ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成
2021年4月17日
1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。
微小環境は、変化するサイトカイン、リガンド濃度、組成物など、非常に複雑で動的な環境を可能にします。同様の培養環境を作り出すためには、幹細胞の分化、免疫応答、チッププラットフォーム上の臓器の開発などの複雑な生命機械に関するインビトロ研究に不可欠です。しかし、ナノリットル体積とミリ秒の精度の化学信号を生成して提供することは、ピペットのような従来の生物医学的アプローチを使用して困難です。
課題に対応するために、動的な組み合わせと逐次信号入力の代替画像集録生成が可能な培養プラットフォームが高い需要がある。このプロトコルでは、マイクロ流体デバイスの設計と製作手順が提示されます。提案されたマイクロ流体チップは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列およびオンサイト混合弾性率で構成されています。
我々は、単一細胞2次元細胞集団及び三次元神経球に関する研究にプラットフォームが適していることを実証する。チップ上の複雑で動的な環境条件は、神経幹細胞の分化と自己再生に大きな影響を与えます。設計・製作手順の詳細は以下の通りです。
チップ設計は、AutoCAD ソフトウェアを使用して実行されました。顕微鏡上のプレートホルダーのサイズに合わせて、マイクロ流体チップは、サイズが約7×5センチメートルであり、1,500の培養室で構成されています。重要な特徴の1つは8つの流れチャネルおよび200マイクロメートルの制御チャネルから成っている蠕動ポンプを有する。
制御と流路の重なり合う領域の増加は、2002年にスティーブン・クエイクが提案した蠕動ポンプと比較して16倍に増加し、約15ナノリットルの液体に、ポンプサイクルごとに、チップ上で並列に1,500の独立した環境条件を維持する必要性を十分に満たします。装置のもう一つの重要な部分は、せん断のない培養環境を維持することができる2層培養室である。不要なせん断応力は、最上層を素早く通すことによって防止されます。
細胞、組織および重要な条件付き培地は、最下層に手つかずのままです。数値シミュレーションは、液体が培養チャンバーを通って向けられる場合、左から右に向かうことを示唆している。せん断力を効果的に防ぐことができます。
10ミリ/秒の入力流量でも、またはマイクロミリメートルサイズの組織は培養ユニットの底部に邪魔されないままである。UVリソグラフィを用いてレプリカ成形やシリコンウエハを製作した。高さ25マイクロメートル、重量100マイクロメートルの流体チャネルは、SU-8 3025陰性フォトレジストを使用して生成されます。
高さ75マイクロメートルと150マイクロメートルの培養室をSU-8 3075フォトレジストを用いて製造した。AZ50Xポジティブフォトレジストは、良好な接続を確保するために、制御チャネルと重なり合う円形のウェル機能に使用されます。マイクロフルディックチップを製造するために、パターン化されたブランクシリコンウエハを、まずTMCSで処理した。
異なる量のPDMS 10〜1のモノマー対触媒比を、マイナス0.85メガパスカルで真空チャンバー内で1〜2時間完全に混合して脱泡した。制御層は、2,200RPMでスピンコートPDMSにより得られた。次いでシリコンウエハーをインキュベーターに移し、80°Cで60分間インキュベートした。
カスタマイズされた光学デバイスとプラズマエッチング機を使用して、異なる層を整列させ、結合しました。入口穴は、80摂氏でさらに2時間の熱結合後にパンチされた。チップをPDMSコーティングカバースリップに接着し、96ウェルプレートと同じサイズで、使用前に80摂氏グレードで少なくとも12時間硬化した。
操作のために、制御チャネルはプラスチック管を通してミニチュア空気圧ソレノイド弁に接続された。すべてのペンマティックウェルの回転は、グラフィカルユーザーインターフェイスを介してカスタムMATLABプログラムによって制御されました。プッシュアップPDMS膜弁の最適な閉圧は、通常25から30 PSIの範囲のチップごとに個別に決定されました。
一連のウェルを動的に組み合わせ、シーケンシャル入力を切り換えることで、チップ上で生成できます。細胞を80%合流で収穫し、培地DMEMで1ミリリットル当たり6の電力に対する密度で再懸濁し、次いで細胞含有溶液を加圧してチップにロードした。神経幹細胞の付着培養と懸濁培養の両方について、細胞を採取し、球体をチップに直接ロードした。
画像取得には、自動翻訳ステージを備えた反転顕微鏡と、デジタル相補金属酸化物半導体カメラを用いた。ソフトウェアを介して制御されたステージと画像取得は、左上隅と右下隅のチャンバーを選択ポイントとして示し、4倍の対物レンズで予備的なイメージングを得るために整然としたポイントに翻訳段階を移動します。4x対物レンズを20x1で変更し、光強度、露光時間、エトセトラなどの画像パラメータを調整します。
次に、選択点を見つけるので、各チャンバの位置が13で15チャンバマトリックスを残すか、またはプログラムによって自動的に定義されるようにする。チャンバの座標を決定すると、X、Y、Z焦点面が微調整することができる各チャンバーに移動する。イメージングサイクルの間隔と持続時間を設定します。
パスを保存し、イメージングを開始します。このシステムは、明視野における神経幹細胞分化や神経幹細胞球形成過程の蛍光場など、さまざまな標的動的追跡に利用できます。データ分析。
カスタム MATLAB プログラムを使用して、nd2 の形式を Tif に変更します。そして、ポイントに従ってデータを分割します。分析対象の対象を選択する、細胞または組織である。
解析するしきい値、オブジェクトサイズ、ノイズサイズを入力します。または、最適なパラメータにステップバイステップの分析を選択することもできます。そして、すべてのデータを分析します。
結果を MAT 形式で保存した後、プロットを使用して結果またはトレースを描画します。本論文では、生細胞微小環境動的制御のためのフォトリソグラフィー技術に基づくハイスループットマイクロ流体チップシステムのプロトコルと培養について述べた。また、PDMS膜弁の閉圧やチャンバの平行流体のスピン制御など、慎重に制御すべきいくつかのパラメータについても説明しました。
従来の細胞インビトロ培養では、細胞培養環境の処理は手作業で行われ、これは時間がかかり、手間がかかり、流体充填は標準的な制御が容易ではない。特に溶液の分。入力の生成、免疫薬濃度、大量消費など、いくつかの問題があります。
しかし、当社のマイクロ流体系を用いて、単一流体等量の均一濃度の固定用量で刺激剤として繰り返し、異なる培養チャンバー内の異なる培養を同時に比較することができる。いくつかのミニチュア時間的解像度バック刺激と流体を調節することによって解像度を小さくすることで異なります。また、簡易操作により、多くの比較実験結果を得ることができます。
当社のシステムは拡散の原理に基づいており、細胞微小環境への機械的撹乱を最小限に抑えます。より安定した細胞微小環境チップのために、培養層の深度としてバッファ層のリストを増やしたり、培地交換の入力流体を減らしたり、細胞挙動の研究のためにここにある圧力を減らすことができます。この研究は、3T3およびNSC細胞の培養のみを調べたことに注目される。
他の細胞または細胞株の場合、それを調整するための我々のパラメータと同等の培養条件。
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概要
この研究は、複雑な生命機構の高スループット分析のために設計されたマイクロ流体システムを提示します。このシステムは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプ、そして現場ミキシングモジュールを特徴とし、in vitroで動的な微小環境条件のシミュレーションを可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- マイクロ流体工学
- 細胞培養
- in vitroモデリング
背景
- 微小環境は複雑な生物学的プロセスを研究する上で重要です。
- 従来の方法では動的な化学シグナリングの再現が難しいです。
- 正確な化学シグナルを送達できるプラットフォームが必要とされています。
- この研究はマイクロ流体デバイスの設計と製造に取り組んでいます。
研究の目的
- in vivoの条件を模倣する培養プラットフォームを作成すること。
- 幹細胞分化と免疫応答の研究を促進すること。
- オルガンオンチッププラットフォームの開発を可能にすること。
使用された方法
- マイクロ流体チップの設計と製造。
- 強化された蠕動ポンプの統合。
- 現場ミキシングモジュールの実装。
- 動的なシグナル入力生成のためのシステムテスト。
主要な結果
- マイクロ流体システムは複雑な微小環境条件を正確にシミュレートすることに成功しました。
- 化学シグナルを正確に制御しながら、高スループット研究を可能にします。
- in vitro生物学的研究をサポートする効果を実証しました。
- 幹細胞研究と器官発達における潜在的な応用があります。
結論
- 開発されたマイクロ流体プラットフォームは、in vitro研究にとって重要な進歩です。
- 生物学と神経科学の分野の研究者にとって多用途なツールを提供します。
- 将来の研究はこの技術を生物医学研究の様々な応用に活用できるでしょう。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Dynamic microenvironmental control is a critical inflection point for predictive in vitro modeling in early discovery and preclinical research. This high-throughput microfluidic platform enables nanoliter-scale, millisecond-precision delivery of combinatorial and sequential signals, supporting robust hypothesis testing and mechanistic de-risking. Its scalability and reproducibility position it as a reusable asset for portfolio-wide target validation and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular responses to dynamic, physiologically relevant environmental cues.
- Supports functional target validation by controlling ligand and cytokine exposure sequences.
- Facilitates mechanistic de-risking through parallelized, quantitative assessment of differentiation and self-renewal markers.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, shear-free biological systems for high-throughput compound evaluation.
- Standardizes assay conditions across 1,500 independent culture units for reproducibility.
- Enables quantitative, automated readouts for robust screening data.
- Accelerates assay development by supporting rapid iteration of environmental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with disease-relevant microenvironmental dynamics.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex input regimens.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions based on marker expression and morphological outcomes.
- Facilitates translational biomarker exploration in controlled, multiplexed settings.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system bridges early discovery, screening, and preclinical research by enabling dynamic environmental manipulation and high-content analysis in a single platform.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering precise, programmable signal inputs.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility with automated, parallelized culture control.
- Analytics: Delivers quantitative, image-based outputs for comparative analysis of cellular responses.
- Translational Research: Enables modeling of disease-relevant conditions and biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, adaptable platform for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for high-throughput studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, multiplexed experimentation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement across multiple discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device operation and image-based data analysis.
- Needs access to automated microscopy and custom analytical software infrastructure.
- Demands cross-team standardization of input parameters and data formats.
- Adaptation of culture conditions may be necessary for different cell types or models.
- Practical limitations include initial setup complexity and parameter optimization for new applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:23
Microfluidic Chip Design
4:33
Chip Fabrication and Operation
5:32
Microfluidic Chip Production using Soft Lithograph
7:03
Chip Operation
7:59
Generation of Dynamic Inputs in Cellular Microenviroments
8:43
Setup for High Throughput Live-cell Imaging
10:44
Automatic Data Analysis
11:42
Discussion
