4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングと解析を用いた生体細胞における3次元cAMP分布の測定

このプロトコルは、個々の細胞の3空間次元でFRETまたはサイクリックAMP信号を測定および視覚化する方法を提供するという点で重要です。サイクリックAMP分布は、横方向だけでなく軸方向にも発生する場合があり、これらの分布をサンプリングするには、FRETサイクリックAMP画像データを3次元で取得することが重要です。イメージングの日には、温かいTyrodesを水浴中で摂氏37度に緩衝し、目的のトランスフェクションされた細胞と一緒に座ったカバースリップを細胞チャンバーに取り付けます。

漏れを防ぐためにチャンバーの上部を取り付けガスケットで固定し、繊細なタスクワイパーを使用して、カバースリップの底から余分な培地または付着細胞を取り除きます。800マイクロリットルの作業緩衝液と4マイクロリットルの5ミリモル核標識を細胞チャンバーに加え、チャンバーを5〜10秒間静かに揺さぶる。次に、細胞チャンバーをアルミホイルで覆い、室温で10分間インキュベートします。

細胞をイメージングするには、スペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡で60倍水浸対物レンズを選択し、対物レンズに水滴を追加します。ロードしたセルチャンバーを顕微鏡ステージに置き、フィルターノブを調整して適切なフィルターセットを選択します。蛍光広視野モードを選択し、接眼レンズを使用して、FRETサイクリックAMPセンサーを発現する細胞を含む視野を選択します。

イメージングソフトウェアを開き、共焦点モードを選択して、レーザーインターロックボタンのロックを解除します。A1設定メニューを開きます。405 ナノメートルと 561 ナノメートルのレーザーラインに対応するボックスにチェックを入れ、これらのスペクトル検出を SD、分解能を 10、チャンネルを 32 に設定します。

波長範囲を設定するには、波長の開始値と終了波長の値を選択します。A1設定メニューを開いて、ビニングスキップアイコンを選択します。数字の 15 ボックスを選択し、[OK] をクリックします。レーザー強度を 405 ナノメートル レーザーの場合は 8% に、561 ナノメートル レーザーの場合は 2% に設定します。

検出器のゲインを 149 に、ピンホールの半径を 2.4 エアリー ディスク ユニットに設定します。スキャン速度を 25 スペクトル フレーム/秒に設定し、単方向スキャン方向を選択します。カウントを 4 に設定し、スキャン サイズを 1024 x 1024 に設定します。

z-stack アクイジション パラメータを定義するには、[表示]、[アクイジション制御]、[ND アクイジション] の順にクリックし、ポップ ウィンドウにファイルの保存先と名前を入力して ND ファイルを保存します。zシリーズのボックスをクリックし、A1 Plus設定ウィンドウでライブをクリックして、ライブを開きます viewingウィンドウ。フォーカスノブを調整して、プレビューウィンドウを見ながらセルに焦点を合わせます。

顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの上部を選択し、ND取得ウィンドウで[トップ]をクリックして現在の位置をトップに設定します。顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの底部を選択し、[下部]をクリックして現在の位置を下部に設定します。ステップ サイズに 1 マイクロメートルを入力します。

z-スキャンの方向に「Top Bottom」を選択し、「run」をクリックしてz-stackを集録します。zスタックの取得が完了したら、ピペットを使用して、細胞を乱すことなく目的の試薬をチャンバーに穏やかに加えます。10 分後にファイル名を変更し、2 つ目の z-stack イメージを取得します。

イメージング後、スペクトル Z スタック画像と同じファイル名で新しいフォルダーを作成し、目的のスペクトル画像ファイルを開きます。「ファイル」、「インポート/エクスポート」、および「ND ドキュメントのエクスポート」をクリックします。ポップアップウィンドウで、新しく作成したフォルダー、ファイルタイプにTIFF、各チャンネルにモノラルイメージ、およびビット深度を保持を選択します。

[エクスポート]をクリックして個々のファイルをフォルダにエクスポートし、リニアスペクトルアンミキシングソフトウェアを開きます。Linear Unmixingを開きます。m ファイルに移動し、[実行] をクリックします。

エクスポートされた TIFF ファイルシーケンスを含むフォルダーを参照して選択し、[OK] をクリックして波長と Z スライスのウィンドウを開きます。最初のファイルのファイル名を Z スライスとチャンネル番号なしでフォルダからコピーし、最初のステップの「イメージ名の入力」ボックスに貼り付けます。「波長バンドの数を入力」ボックスにチャンネル数を入力し、「Z スライスの数を入力」ボックスに Z スライスの数を入力して、「OK」をクリックします。次に、ポップアップウィンドウで、Wavelengthを参照して選択します。mat ファイルを開き、[開く] をクリックします。

新しいポップアップウィンドウで Library. mat ファイルを参照して選択し、もう一度「開く」をクリックしてスライスのアンミキシングを開始します。FRET効率を計算するには、multiFRRCFを開きます。

m プログラミング スクリプトを作成し、分析する実験試行の数を [再スライスするフォルダーの数] ボックスに入力します。[OK] をクリックします。混ざっていないフォルダを参照して選択し、もう一度[OK]をクリックします。新しいポップアップ ウィンドウで、スケーリング ファクターを 12.4 に、しきい値を 56 に、X、Y、Z の周波数をそれぞれ 5、5、1 に、スムージング アルゴリズムをガウス に設定します。

次に、「Run」をクリックして、FRETの測定と再ライシングを実行します。FRETの効率をサイクリックAMPレベルにマッピングするには、Mapping_FRETを開きます。Efficiency_to_cAMP_concentration.m ファイルに移動し、[実行] をクリックします。

最初のグレースケール FRET 画像に移動して選択し、[OK] をクリックします。次に、FRETサイクリックAMP画像を開いて、サイクリックAMP信号の分布を3次元で検査します。これらの画像では、ベースライン時およびフォルスコリン処理の10分後に共焦点顕微鏡を使用して取得された偽色の生のハイパースペクトル画像データの3次元ビューを観察できます。この解析では、アクセプター蛍光色素を完全に光破壊し、1対1の化学量論によるドナーとアクセプターのスペクトルシグネチャーを取得しました。

核色素で標識されたトランスフェクションされていない細胞を利用して、色素蛍光色素の純粋なスペクトルを得ました。ドナー、アクセプター、および核色素の蛍光色素のスペクトルを組み合わせることで、3成分ライブラリを作成できます。ここでは、3つのバックグラウンドスペクトルシグネチャのソースを観察できます。

これらの信号はサンプル内で不均一に分布しており、単純に差し引くことはできませんが、これらの信号のスペクトルシグネチャをスペクトルライブラリに追加し、線形アンミキシングを使用して信号を分離することで、FRET効率を計算する前にドナー信号とアクセプター信号からこれらの交絡信号を除去するアプローチが得られます。その後、6成分スペクトルライブラリを使用して、軸方向イメージの各スライスに対して線形スペクトルアンミキシングを実行できます。ここでは、異なるXY平面スライスにおけるFRET効率とサイクリックAMPレベルの変化を観察することができ、ベースライン条件とフォルスコリン処理の10分後の条件との比較が可能になります。

この手法は、細胞と組織の両方で他のレポーターのFRET効率を3次元で定量化するためにも使用できます。