単一細菌化学を探るツールとして赤外線分光法と組み合わせた原子間力顕微鏡

この方法により、細菌のナノスケール研究が可能になります。これは、抗菌薬耐性の化学的変化についての詳細な洞察を提供します。したがって、AMRと医薬品開発の理解に貢献することができます。

バクテリアのナノスケールサイズは、その化学的性質を調査できる利用可能な研究ツールを大幅に制限します。AFM-IRは、細胞内レベルでも、非破壊的で観察者に依存しない方法でそれを行うことができます。この手法は、抗菌薬耐性に関する知見を得ることで、新しい抗菌薬の分子標的の同定と試験に役立ちます。

AFM-IRは、細菌だけでなく、さまざまな細胞、組織、さらにはウイルスもプローブできます。AFM-IRイメージング用のサンプルを調製するには、適切な培養条件下で適切な培地で目的の細菌を増殖させた後、滅菌ループを使用してコロニーの上部から細菌を慎重に選択し、ガラス管に移します。チューブに1ミリリットルの超純水を加え、採取した細菌ペレットがチューブの底に見えなくなるまで1〜2分間渦

調製した溶液とMcFarland標準試料を視覚的に比較することにより、溶液の大まかな濁度を推定します。細菌懸濁液の濁度が非常に低いと思われる場合は、溶液の粗い濁度が0.5および1マクファーランド基準に匹敵するまで、さらに細菌を追加し、渦巻き続けます。遠心分離により細菌をペレット化し、ピペットで上清を慎重に吸引します。

バクテリア細胞ペレットをボルテックスで1ミリリットルの超純水に再懸濁し、別の遠心分離でバクテリアを沈殿させます。先ほど示したように、細菌をさらに3回まで洗浄した後、上清を吸引し、ペレットを少なくとも2分間ボルテックスしてから、実験基質に5マイクロリットルの細胞を追加します。所望の厚さが単層または個々の細菌である場合は、堆積直後に、基材に20〜100マイクロリットルの超純水を加え、溶液をピペットチップで穏やかに混合します。

サンプルが風乾したら、両面粘着テープを使用して基板をAFM金属試料ディスクに取り付けます。AFM-IR分光装置を分析用に準備するには、ソフトウェアとレーザーの電源を入れた後に初期化を押し、レーザーシャッターが開いている位置にあることを確認します。このプロセス中に、「ステージの初期化」ウィンドウがポップアップ表示されます。

初期化プロセスが完了したら、[初期化] と [OK] をクリックします。可能であれば、窒素の流れをオンにして装置を窒素でパージし、窒素パージを調整して安定した湿度レベルを達成します。チップを傷つけないようにサンプルを慎重にサンプルチャンバーに入れ、ソフトウェアの[ロード]をクリックします。ウィザードに従ってサンプルをロードし、各ステップのチップとサンプルに焦点を当てます。

次に、「アプローチ」をクリックして、関与せずにサンプルにアプローチします。サンプルをセットする前に、[Tools]、[IR Background Calibration]、[New]の順に選択します。ポップアップウィンドウで、解析の目的に応じて解像度とスペクトル範囲を設定し、共平均と背景を平均値に設定します。

[有効にする] を選択します。ポップアップウィンドウで、開始パラメータと終了パラメータを設定し、[Accept and Acquire]をクリックします。バックグラウンド データを取得したら、[保存] をクリックします。

チップをサンプルにかみ合わせるには、[Engage] をクリックします。システムは、直接接触が検出されるまでサンプル表面に接近します。「スキャン」をクリックすると、最初の広い領域、低空間分解能のAFM画像が収集され、表面が可視化されてから、先端を目的の測定スポットに移動します。

赤外線レーザーをサンプルが吸収する波数に合わせるには、サンプルが吸収する波数を[波数]フィールドに入力し、[開始]をクリックして、振幅対周波数グラフで少なくとも1つの明確なピークが観察されます IR.At。「変位量 Versus Time」グラフには、周期的な波形が表示されます。[最適化] をクリックして、従来の赤外線バクテリア スペクトルを選択してバンドの位置を特定し、そのスペクトルを使用して、さまざまなスペクトル領域のさまざまな波数値でホットスポットを最適化します。

選択した波数値の赤外線スポットが最適化されたら、スペクトル分解能とコ平均の範囲と数を定義し、[取得]をクリックしてAFM-IRスペクトルを収集します。選択した波形数値の強度分布像を収集するには、単一のAFM-IRスペクトルを記録した後、選択したサンプル領域のAFM像を記録し、AFM-IRイメージング用の波形数値を選択します。選択した波数の値に対してレーザーのIRスポットが最適化されていることを確認し、画像領域のX方向とY方向のデータポイント数を設定します。

[一般]ウィンドウで、レーザー出力を設定します。「AFM Scan」ウィンドウで、スキャンレートを定義します。次に、[IRイメージングの有効化]ボックスをオンにし、[スキャン]をクリックしてイメージングを開始します。

選択した波番号での信号強度のAFM-IRは、その領域のAFMデータと同時に収集されます。このプロトコルにより、単一細胞から単層および多層まで、基質上のさまざまなタイプの細菌細胞分布を取得することができます。このプロトコルは、生きている細菌の動的変化を監視するために使用できます。

例えば、黄色ブドウ球菌細胞分裂中の中隔の形成において。セプタムのAFM-IRスペクトルは、細胞領域から収集されたAFM-IRスペクトルと比較して、1,240および1,090センチメートルでのバンドの相対強度が高いことを特徴とし、セプタムが細胞壁成分の炭水化物およびホスホジエステル基で構成されていることを示唆している。このプロトコルは、耐性の発生から生じる化学組成の違いを研究するためにも使用できます。

この代表的な解析で観察されたように、バンコマイシン間欠耐性とバンコマイシン感受性黄色ブドウ球菌細胞との間には形態学的差は測定されなかった。しかし、AFM-IRスペクトルとその二次誘導体の評価では、耐性株の細胞壁成分からの炭水化物およびホスホジエステル基に関連するバンドの相対強度が、感受性の高い対応物と比較して明らかに増加していることが明らかになりました。きれいなサンプルを調製することが重要であるため、最初から培地の寄与を減らし、複数回の洗浄から完全に除去するように注意してください。

AFM-IRは非破壊技術であるため、サンプルは後で染色や共焦点イオン分光法などの他の手法で研究でき、その化学的性質に関する補完的な情報を提供できます。