Name: ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶ ハイスループットマイクロ流体装置の設計・製造法。1,500個の培養ユニットと統合型蠕動ポンプを用いて、神経幹細胞の分化と自己更新に及ぼす動的環境条件の効果を解析する方法です。

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著者は、チャンセン楽器(中国)株式会社の志豊成からの技術サポートを認める。この研究は助成金(中国国立自然科学財団,51927804)によって支えられました。

1. マイクロ流体チップ設計
<ol><li>18個の入口からなるマイクロ流体マルチプレクサを設計し、各々は個々のバルブと蠕動ポンプによって制御されます。ポンプサイクルごとに駆動される液体体積を増加させるために、蠕動ポンプを3つの制御チャネルで構成し、意図的に200μmに拡大し、10本の接続流線を有する。</li>
	<li>せん断のない文化室を設計します。2レベル培養ユニットの複製は、低い細胞培養チャンバー(400 μm x 400 μm x 150 μm)とより高いバッファ層(400 μm x 400 μm x 75 μm)によって構成され、培地交換時の細胞に対する不要なせん断応力を防ぎます(図1)。</li>
	<li>ハイスループット機能を設計します。培養単位を複製して30 x 50の行列レイアウトを形成し、約7cm×5cmの面積を占める。</li>
</ol>2. チップの製造と操作
<ol><li>UVリソグラフィによるレプリカ成形の製作 注:レプリカ成形は、標準的なフォトリソグラフィプロトコル8に従ってシリコンウエハで製造されました。<ol>
<li>チャネル構造の製造<ol>
<li>回転フォトレジスト:SU-8 3025のマイナスフォトレジストのスピンコート5mLをシリコンウエハー上で500rpmで10s、3000rpmで30s。</li>
			<li>ソフトベーク:ウエハーを65°Cのホットプレートに2分間置き、95°Cで10分間置き、室温まで冷やします。</li>
			<li>アライメントと硬化:アライザのホルダーにウエハーとマスクを固定し、18 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。</li>
			<li>プレポスト露光ベーク:室温から110°C/hで95°Cにウエハーをランプアップし、取り外すまで少なくとも40分を保ちます。</li>
			<li>開発:ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、2.5分間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、高さ25μmのチャネル構造を得ます。</li>
			<li>ハードベーク:ウエハースをガラスペトリ皿で覆い、65°Cで2分間焼き、120°C/hで160°Cまでランプアップし、3時間保ちます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>バッファー層を用いて細胞培養チャンバーを製造する<ol>
<li>ステップ2.1.1.1のパラメータを使用して、上記のウエハー上のSU-8 3075陰性フォトレジストの7mLをスピンコートします。</li>
			<li>柔らかいベーク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハと、ウエハ上のマーカーとよく合うようにマスクを変更します。その後、24 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。</li>
			<li>ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、4分40秒間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、以前に作り上げた高さ25μmの高い層構造を75μmの高層構造にします。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)は、複雑な構造を強くするためにウエハを焼く。</li>
			<li>ステップ 2.1.2.1-2.1.2.3 を繰り返して、層構造に積み重ねる高さ75 μm のチャンバー構造を作製します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>バルブ構造の作製<ol>
<li>ステップ2.1.1.1のパラメータを用いて、上記ウエハ上のAZ50x陽性フォトレジストの5mLをスピンコートした。</li>
			<li>柔らかいベイク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハを、マスクをウエハのマーカーとうまく整列させ、それから20 sのために、そして30 sのためにすぐに消灯する。5つの円でライトオン/オフ手順を繰り返して、露出したフォトレジストを治します。</li>
			<li>ウエハーを一致させた開発者に浸し、約8分間攪拌して冗長なフォトレジストを洗い流し、制御チャネルと重なる丸い形のバルブを取得して良好な接続を確保します。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)全体のモデルを強くするためにパターン化されたウエハー。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ソフトリソグラフィによるマイクロ流体チップ製造<ol>
<li>パターン化されたブランクシリコンウエハースをリメチルクロロシランで15分間処理します。</li>
		<li>50gの流れ層、20gの制御層2、および20gの膜に対応するPDMSゲル(10:1のモノマー/触媒比)の3部をそれぞれ調製する。</li>
		<li>パターン化されたシリコンウエハに50gのPDMSゲルをキャストし、真空チャンバーで-0.85 MPaで1〜2時間脱ガスしてフロー層をコピーします。</li>
		<li>PDMSの20gの2部を脱気し、2000-2800rpmでパターン化されたウエハとブランクシリコンウエハ上で30sで回転させ、制御層および膜層を作製する。</li>
		<li>PDMSで覆われたウエハースを80°Cで60分間換気オーブンに入れてインキュベーションします。</li>
		<li>カスタマイズされた光学デバイス(100xズーム)とプラズマエッチング機を介して、異なる層を一緒に整列させ、接着します。その後、80°Cで2時間換気オーブンに保管し、チップの接着を強化します。</li>
		<li>チップに入口穴を開け、PDMSコーティングされたカバースリップに接着し、使用前に80°Cで少なくとも12時間硬化します。</li>
	</ol></li>
	<li>チップ操作<ol>
<li>小型空気圧ソレノイドバルブをチップの制御層に接続し、カスタマイズされたMATLABグラフィカルユーザインターフェース8 を開いてスイッチをリンクおよび制御します。</li>
		<li>プッシュアップPDMS膜バルブの閉圧を25 psiに設定します。</li>
		<li>動的に変化するコンビナトリアル/シーケンシャル入力を、バルブのタイムリーなオンオフによって、指定されたチャンバー(図2d)に提供します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞マイクロ環境における動的入力の生成
<ol><li>チップ処理と細胞ローディング<ol>
<li>顕微鏡の標準的な培養条件(37°C、5%CO2)を5時間以上維持してください。</li>
		<li>チップにコーティング媒体(すなわち、NOTEに記載されている)を充填し、標準培養条件(ステップ3.1.1に記載)で少なくとも1時間インキュベートする。</li>
		<li>チップをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または細胞培養培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地DMEM)で洗い流し、健康的な培養環境を構築します。</li>
		<li>80%合流で細胞を収穫し、培養培地(DMEM)を用いて細胞を~106/mLの密度で再懸濁した。次に、細胞含有溶液を加圧して細胞をチップにロードする。 注:チップ上の異なる細胞株を培養するには、細胞培養チャンバーを処理するために対応するコーティング媒体が必要です。典型的には、培養チャンバを制御する全ての弁を開いた3T3線維芽細胞およびヘンの付着培養物の実験のために、細胞は同じカラム内のすべての培養チャンバーに流入する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高スループットライブセルイメージングのセットアップ 注:画像取得には、自動翻訳ステージとデジタル相補金属酸化物半導体(CMOS)カメラを備えた反転顕微鏡を使用しました。ステージと画像の取得は、カスタマイズされたソフトウェアを介して制御されました。<ol>
<li>明視野の10x対物レンズを使用して培養チャンバーのマトリックスを可視化し、30 x 50室マトリックスの各チャンバの位置座標を肯定し、定義します。</li>
		<li>対物レンズを20xまたは40倍に変換し、希望するチャンバの位置座標を選択し、確認後に翻訳段階が割り当てられた位置に移動します。最適なイメージを得るために、x、y、z の焦点面を微調整します。</li>
		<li>最適な光強度、露光時間、および他の画像化されたパラメータは、各チャネル(すなわち、明視野および蛍光イメージング)ごとに個別に決定された。</li>
		<li>イメージングサイクルの間隔と持続時間を設定し、パスを保存してからイメージングを開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li>
<li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets%3A+reducing+reliance+on+external+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li>
<li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%3A+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li>
<li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li>
<li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
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<li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li>
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<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li>
<li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16(2018).</li>
<li>Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li>
<li>Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microfluidics%3A+opportunity+for+bioprocess+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li>
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<li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li>
<li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li>
<li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+%28dimethylsiloxane%29+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多重化および複雑な実験17、18、19、20を実行するために様々なマイクロ流体装置が開発されている。例えば、トポロジカルな凹部の配列からなるマイクロウェルは、外力を使用せずに個々の細胞をトラップすることができ、小さなサンプルサイズ、並列化、低材料コスト、より速い応答、高感度21、22、23、24を含む有利な文字を示す。液滴と表面張力を閉じ込められた液滴は、マイクロポンプなどの補助ハードウェアの必要性を排除し、液滴の輸送をより低コストで、環境に配慮した25、26<...

高スループット技術は、生物医学および臨床研究にとって極めて重要です。何百万もの化学的、遺伝的、または生細胞およびオルガノイドの検査を並行して行うことで、研究者は生体分子経路を調節する遺伝子を迅速に同定し、特定のニーズに合わせて連続的な薬物入力をカスタマイズすることができます。ロボット1とマイクロ流体チップをデバイス制御プログラムと組み合わせて、細胞/組織操作、液体処理、イメージング、およびデータ処理/制御2,3をカバーする複雑な実験手順を自動化することができます。したがって、所望のスループット4,5に従って、1つのチップ上で数百、数千の実験条件を維持することができる。
このプロトコルでは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプおよびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体装置の設計および製造手順について説明した。2レベルの細胞培養チャンバーは、培地交換時に不要なせん断を防ぎ、長期の生細胞イメージングのための乱れない培養環境を保証します。この研究は、提案されたマイクロ流体装置が複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームであることを示している。さらに、マイクロ流体チップの高度な機能により、常に変化するサイトカインおよびリガンド組成物6、7のような非常に複雑で動的な微小環境条件の自動再構成が可能となり、96ウェルプレートのような従来のプラットフォームでは数ヶ月かかる。

<table><tbody><tr><td>2713 Loker Avenue West</td><td>Torrey pines scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ-50X</td><td>AZ Electronic Materials, Luxembourg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator HP151</td><td>Heal Force</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desktop Hole Puncher for PDMS Chips WH-CF-14</td><td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM(L-グルタミン、高グルコース、ヘノールレッド)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子天びん UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g</td><td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronection 0.25 mg/mL</td><td>ミリポア、オーストリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating Incubator BGG-9240A</td><td>Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン モデル エクリプス Ti2-E</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペン/溶連菌 10 ユニット/mL ペニシリン 10 ug/mL ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー PDC-002</td><td>ハリック プラズマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>モメンティブ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリリジン 0.01%</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター ARE-310</td><td>粟鳥連太郎</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター TDZ5-WS</td><td>センス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター WH-SC-01</td><td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3075</td><td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

生体内の環境条件を模倣することは、複雑な生命機械に関するインビトロ研究にとって極めて重要である。しかし、生きた細胞や臓器を標的とする現在の技術は、ロボット工学のような非常に高価であるか、液体操作においてナノリットル体積とミリ秒の時間精度を欠いている。ここでは、1,500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、およびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体システムの設計と製造を提示する。マイクロ流体デバイスの容量を実証するために、神経幹細胞(NSC)球体は提案されたシステムで維持される。我々は、NSC球体が1日目にCXCLに曝露され、2日目にEGFにさらされると、丸型の立体構造が良好に維持されることを観察した。6つの薬剤の入力順序の変動は、NSC球体およびNSCステムの発現レベル代表マーカー(すなわち、Hes5およびDcx)に形態学的変化を引き起こす。これらの結果は、動的で複雑な環境条件がNSC分化および自己再生に大きな影響を及ぼすことを示しており、提案されたマイクロ流体デバイスは、複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームである。

従来のオンチップペリスタチックポンプは、2000年にスティーブン・クエイクによって最初に記述され、そのパターン101、100、100、110、010、011、001、0018、10によって蠕動を作動させた。 0 と 1 の数値は、3 本の水平制御線の「開く」と「閉じる」を示します。3つ以上のバルブ(例えば、5つ)を用いた研究も11.3つの制御ラインと3つの流れラインによって構成される蠕動性ポンプはナノリットルの正確さを提供するが、輸送速度は1,500の培養室を供給するには遅すぎる。この問題を解決するために、ポンプサイクルごとに駆動される液体体積を増加させるフローライン(すなわち、10個の接続チャネル)を含む(すなわち、101、100、110、010、011、001)。したがって、栄養素および薬物は、指定されたチャンバーに効果的に送達することができる。蠕動ポンプ輸送液量は、ポンプサイクルあたり16倍〜50ナノリットル増加することができる。蠕動ポンプの配列は3つの接続された制御...

1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

微小環境は、変化するサイトカイン、リガンド濃度、組成物など、非常に複雑で動的な環境を可能にします。同様の培養環境を作り出すためには、幹細胞の分化、免疫応答、チッププラットフォーム上の臓器の開発などの複雑な生命機械に関するインビトロ研究に不可欠です。しかし、ナノリットル体積とミリ秒の精度の化学信号を生成して提供することは、ピペットのような従来の生物医学的アプローチを使用して困難です。課題に対応するために、動的な組み合わせと逐次信号入力の代替画像集録生成が可能な培養プラットフォームが高い需要がある。このプロトコルでは、マイクロ流体デバイスの設計と製作手順が提示されます。提案されたマイクロ流体チップは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列およびオンサイト混合弾性率で構成されています。我々は、単一細胞2次元細胞集団及び三次元神経球に関する研究にプラットフォームが適していることを実証する。チップ上の複雑で動的な環境条件は、神経幹細胞の分化と自己再生に大きな影響を与えます。設計・製作手順の詳細は以下の通りです。チップ設計は、AutoCAD ソフトウェアを使用して実行されました。顕微鏡上のプレートホルダーのサイズに合わせて、マイクロ流体チップは、サイズが約7×5センチメートルであり、1,500の培養室で構成されています。重要な特徴の1つは8つの流れチャネルおよび200マイクロメートルの制御チャネルから成っている蠕動ポンプを有する。制御と流路の重なり合う領域の増加は、2002年にスティーブン・クエイクが提案した蠕動ポンプと比較して16倍に増加し、約15ナノリットルの液体に、ポンプサイクルごとに、チップ上で並列に1,500の独立した環境条件を維持する必要性を十分に満たします。装置のもう一つの重要な部分は、せん断のない培養環境を維持することができる2層培養室である。不要なせん断応力は、最上層を素早く通すことによって防止されます。細胞、組織および重要な条件付き培地は、最下層に手つかずのままです。数値シミュレーションは、液体が培養チャンバーを通って向けられる場合、左から右に向かうことを示唆している。せん断力を効果的に防ぐことができます。10ミリ/秒の入力流量でも、またはマイクロミリメートルサイズの組織は培養ユニットの底部に邪魔されないままである。UVリソグラフィを用いてレプリカ成形やシリコンウエハを製作した。高さ25マイクロメートル、重量100マイクロメートルの流体チャネルは、SU-8 3025陰性フォトレジストを使用して生成されます。高さ75マイクロメートルと150マイクロメートルの培養室をSU-8 3075フォトレジストを用いて製造した。AZ50Xポジティブフォトレジストは、良好な接続を確保するために、制御チャネルと重なり合う円形のウェル機能に使用されます。マイクロフルディックチップを製造するために、パターン化されたブランクシリコンウエハを、まずTMCSで処理した。異なる量のPDMS 10〜1のモノマー対触媒比を、マイナス0.85メガパスカルで真空チャンバー内で1〜2時間完全に混合して脱泡した。制御層は、2,200RPMでスピンコートPDMSにより得られた。次いでシリコンウエハーをインキュベーターに移し、80°Cで60分間インキュベートした。カスタマイズされた光学デバイスとプラズマエッチング機を使用して、異なる層を整列させ、結合しました。入口穴は、80摂氏でさらに2時間の熱結合後にパンチされた。チップをPDMSコーティングカバースリップに接着し、96ウェルプレートと同じサイズで、使用前に80摂氏グレードで少なくとも12時間硬化した。操作のために、制御チャネルはプラスチック管を通してミニチュア空気圧ソレノイド弁に接続された。すべてのペンマティックウェルの回転は、グラフィカルユーザーインターフェイスを介してカスタムMATLABプログラムによって制御されました。プッシュアップPDMS膜弁の最適な閉圧は、通常25から30 PSIの範囲のチップごとに個別に決定されました。一連のウェルを動的に組み合わせ、シーケンシャル入力を切り換えることで、チップ上で生成できます。細胞を80%合流で収穫し、培地DMEMで1ミリリットル当たり6の電力に対する密度で再懸濁し、次いで細胞含有溶液を加圧してチップにロードした。神経幹細胞の付着培養と懸濁培養の両方について、細胞を採取し、球体をチップに直接ロードした。画像取得には、自動翻訳ステージを備えた反転顕微鏡と、デジタル相補金属酸化物半導体カメラを用いた。ソフトウェアを介して制御されたステージと画像取得は、左上隅と右下隅のチャンバーを選択ポイントとして示し、4倍の対物レンズで予備的なイメージングを得るために整然としたポイントに翻訳段階を移動します。4x対物レンズを20x1で変更し、光強度、露光時間、エトセトラなどの画像パラメータを調整します。次に、選択点を見つけるので、各チャンバの位置が13で15チャンバマトリックスを残すか、またはプログラムによって自動的に定義されるようにする。チャンバの座標を決定すると、X、Y、Z焦点面が微調整することができる各チャンバーに移動する。イメージングサイクルの間隔と持続時間を設定します。パスを保存し、イメージングを開始します。このシステムは、明視野における神経幹細胞分化や神経幹細胞球形成過程の蛍光場など、さまざまな標的動的追跡に利用できます。データ分析。カスタム MATLAB プログラムを使用して、nd2 の形式を Tif に変更します。そして、ポイントに従ってデータを分割します。分析対象の対象を選択する、細胞または組織である。解析するしきい値、オブジェクトサイズ、ノイズサイズを入力します。または、最適なパラメータにステップバイステップの分析を選択することもできます。そして、すべてのデータを分析します。結果を MAT 形式で保存した後、プロットを使用して結果またはトレースを描画します。本論文では、生細胞微小環境動的制御のためのフォトリソグラフィー技術に基づくハイスループットマイクロ流体チップシステムのプロトコルと培養について述べた。また、PDMS膜弁の閉圧やチャンバの平行流体のスピン制御など、慎重に制御すべきいくつかのパラメータについても説明しました。従来の細胞インビトロ培養では、細胞培養環境の処理は手作業で行われ、これは時間がかかり、手間がかかり、流体充填は標準的な制御が容易ではない。特に溶液の分。入力の生成、免疫薬濃度、大量消費など、いくつかの問題があります。しかし、当社のマイクロ流体系を用いて、単一流体等量の均一濃度の固定用量で刺激剤として繰り返し、異なる培養チャンバー内の異なる培養を同時に比較することができる。いくつかのミニチュア時間的解像度バック刺激と流体を調節することによって解像度を小さくすることで異なります。また、簡易操作により、多くの比較実験結果を得ることができます。当社のシステムは拡散の原理に基づいており、細胞微小環境への機械的撹乱を最小限に抑えます。より安定した細胞微小環境チップのために、培養層の深度としてバッファ層のリストを増やしたり、培地交換の入力流体を減らしたり、細胞挙動の研究のためにここにある圧力を減らすことができます。この研究は、3T3およびNSC細胞の培養のみを調べたことに注目される。他の細胞または細胞株の場合、それを調整するための我々のパラメータと同等の培養条件。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激

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多孔質媒体中の金属酸化物の微生物沈殿を調査するためのマイクロ流体プラットフォーム

学ぶ ハイスループットマイクロ流体装置の設計・製造法。1,500個の培養ユニットと統合型蠕動ポンプを用いて、神経幹細胞の分化と自己更新に及ぼす動的環境条件の効果を解析する方法です。

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

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