジション] の順にクリックし、ポップ ウィンドウにファイルの保存先と名前を入力して ND ファイルを保存します。zシリーズのボックスをクリックし、A1 Plus設定ウィンドウでライブをクリックして、ライブを開きます viewingウィンドウ。フォーカスノブを調整して、プレビューウィンドウを見ながらセルに焦点を合わせます。顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの上部を選択し、ND取得ウィンドウで[トップ]をクリックして現在の位置をトップに設定します。顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの底部を選択し、[下部]をクリックして現在の位置を下部に設定します。ステップ サイズに 1 マイクロメートルを入力します。z-スキャンの方向に「Top Bottom」を選択し、「run」をクリックしてz-stackを集録します。zスタックの取得が完了したら、ピペットを使用して、細胞を乱すことなく目的の試薬をチャンバーに穏やかに加えます。10 分後にファイル名を変更し、2 つ目の z-stack イメージを取得します。イメージング後、スペクトル Z スタック画像と同じファイル名で新しいフォルダーを作成し、目的のスペクトル画像ファイルを開きます。「ファイル」、「インポート/エクスポート」、および「ND ドキュメントのエクスポート」をクリックします。ポップアップウィンドウで、新しく作成したフォルダー、ファイルタイプにTIFF、各チャンネルにモノラルイメージ、およびビット深度を保持を選択します。[エクスポート]をクリックして個々のファイルをフォルダにエクスポートし、リニアスペクトルアンミキシングソフトウェアを開きます。Linear Unmixingを開きます。m ファイルに移動し、[実行] をクリックします。エクスポートされた TIFF ファイルシーケンスを含むフォルダーを参照して選択し、[OK] をクリックして波長と Z スライスのウィンドウを開きます。最初のファイルのファイル名を Z スライスとチャンネル番号なしでフォルダからコピーし、最初のステップの「イメージ名の入力」ボックスに貼り付けます。「波長バンドの数を入力」ボックスにチャンネル数を入力し、「Z スライスの数を入力」ボックスに Z スライスの数を入力して、「OK」をクリックします。次に、ポップアップウィンドウで、Wavelengthを参照して選択します。mat ファイルを開き、[開く] をクリックします。新しいポップアップウィンドウで Library. mat ファイルを参照して選択し、もう一度「開く」をクリックしてスライスのアンミキシングを開始します。FRET効率を計算するには、multiFRRCFを開きます。m プログラミング スクリプトを作成し、分析する実験試行の数を [再スライスするフォルダーの数] ボックスに入力します。[OK] をクリックします。混ざっていないフォルダを参照して選択し、もう一度[OK]をクリックします。新しいポップアップ ウィンドウで、スケーリング ファクターを 12.4 に、しきい値を 56 に、X、Y、Z の周波数をそれぞれ 5、5、1 に、スムージング アルゴリズムをガウス に設定します。次に、「Run」をクリックして、FRETの測定と再ライシングを実行します。FRETの効率をサイクリックAMPレベルにマッピングするには、Mapping_FRETを開きます。Efficiency_to_cAMP_concentration.m ファイルに移動し、[実行] をクリックします。最初のグレースケール FRET 画像に移動して選択し、[OK] をクリックします。次に、FRETサイクリックAMP画像を開いて、サイクリックAMP信号の分布を3次元で検査します。これらの画像では、ベースライン時およびフォルスコリン処理の10分後に共焦点顕微鏡を使用して取得された偽色の生のハイパースペクトル画像データの3次元ビューを観察できます。この解析では、アクセプター蛍光色素を完全に光破壊し、1対1の化学量論によるドナーとアクセプターのスペクトルシグネチャーを取得しました。核色素で標識されたトランスフェクションされていない細胞を利用して、色素蛍光色素の純粋なスペクトルを得ました。ドナー、アクセプター、および核色素の蛍光色素のスペクトルを組み合わせることで、3成分ライブラリを作成できます。ここでは、3つのバックグラウンドスペクトルシグネチャのソースを観察できます。これらの信号はサンプル内で不均一に分布しており、単純に差し引くことはできませんが、これらの信号のスペクトルシグネチャをスペクトルライブラリに追加し、線形アンミキシングを使用して信号を分離することで、FRET効率を計算する前にドナー信号とアクセプター信号からこれらの交絡信号を除去するアプローチが得られます。その後、6成分スペクトルライブラリを使用して、軸方向イメージの各スライスに対して線形スペクトルアンミキシングを実行できます。ここでは、異なるXY平面スライスにおけるFRET効率とサイクリックAMPレベルの変化を観察することができ、ベースライン条件とフォルスコリン処理の10分後の条件との比較が可能になります。この手法は、細胞と組織の両方で他のレポーターのFRET効率を3次元で定量化するためにも使用できます。

measurement-3-dimensional-camp-distributions-living-cells-using-4

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。...

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。...

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。...

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

定量位相イメージングと機械学習アルゴリズムを用いたリンパ球サブタイプの無料のラベル識別のためのプロトコルについて述べる。リンパ球の 3 D の屈折断層の測定は、細胞の種類を識別するための機械学習アルゴリズムで分析します個々 のセル、3 D...

ラベル無料三次元定量的な位相画像を用いたリンパ球サブタイプの同定と機械学習

このプロトコルは、多色4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いた発芽酵母における蛍光標識細胞内コンパートメントの分析について説明する。イメージ投射パラメータは、光の損傷を制限しながら、適切な信号をキャプチャするために選択されます。カスタム ImageJ...

酵母の4D顕微鏡検査

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。...

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。...

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。...

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

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Cell-ACDCを用いた多次元顕微鏡データの解析

学ぶ4次元ハイパースペクトルFRETイメージングと線形スペクトルアンミキシングを用いた生体細胞内の3次元cAMP分布測定法。フォルスコリン処理による細胞応答の可視化と高解像度シグナリング動態解析に有用です。

4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングと解析を用いた生体細胞における3次元cAMP分布の測定

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