Name: グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶグラム陽性菌におけるMAPS技術を用いたsRNA標的体同定法。MS2アフィニティ精製とRNAシーケンスにより、細菌内の調節ネットワークを解明し、病原性メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、「アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ」(ANR、グラントANR-16-CE11-0007-01、RIBOSTAPH、およびANR-18-CE12-002-002-04、CoNoCo、PR)によってサポートされました。また、将来のプログラムへの投資の一環としてANRが管理する国家からの資金として、LabEx NetRNA ANR-10-LABX-0036およびANR-17-EURE-0023(PRへ)の枠組みの下で出版されています。DLは、マリー・スウォトフスカ・キュリー補助金第753137-SaRNARegの下で欧州連合のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムによって支援されました。E.マッセラボでの作業は、カナダ保健研究所(CIHR)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、国立衛生研究所NIHチームグラントR01 GM092830-06A1からの助成金を運営することによって支援されています。

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<li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li>
<li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10(2007).</li>
<li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone%2C+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li>
<li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProQ%2FFinO-domain+proteins%3A+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li>
<li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
<li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA%3A+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li>
<li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li>
<li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li>
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<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Reseaerch%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li>
<li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li>
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<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

グラム陽性菌の改変プロトコル MAPSの初期プロトコルは、モデル生物大腸菌20,30におけるsRNA相互作用を研究するために開発された。ここでは、日和見ヒト病原体S.アウレウスにおけるsRNA依存的調節ネットワークの特性評価に適し、他のグラム陽性菌、病原性であろうと確実にトランスポーズ可能な改変プロトコルについて説明する。
特に注意が細胞のライシスステップに支払われました。フランスのプレスは、機械的な細胞のライシスの器械によって置き換えられた。この方法は、グラム陽性細胞を破壊し、病原性株の取り扱いに関連するリスクを制限するのに有効です。MS2親和性精製の歩留まりを改善するため、アミロース樹脂上に固定化されたMS2-MBPの量が大幅に増加している。これは、ストリンジェンシーとワッシュの数を調整する必要があります。
初期プロトコルとは異なり...

ほとんどの細菌ゲノムでは、何百もの、おそらく何千もの小さな調節RNA(sRNA)が同定されていますが、その大部分の機能は依然として特徴付けられません。全体として、sRNAは短い非コード分子であり、細菌生理学および変動環境への適応において主要な役割を果たしている1、2、3である。確かに、これらの高分子は、代謝経路、ストレス応答だけでなく、毒性および抗生物質耐性にも影響を与え、多数の複雑な調節ネットワークの中心にあります。論理的には、その合成は、特定の環境刺激(例えば、栄養飢餓、酸化または膜ストレス)によって引き起こされる。ほとんどの sRNA は、短いベースペアと非連続的な基本ペアを使用して、転写後レベルで複数のターゲット mRNA を調節します。彼らは通常、翻訳開始領域4のためにリボソームと競合することによって翻訳開始を防ぎます。sRNA:mRNA二重鎖の形成はまた、しばしば特定のRNasesのリクルートによって標的mRNAの活性分解をもたらす。
sRNA標的の特徴付け(すなわち、標的RNAのセット全体)は、それが介入する代謝経路およびそれが応答する潜在的なシグナルを同定することを可能にする。その結果、特定のsRNAの機能は、一般にその標的から推測することができる。この目的のために、インタRNAおよびCopraRNA5、6、7のようなインシリコ予測ツールの幾つかが開発されている。彼らは特に、推定sRNAパートナーを決定するために、潜在的な相互作用部位のエネルギーとアクセシビリティを組み合わせた、シーケンスの相補性に依存しています。しかし、予測アルゴリズムは、RNAシャペロン8の関与が最適でない相互作用または両パートナーの共発現を支持するなど、生体内での塩基対に影響を与えるすべての因子を統合するわけではない。その固有の制限により、予測ツールの誤検出率は依然として高いままです。大部分の実験的大規模アプローチは、sRNA:mRNAカップルがタグ付きRNA結合タンパク質(RBP)6,9と相互作用する共精製に基づいている。例えば、ライゲーションとシーケンシングによるRNA相互作用(RIL-seq)法により、エシェリヒア・コリ10,11におけるHfqおよびProQなどのRNAシャペロンと共精製されたRNA二重鎖を同定した。ハイブリッドのUV架橋、ライゲーションおよびシーケンシング(CLASH)と呼ばれる同様の技術が、大腸菌12,13のRNase E-およびHfq関連sRNAに適用された。複数の細菌におけるsRNA媒介性調節におけるHfqおよびProQの十分に記述された役割にもかかわらず、sRNAベースの調節は、S.アウレウス16、17、18のようないくつかの生物においてRNAシャペロン非依存性であるようである。RNasesに関連するRNA二重鎖の精製がウォーターズと同僚13によって示されるように実現可能であっても、これはRNasesが急速な劣化を引き起こすので難しいままです。したがって、RNAシーケンシング(MAPS)アプローチ19,20と結合したMS2-アフィニティ精製は、このような生物における固体代替を構成する。
上記の方法とは異なり、MAPSは、すべての相互作用RNAを捕捉するために餌として特定のsRNAを使用するため、RBPの関与に依存しません。プロセス全体を 図 1に示します。簡単に言えば、sRNAはMS2コートタンパク質によって特異的に認識されるMS2 RNAアプタマーで5'でタグ付けされます。このタンパク質は、アミロース樹脂上に固定化されるマルトース結合タンパク質(MBP)と融合している。したがって、MS2-sRNAおよびそのRNAパートナーは、アフィニティークロマトグラフィーカラム上に保持されます。マルトースとの溶出後、共精製RNAを、高スループットRNAシーケンシングを用いて、バイオインフォマティクス解析を行って同定する(図2)。MAPS テクノロジーは、最終的に、インビボで発生するすべての潜在的な相互作用の相互作用マップを描画します。
MAPS技術は、もともと非病原性グラム陰性細菌大腸菌21に実装されました。驚くべきことに、MAPSは、RyhBおよびRybB sRNAの両方と特異的に相互作用するtRNA由来の断片を同定し、非誘導条件でmRNA標的を調節するためのsRNA転写ノイズを防止するのに役立った。その後、MAPSはDsrA 22、RprA 23、CyaR23およびGcvB24のような他の大腸菌sRNAに正常に適用された(表1)。MAPS は、以前に知られていた標的を確認した上で、これらの既知の sRNA のターゲットを拡張しました。最近、MAPSはサルモネラ・チフィムリウムで行われ、SraL sRNAがrho mRNAに結合することを明らかにし、転写終結因子25に対するコード化を行う。この組み合わせを通じて、SraLはRho自体によって引き起こされる早期転写終結からrho mRNAを保護する。興味深いことに、この技術はsRNAに限定されず、tRNA由来フラグメント26およびmRNA2の5'未翻訳領域の使用によって例示されるあらゆるタイプの細胞RNAに適用することができる(表1)。
MAPS法は、病原性グラム陽性菌S.アウレウス19にも適応されている。具体的には、リシスプロトコルは、グラム陰性細菌よりも細胞壁が厚いため、細胞を効率的に破壊し、RNAの完全性を維持するために広く改変されている。この適応プロトコルは、すでにRsaA 27、RsaI28とRsaC29の相互作用を解明しました。このアプローチは、細胞表面特性、グルコース取り込み、および酸化ストレス応答の調節機構におけるこれらのsRNAの重要な役割に関する洞察を与えた。
2015年に 大腸菌 で開発され実装されたプロトコルは、最近では非常に詳細に説明されています30.ここでは、非病原性または病原性(安全上の注意)にかかわらず、グラム陽性(より厚い細胞壁)細菌におけるsRNA調節ネットワークの研究に特に適した改変MAPSプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNA 量と質</td></tr><tr><td>250 mL 培養フラスコ</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>2515074</td><td>バクテリア培養</td></tr><tr><td>50mL 遠心分離管</td><td>ファルコン</td><td>352051</td><td>培養遠心分離</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>VWR 化学薬品</td><td>20821.321</td><td>RNA抽出と精製</td></tr><tr><td>アレグラ X-12R 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>細菌ペレット化</td></tr><tr><td>アンピシリン(amp)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9518-5G</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>アミロース樹脂</td><td>新品England BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2-affinity purification</td></tr><tr><td>Anti-dioxigenin AP Fab fragment</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Northern blot assays</td></tr><tr><td>Autoradiography cassette</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Northern blot assays</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>Plasmid construction</td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>増殖培地</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>ノーザンブロットアッセイ (基質)</td></tr> <tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>RNA extraction and purification</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>RNA extraction and精製</td></tr><tr><td>DIG-RNA標識ミックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11277073910</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ロシュ</td><td>4716728001</td><td>DNase治療</td></tr><tr><td>エリスロマイシン(ery)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>増殖培地</td></tr><tr><td>FastPrepデバイス</td><td>MP Biomedicals 116004500</td><td></td><td>機械的溶解</td></tr><tr><td>グアニジウムチオシアン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションチューブ</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A/6960/08</td><td>RNA抽出および精製</td></tr><tr><td>LB(リソジェニーブロス)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>溶解マトリックス B バルク</td><td>MP バイオメディカル</td><td>6540-428</td><td>機械的溶解</td></tr><tr><td>マイクロパルサー エレクトロポレーター</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>プラスミド構造</td></tr><tr><td>ミリQウォーターデバイス</td><td>ミリポア</td><td>Z00QSV0WW</td><td>超純水</td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>RNA/DNA 量と品質</td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>ドミニク・ダットシャー</td><td>10600002</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>洗浄と除染</td></tr><tr><td>フェノール</td><td>カールロス</td><td>38.2</td><td>RNA抽出と精製</td></tr><tr><td>Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530</td><td>プラスミド構造</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>MS2-MBP 製造</td></tr><tr><td>ポリプレップクロマトグラフィーカラム</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2-affinity 精製</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>プラスミド構造</td></tr><tr><td>量子ビット 3 蛍光光度計</td><td>15387293</td><td></td><td>RNA</td></tr><tr><td>量 RNAPro 溶液</td><td>MP バイオメディカル</td><td>6055050</td><td>機械的溶解</td></tr><tr><td>ScriptSeq コンプリートキット</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>cDNA librairiesの調製</td></tr><tr><td>分光光度計 Genesys 20</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>11972278</td><td>細菌培養</td></tr><tr><td>SpeedVac Savant 真空装置</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>DNA120</td><td>RNAの抽出と精製</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>プラスミド構造</td></tr><tr><td>TBE (トリス-ホウ酸-EDTA)</td><td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>プラスミド構造</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>X線フィルムプロセッサー</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr><tr><td>X線フィルム スーパーRX-N</td><td>富士フイルム</td><td>4741019318</td><td>ノーザンブロットアッセイ</td></tr></tbody></table>

グラム陽性菌におけるrnaシーケンシングと結合したms2-アフィニティ精製

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

小さな調節RNA(sRNA)は、生命の細菌領域の間で広く普及しているが、それらの多くの機能は、彼らのmRNA標的を同定するのが難しいため、特に十分に特徴付けられていない。ここでは、RNAシーケンシング(MAPS)技術と組み合わせたMS2-アフィニティ精製の改変プロトコルについて説明し、インビボで特定のsRNAのすべてのRNAパートナーを明らかにすることを目指した。大まかに言えば、MS2アプタマーは、関心のあるsRNAの5'の端部に融合する。この構築物は、次いで生体内で発現され、MS2-sRNAがその細胞パートナーと相互作用することを可能にする。細菌の収穫後、細胞は機械的に取り付けられる。粗抽出物は、以前にマルトース結合タンパク質に融合したMS2タンパク質でコーティングされたアミロースベースのクロマトグラフィーカラムにロードされます。これにより、MS2-sRNAおよび相互作用RNAの特異的な捕獲が可能になります。溶出後、共精製RNAは、ハイスループットRNAシーケンシングとその後のバイオインフォマティクス解析によって同定されます。以下のプロトコルは、ヒトの植物体の黄色 ブドウ球菌 のグラム陽性で実施されており、原則として、任意のグラム陽性菌にトランスポーザブルである。要するに、MAPS 技術は、特定の sRNA の規制ネットワークを深く探索する効率的な手法を構成し、そのターゲットのスナップショットを提供します。しかし、MAPSによって特定された推定ターゲットは、補完的な実験的アプローチによって検証される必要があることを覚えておいてください。

代表的な結果は、S. アウレウス29の RsaC 標的の研究に由来します。RsaCは型破りな1,116 nt-long sRNAである。その5'末端は、その3'の終わり(544 nt)が構造的に独立している間、いくつかの反復領域を含み、そのmRNA標的との全ての予測された相互作用部位を含む。このsRNAの発現は、マンガン(Mn)が不足しているときに誘導され、宿主免疫応答の文脈でしばしば遭遇する。MAPS技術を用いて、RsaCと直接相互作用するいくつかのmRNAを同定し、酸化ストレス(sodA、ldh1およびsarA)および金属関連(znuBC-zurおよびsufCDSUB)応答におけるその重要な役割を明らかにした。 
MS2-sRNAの構造と実験条件の検証 MAPS実験を行う前に、研究したsRNAの発現の最適条件を決定することが重要である。非ネイティブプロモーターが使用される場合、標的が存...

MAPS技術は、生体内の特定の調節RNAの標的を精査するために開発されました。目的のsRNAは、そのRNAパートナーの共精製とRNAシーケンシングによるそれらの同定を可能にするMS2アプタマーでタグ付けされます。この改変プロトコルは、特にグラム陽性菌に適しています。

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MS2-アフィニティ精製は、細菌に関心のあるRNAの標的を同定するために開発されました。この技術により、あらゆる種類のsRNAパートナーを、規制のメカニズムとは無関係に同定することが可能になります。sRNA依存的な調節ネットワークの特性化は、宿主細胞内の細菌の産生、バイオフィルム形成、生存のより良い毒性因子を理解し、最終的にはブドウ球菌感染と戦うのに役立ちます。このプロトコルは、任意の病原性または非病原性グラム陽性細菌に適用することができる。この手順のデモンストレーションは、パスカル・ロンビー博士の研究室の博士課程の学生、ノエミー・メルシエです。まず、pCN51 P3 MS2 sRNAまたはpCN51 P3 MS2プラスミドのいずれかを、3ミリリットルのBHI培地で1コロニーずつ増殖させ、1マイクロリットルのエリスロマイシン当たり10マイクログラムを重複して添加する。エリスロマイシンを添加した新鮮なBHI培地の10ミリリットルで一晩培養を希釈し、0.05のOD 600に達する。180 RPMで6時間揺れで37°Cで文化を育ててください。各培養物を50ミリリットルの遠心分離管に移し、チューブを2,900倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離し、上清を捨て、氷を凍らせ、氷の上にペレットを保持し、直接機械的細胞リシスを行います。機械的な細胞のリシスを行うために、ペレットを5ミリリットルのバッファーAで再懸濁し、リセプドした細胞を3.5グラムのシリカビーズで15ミリリットル遠心分離管に移します。機械的な細胞のライシスの器械に管を挿入し、毎秒4メートルで40秒の周期を実行する。チューブを2,900倍Gで15分間遠心し、上清を回収して氷の上に置きます。上清がはっきりしていることを確認し、そうでなければ遠心分離を繰り返します。柱の先端を取り出し、カラムラックにクロマトグラフィーカラムを入れ、超純水でカラムを洗います。アミロース樹脂の300マイクロリットルを追加し、バッファA.希薄1、6ミリリットルのバッファAでMBP-MS2タンパク質の200パイカモレでカラムを洗浄し、カラムにロードします。10ミリリットルのバッファーAでカラムを洗浄し、次にMS2アフィニティ精製を行います。細胞ライセートをカラムにロードし、きれいなコレクションチューブにフロースルー分画を集めます。10ミリリットルのバッファーAでカラムを3回洗い、洗浄分数を収集し、その後、バッファーEの1ミリリットルで列を溶出し、2ミリリットルマイクロチューブに溶出画分を収集します。RNA抽出まで、収集した分数をすべて氷の上に保管してください。RNA抽出には各分画を1ミリリットル使用してください。RNAに1体積のフェノールを加え、激しく混ぜ、20°Cで10分間Gの16,000倍の遠心分離機を入れます。上相をきれいな2ミリリットルマイクロチューブに移します。クロロホルム・イソアミルアルコールを1巻ずつ加え、遠心分離を繰り返し、上相を新しいチューブに移します。pH 5.2で2.5容量の100%冷エタノールと酢酸モル3モルナトリウムの0.1容量を加え、マイナス20°Cで一晩沈殿します。翌日、チューブを16,000倍Gと摂氏4度で15分間遠心分離します。ピペットでエタノールをゆっくりと取り除き、ペレットを乱さないよう注意してください。80%の冷たいエタノールと遠心分離機の500マイクロリットルを5分間加えます。エタノールをゆっくりとピペットして捨て、実行モードで5分間真空濃縮器を使用してペレットを乾燥させます。ペレットを適量の超純水で再懸濁します。このプロトコルは、S.アウレウスのRsaC標的物を研究するために使用されました。RsaCと直接相互作用するいくつかのmRNAがMAPS技術を使用して同定され、酸化ストレスおよび金属関連応答における重要な役割を明らかにした。MS2 sRNAの構築物を確認し、その発現パターンを可視化するために、BHI培地で2、4、および6時間の成長後に細胞を採取した。RNAを抽出し、ノーザンブロット分析をRsaC特異的DIGプローブを用いて実施した。内因性RsaCのレベルは、成長の6時間後に有意に増加した。重要なことに、MS2-RsaC 544およびMS2-RsaC 1,116のレベルは、6時間で内因性RsaCに匹敵した。アフィニティー精製を行い、粗抽出物からRNAを抽出し、MS2タグ単独で発現する野生型株中のフロースルー、溶出画分と、MS2-RsaC 544構築物を発現する変異型RsaC株を抽出した。1,116ヌクレオチド長い内因性RsaCは溶出画分で濃縮されたが、その長さと複雑な二次構造のためにアフィニティーカラムと非特異的に相互作用した。MS2-RsaC 544は溶出画分で高く富化し、MS2-MBP融合タンパク質によって正常に保持されたことを示しました。生物情報学的分析では、MS2 sRNAとMS2コントロールの間の折り目変化に応じて推定mRNA標的が明らかにされ、sodAが最初の推定標的であることを示した。MS2アフィニティー精製後にsodA特異的DIGプローブを実施したノーザンブロット分析では、SODAがMS2コントロールと比較してMS2-RsaC 544と効率的に共濃縮されたことが示されています。このプロトコルを試みるとき、MS2タグの追加はsRNAの確認、安定性、または機能に影響を与える可能性があることを覚えておいてください。これは注意深く監視する必要があります。MAPSは、sRNA-RNAターゲットのペアリングのスナップショットを提供します。さらなる実験的検証は、その機能を解明します。この技術は、任意の細菌にsRNA調節ネットワークを構築するための強力なツールを表します。

ms2-affinity-purification-coupled-with-rna-sequencing-gram-positive

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro...

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

リボソームRNA（rRNA）の枯渇プロトコルは蚊腸metatranscriptomeのRNA-seqのためのメッセンジャーRNA（mRNA）を豊かにするために開発されました。引き算を介しrRNAを除去するために使用されたサンプル特定のrRNAプローブは、蚊とその腸内微生物から作成されています。プロトコルのパフォーマンスは、rRNAの約90から99パーセントの除去をもたらすことができます。...

モスキートガットメタゲノムRNA-seqのためのリボソームRNAの枯渇

微生物群集の特徴を明らかにすることは、環境微生物学における長年の目標でした。次世代のシーケンシング法により、最小限のコストと労力で、これまでにない深さで微生物群集の特性評価が可能になりました。ここでは、ベンチトップシーケンサーを使用して細菌の16SリボソームRNA遺伝子を配列決定するアプローチについて詳しく説明します。...

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。...

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

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ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S...

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

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細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

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選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

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グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

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