4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いた カエノラブディティス・エレガンス 胚発生の解明

4D顕微鏡は、C.elegansの胚やその他の標本の完全な細胞系統を単一細胞レベルで再構築するための貴重なツールです。ノマルスキー光学系は、トランスジェニック動物や蛍光顕微鏡を必要とせずに、標準的な顕微鏡や透過光を用いて、開発中の細胞形状変化を強調することができます。4D顕微鏡は、C.elegansや哺乳類、組織細胞培養などの他のシステムにおける細胞の循環、増殖、分化、およびアポトーシスを研究することを可能にします。

DIC画像上の細胞系譜のトレースは手動で行います。これには時間がかかり、完全な胚分析を行うにはある程度の練習が必要です。その手順を実演するのは、当研究室の技術者であるベゴナ・エズクラです。

胚を調製する前に、4D顕微鏡の記録温度を摂氏15、20、または25度に調整し、顕微鏡を1、500、30の焦点面zスタックを1ミクロン間隔で記録するように設定し、各スタックの開始間に30秒間隔で記録します。次に、500〜1000マイクロリットルの液体4.5%寒天を3ミリメートルのガラス管に分注し、乾燥を防ぐためにチューブをワックスフィルムで慎重に密封します。記録用の薄く均質な寒天パッドを準備するには、寒天が溶けるまでアルコールバーナーで寒天を慎重に加熱し、アリコートし、チューブを摂氏80度のヒートブロックに置きます。

ガラス顕微鏡スライドをプラスチック片に置き、片手で牧草地のピペットを使用して、溶けた寒天の小さな滴をスライドの中央に置き、すぐにもう一方の手で2番目のスライドを寒天ドロップに置き、非常に薄い寒天パッドを作成します。胚をマウントするには、まずピッカーを使用して、5〜10個の妊娠した雌雄同体を、実体顕微鏡で水で満たされた時計メーカーのガラスに移します。メスを使用して雌雄同体の線虫を切り開き、子宮から1〜4個の初期の卵子を抽出します。

トップスライドを寒天パッドからそっと滑り落ちさせ、毛細管を使用して初期の卵をパッドの中央に置きます。必要に応じて爪楊枝の先に接着したまつげで卵の位置を調整し、キャピラリーピペットで余分な水分を取り除きます。メスを使用して、マイクロピペットを使用して寒天パッドの周囲のスペースの3/4を水で満たす前に、メスを使用してカバースリップを準備の上にゆっくりと斜めに垂らします。

次に、カバースリップをワセリンで密封して、長時間の録音時の乾燥を防ぎます。シール後、スライドを4D顕微鏡ステージに置き、低倍率の対物レンズを使用して胚に焦点を合わせます。100X immersion 対物レンズを選択し、コンデンサーの焦点を合わせます。

コンデンサーの開口部を完全に開き、フィールドダイアフラムを閉じて、より高い開口数とより高い解像度を提供します。Wollastonプリズムを回して、片側が照らされた胚の3次元画像を取得し、次にプリズムを反対方向に回して、胚が反対側で照らされた効果を得て、4D記録を開始します。4Dムービーで記録された胚の細胞系譜再構築を行うには、系統追跡ソフトウェアを開き、FileとNew projectを選択します。

記録温度に応じて適切な細胞系譜テンプレートを選択し、スキャン回数を1500に設定します。スキャン間隔は30秒、レベルカウントは30秒、レベル間の距離は1ミクロンです。画像ファイルが保存されている画像ファイル、形式、およびディレクトリを選択します。

画像を単一画像として保存するか、複数画像zスタックとして保存するかを選択し、ファイルの命名と画像形式を設定します。次に、「チャンネル処理が有効」をクリックして、4Dムービーの適切なライトチャンネルを検出して設定します。細胞系譜のトレーシングを行うには、細胞系譜のトレーシングソフトウェアを起動します。

ビデオウィンドウとセルリネージウィンドウが表示されます。系統ウィンドウで、系統ブランチを選択し、ビデオウィンドウでこのセルに対応する細胞核をクリックします。4Dムービーを前後に再生したり、レベルを上下に再生したりして、関心のあるセルを時間とともに空間的に追跡します。

細胞核を定期的にクリックして、系統分岐に点を生成し、特定の時間における細胞の空間座標を登録します。その結果、細胞系譜の進行や胚の3D再構築が可能になります。次に、リターンキーを押して有糸分裂をマークし、先ほど示したように、細胞の進行を追跡するために娘細胞の1つを選択します。

残りの胚細胞について分析を繰り返して、完全な細胞系譜を追跡したり、アポトーシスを受けている細胞などの特定の目的細胞を追跡したりします。目的の変異系統とステレオタイプの野生型C.elegans細胞系統との比較を可能にするため。ウォームプレートは、結露を避けるために段ボール箱内でインキュベートされます。

記録が完了したら、示されているように、系統追跡ソフトウェアを使用して細胞系統を再構築できます。例えば、この代表的な解析では、追跡したgsr-1変異胚細胞系統をC.elegans野生型系統と比較した。そして、胚発生中の細胞周期の進行性遅延の検出が明らかになりました。

その結果、突然変異した胚は中間段階で停止しましたが、野生型の胚は進行し、最終的に幼虫として孵化しました。さらに、アポトーシスなど、胚発生の他の重要な特徴は、4D顕微鏡を使用して動的に視覚化できます。DIC イメージのリネージュ トレースは、手動で処理する必要があります。

発生の初期段階における可視光線上での標識のない細胞のソフトウェア処理は、胚解析には正確ではありません。画像認識システムを可視光顕微鏡の分野に応用することで、発生生物学の分野に大きな進歩をもたらすでしょう。