Name: ラットにおける急性および慢性の運動チック発現モデルの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶラットにおける運動チック発現モデルの作成法。GABA A拮抗薬を用いた急性・慢性の両モデルにより、トゥレット症候群などのチック障害のメカニズム解明と治療法開発に貢献する貴重な研究手法を紹介します。

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この研究は、イスラエル科学財団(ISF)助成金(297/18)によって部分的に支持されました。著者らは、急性げっ歯類モデルを確立したM.ブロンフェルドとM.イスラエルアシビリのコメントに感謝する。

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著者らは開示するものは何もない。

本稿では、自由に行うラットにおけるチック誘導のための急性および慢性モデルのプロトコルを詳述した。これらのプロトコルは、すべてのコンポーネントの調製、手術、および特定の研究ニーズを満たすためにカスタマイズに適応することができる実験プロセスを記述します。これらのモデルの根底にある主な原理は、線条体の運動領域へのビキュクリンの直接局所適用であり、これは、10、11、12の病態生理学において重要な役割を果たすることが知られている。両方のモデルで、ビキュクリンはカスタムメイドの埋め込みカニューレを介してターゲットに送達される。特定のカニューレ注入ターゲットは、チック発現の所望の身体位置に依存する。線条体は、27、28、29、30に組織されたソーマトピータで...

チックスは、トゥレット症候群(TS)および他のチック障害の決定的な症状である。チックは、突然、急速、再発運動(運動チック)、または発声(ボーカルチック)1として記述されています。チック式は、通常、時間(周波数)2および空間(強度、身体位置)3プロパティで、複数の時間スケール(時間、日、月、年)で変動します。これらの変更は、環境機能4、5、 行動状態6、7、および自主的および一時的な抑制8などのさまざまな要因によって影響を受けます。
運動チックを支配する神経機構はまだ完全には理解されていないが、理論および実験的研究の増加は、その性質に関する新たな証拠を提供している9.現在、ticの発生の病態生理は、コルチコ基底核(CBG)ループを伴うと考えられているが、具体的には線条体の異常な阻害と関連している、第一基の基底核入力核10、11、12。げっ歯類および霊長類の以前の研究は、ビキュクリンおよびピクロトキシン13、14、15、16、17、18のような異なるGABAAアンタゴニストの局所適用によって線条体が抑制され得ることを実証した。この薬理的介入は、注射に対する反対側の一過性の運動チック発現につながり、したがって、顔および構築有効性を有するチック障害の堅牢な急性モデルを確立する。急性モデルは、誘発が容易であり、チック発現の前後の電気生理学的および運動学的記録と同時に電気および光学的刺激などの短期変調の効果を研究することを可能にする。しかしながら、急性モデルは注射後の短期間に限定される。急性モデルに基づいて、我々は最近、皮下移植されたミニ浸透ポンプ19を介して線条体へのビキュクリンの長期にわたる固定速度注入を利用するラットにおけるチック生成の慢性モデルを提案した。このモデルは、チック表現の期間を複数の日/週に拡張します。ビキュクリンの長期間にわたる絶え間ない放出により、薬理学的治療や行動状態などの様々な要因がチック発現に及ぼす影響を調べることができる。
ここでは、ラットにおけるチック発現の急性および慢性モデルを生成するためのプロトコルを提示する。特定の研究課題の機能として、プロトコルは、一方的対二国間移植、チックの部位(線条体の基腫組織に従う)18 およびインプラントカンヌラの角度(追加の埋め込み装置の位置に応じて)を含むパラメータの微調整を可能にする。慢性モデルで使用される方法は、部分的に市販製品に基づいていますが、チックモデルに適合するように重要な調整を行います。この記事では、これらのティック モデルをカスタマイズするために必要な調整について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>アンカーねじ</td><td>マイクロファスナー</td><td>SMPPS0002</td><td>#0 x 1/8 - なべ頭板金ねじ</td></tr><tr><td>Bicuculline methiodide</td><td>シグマ Aldrich</td><td>14343</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート (CA) アクセラレータ</td><td>Zap</td><td>PT29</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート (CA) 接着剤</td><td>BSI</td><td>IC-2000</td><td>この接着剤は、他の接着剤よりも強いことがわかりました</td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>コルテン</td><td>H00322</td><td>ハイジェニックパーマ リペア マテリアル リライン レジン セルフキュア</td></tr><tr><td>グルー ゲル</td><td>ロックタイト</td><td></td><td>ウルトラゲル</td></tr><tr><td>コントロール止血</td><td>WPI</td><td>501242</td><td>約 14 cm サイズの止血剤で十分です</td></tr><tr><td>ハイポチューブ、極薄壁 25G</td><td>部品供給会社</td><td>HTX-25X</td><td></td></tr><tr><td>ハイポチューブ、レギュラーウォール 22G</td><td>部品供給会社</td><td>HTX-22R</td><td></td></tr><tr><td>ハイポチューブ、レギュラーウォール30G</td><td>コンポーネント供給会社</td><td>HTX-30R</td><td></td></tr><tr><td>輸液ポンプマシン</td><td>新時代ポンプシステム</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>ミニ浸透圧ポンプ</td><td>ALZET</td><td>2001</td><td>1.0&micro;1時間あたりのl、7日間</td></tr><tr><td>PE互換接着剤</td><td>CEYS</td><td></td><td>特殊難解プラスチック(PEに適しています)</td></tr><tr><td>PE-10カテーテルチューブ</td><td>ALZET</td><td>PE-10</td><td>ID = 0.28mm、OD = 0.61mm精密</td></tr><tr><td>ガラスマイクロシリンジ、10&micro;l</td><td>ハミルトン</td><td>80065</td><td>1701 RNR 10&micro;l syr (22s/51/3)</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>3M</td><td>1469Sb</td><td>Vetbond</td></tr><tr><td>チューブアダプター</td><td>CMA</td><td>3409500</td><td></td></tr><tr><td>タイゴン マイクロボア チューブ、0.02 インチ ID * 0.06</td><td>OD 部品供給会社</td><td>TND80-020</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤー 0.005 インチ</td><td>部品供給会社</td><td>GWX-0050</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤー 0.013 インチ</td><td>部品供給会社</td><td>GWX-0130</td><td></td></tr></tbody></table>

ラットにおける急性および慢性の運動チック発現モデルの生成

Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats

運動チックは、トゥレット症候群および他のチック障害の主要な症状である突然の、急速な、再発運動である。このチック生成の病態生理は、大脳基底核の異常阻害、特にその一次入力構造、線条体に関連している。げっ歯類と非ヒト霊長類の両方の動物モデルにおいて、GABAA 拮抗薬の局所的な適用は、ビキュリンおよびピクロトキシンなどの、線条体の運動部分への、運動チックの発現をもたらす局所的な抑制を誘発する。
ここでは、ラットの運動チックの急性および慢性モデルを紹介する。急性モデルでは、背部線条体に移植されたカニューレを通してビキュリン微小注射を行い、短い期間最長1時間持続するチックの発現を引き出す。慢性モデルは、皮下ミニ浸透ポンプを介したビキュクリンの連続注入を利用して、数日または数週間の期間にチック発現の延長を可能にする代替モデルである。
これらのモデルは、コルチコ-基底基底核経路全体におけるチック発生の行動および神経機構の研究を可能にする。モデルは注入のカヌラに加えて付加的な記録および刺激装置の注入を支え、電気および光学的刺激および電気生理学的記録のような広範な使用を可能にする。各方法には異なる利点と欠点があります:急性モデルは、運動の運動学的特性と、チック発現の前後の対応する電気生理学的変化と、チック発現に対する短期モジュレーターの影響を比較することができます。この急性モデルは簡単に確立できます。ただし、短期間に制限されます。慢性モデルは、より複雑である一方で、長期間にわたるチック表現に対するチックダイナミクスと行動効果の研究を実現可能にする。したがって、経験的クエリのタイプは、ティック式のこれら2つの補完的なモデルの間で選択を駆動します。

ラットにおけるチック誘導のための急性および慢性モデルを生成するためのプロトコルを上に提示した。プロトコルは、手術と実験のための完全な準備をカバーしています(急性モデルの図1、 慢性モデルの 図2)。 線条体の運動領域へのビキュクリンの適用は、進行中のモーターチックの発現をもたらす。チックは、アプリケーションに対して反対側に表示され、短く、反復的な筋肉の収縮によって特徴付けられる。線条体の前部にビキュクリンの適用後、チックは通常ラットの前肢、頭および/または顎で発現し、後部注射後、後肢18でチックが発現する。急性モデル(図3A)では、ビキュクリンマイクロインジェクションの数分後にチックが現れ始め、数十分間続き、最終的には崩壊して18を停止する。慢性モデル(図3B)では、通常、ビキュキュリン充填ポンプ移植<su...

我々は、自由に振る舞うラットにおけるチック発現の急性および慢性の実験モデルを生成するためのプロトコルを提示する。モデルは、線条体カニューレ注入とその後の GABA Aアンタゴニストアプリケーションに基づいています。急性モデルは一時的な注入を使用し、慢性モデルは皮下埋め込まれたミニ浸透ポンプを介して長期注入を利用する。

Motor tics are sudden, rapid, recurrent movements that are the key symptoms of Tourette syndrome and other tic disorders. The pathophysiology of tic ...

このプロトコルは、一過性または慢性的な方法で、自由に行儀のよいラットで運動チックを誘導する方法をレイアウトすることにより、チック障害のユニークな実験モデルを記述する。この方法の主な利点は、トゥレット症候群および他のチック障害を研究するために広く使用されている唯一の利用可能な模型のチック発現を記述することです。視覚デモンストレーションは、カスタムメイドのデバイス調製と移植手術の複雑なプロセスを明確にします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるエステル・ヴィナーとラボマネージャーのカティヤ・ベレロフスキーです。まず、25ゲージのステンレス鋼のハイポチューブと0.013インチのダミー取り外し可能な内部ワイヤーを切断することによってインプラントカニューレを準備します。それが終わりに達するまで、インプラントカニューレにこのダミーワイヤーを挿入し、余分なワイヤーを曲げます。その後、70センチメートルの柔軟なポリマーマイクロボアチューブを切断し、インジェクタを調製した。ロータリーツールで30ゲージのステンレス鋼のハイポチューブを切断して、注入カニューレを準備します。この注入カニューレの3ミリメートルを柔軟なチューブに挿入し、それらの間の関節を接着してインジェクターを得る。手術を行う場合は、インプラントカニューラーをカニューレホルダーにスライドさせ、ラットの脳内の移植ターゲットまで下げます。インプラントカニューレをラットの頭蓋骨に取り付け、歯科用セメントを塗布します。このインプラントカニューレに準備されたダミーを挿入し、頭蓋骨の残りの部分に歯科用セメントを適用することによってすべてのインプラントをカバーする。マイクロインジェクションを実行するには、ビキュリンで満たされた精密ガラスマイクロシリンジにインジェクターを取り付け、毎分0.35マイクロリットルの速度と0.35マイクロリットルの総容量に設定します。実験ケージにラットを置きます。ダミーを取り外し、最後まで注入カニューレに注入器を挿入します。注入ポンプ機械を開始し、ストップウォッチを使用して、チック開始と終了時間を追跡します。1分間注射した後、インジェクターを取り外し、ゆっくりとダミーを再挿入します。30ゲージのステンレス鋼のハイポチューブを切断することによって12ミリメートル25ゲージのステンレス鋼のハイポチューブと注入カニューレを切断することによってカニューレガイドを準備します。直径 0.005 インチのワイヤを注入カニューレに挿入し、目的の位置の L 字型に曲げます。次に、8センチメートルのポリエチレンPE10チューブを切断して柔軟なカテーテルチューブを調製します。注入カニューレから内線を取り出し、シアノアクリル酸接着剤と加速器を使用して注入カニューレの曲がった部分の近くに3ミリメートル重なりにカニューレガイドを接着します。次に、注入カニューレの水平部分をカテーテルチューブに挿入します。ポンプフローモデレータの半透明キャップを排出します。チューブアダプターを70%アルコールに浸し、白いフランジに触れるまでフローモデレータの短いカニューレ部分に取り付けます。フレキシブルカテーテルチューブをチューブアダプタに挿入し、クリップスタンドを使用して長いカニューレ部分を保持し、すべての接続を接着します。ミニ浸透圧ポンプを紙のワイプで包み、クリップホルダースタンドを使用して開口部を上向きにして垂直に固定します。27ゲージの鈍い針でシリンジを使用してaCSFでポンプを満たし、空気の入り口を避けるように注意してください。27ゲージの鈍い針で注射器を使用してaCSFで注入管の長いカニューレ部分を充填します。そして、ポンプにそれを挿入します。ポンプを37°Cで少なくとも4〜6時間生理食いのビーカーに入れます。代わりに、中肩甲線を通して皮膚の下でアルコール殺菌止めを開閉することによって、ラットの背中に皮下ポケットを作成します。水浴からポンプを取り出し、紙の拭き取りで覆われたラットの背中に置きます。カニューレホルダー上の注入管のカニューレガイドをスライドする。止まりでポンプを持ち、皮下ポケットにそっと挿入します。注入カニューレをターゲットに移植し、ゲル接着剤を使用して頭蓋骨に接着します。注入カニューレを固定し、カテーテルが首の動きを可能にし、歯科用セメントですべてのインプラントをカバーするようにキンクフリーであることを確認します。ポンプ置換手術を行うために、27ゲージの鈍い針で注射器を使用してポンプにビキュリンを注入し始める。空気が入るのを防ぐために注射器を取り除きながらビキュリンを注入し続ける。ポンプの中にフローモデレータを挿入し、37°Cの水浴で少なくとも4〜6時間生理食いビーカーにポンプを置きます。埋め込まれたポンプの上の皮膚に切開を行います。ポケットを室温aCSFで洗い、ガーゼパッドで乾かします。止まり台を使用してフローモデレータからaCSF充填ポンプを取り外し、廃棄します。同様に、ビキュキュリン充填ポンプからフローモデレータを取り外して廃棄します。ミキュキュリン充填ポンプを移植されたフローモデレーターに静かに取り付け、切開線を組織接着剤で接着します。急性モデルでは、チックはビキュクリンマイクロインジェクションの数分後に現れ始め、数十分間続き、最終的には腐敗して停止します。慢性モデルでは、チックは通常、昼間に変動し、静かな覚え目覚め状態の間に最も明確に観察可能なビキュクリン充填ポンプ注入の後の最初の日に現れ始める。モータチックは、加速度計およびジャイロスコープ信号で検出できる立体的な運動学的シグネチャを有する。同様に、大きな振幅LFP過渡スパイクの出現のために、コルチコ-基底核経路全体の局所フィールド電位信号を使用して、チックタイミングを評価することもできる。これらのモデルは、長期間にわたって異なる行動、環境および薬理学的介入に続くチック発現の研究を可能にした。

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Research

JoVE Journal

Behavior

行動

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