細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量
2021年2月6日
ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。
当社のプロトコルは、眼内感染の病因と新しい治療効果を研究するために、マウスの目に微生物および治療薬を再現可能に導入することを可能にします。我々の技術は、マウスモデルで眼内感染を確立することを可能にし、微生物の定量、宿主免疫応答、感染関連宿主および病原体遺伝子発現、および新しい治療効果を促進する。注射部位、針角、および送達の可視化は、この技術の実行を成功させるために重要であり、適切な眼の収穫は、感染パラメータの定量化に不可欠である。
バイオセーフティレベル2の施設では、10ミリリットルのスナップキャップチューブに5ミリリットルのBHIスープを加え、滅菌ループを使用してオーガープレート培養物から5ミリリットルのスープに単一のB.セレウスコロニーを移管します。短い渦の後、18時間毎分200回転で37°C回転インキュベーターでサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、新鮮なBHIの10ミリリットルでマイクロリットル濃度あたり200コロニー形成単位に培養を希釈し、ボルテックス後、氷上の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養物を1ミリリットル加えます。
ビトリアルインジェクションの場合は、マイクロインジェクターをオンにして、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。マイクロインジェクタのモードを押して、画面にバランスが表示されるまで押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。
ステンレス鋼のピペットホルダーをインジェクタの充填出力に取り付けたチューブに接続し、ベベリングガラスキャピラリーピペットチップ針の周りにピペットホルダーコネクタをしっかりとねじ込み、ピペットホルダーのもう一方の端にキャピラリー針を挿入できるようにします。眼科顕微鏡をオンにし、光強度を処置部位の上に50%位置に設定し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスを右側を指し示した医療アンダーパッドの左側に置きます。
眼科顕微鏡の目的を通して右目を見つけ、逆作用鉗子のトングを眼の両側に置いて注射部位を露出させる。マイクロインジェクターに接続されたマウスを左クリックして、調製した毛細血管の針を希釈された細菌溶液で満たし、頭を左手で固定し、針の先端を置き、ベベル側を上に、目の四肢に置きます。針を45度の角度で、目を穿刺し、針の鋭い先端の0.5ミリメートルのみが挿入されるのに注意してください。
針先を挿入したら、左手でマウスパッドを右クリックして0.5マイクロリットルのB.cereus溶液を注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから取り外し、鉗子を離すと目自体がソケットに戻ります。完全な回復まで監視と温暖化パッド上の回復ケージにマウスを転送します。
適切な実験エンドポイントで、プロテアーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのPBSを氷上の1つの目あたりオートクレーブ収穫チューブに加え、感染した眼の両側に開いた微細な先端鉗子を置きます。先端を頭に向かって押し下げて目を突き止める。トングが目の地球儀の後ろになったら、トングを一緒に絞り、鉗子を頭から引き離して眼球を取り外します。
その後、すぐに適切にラベル付け収穫管に眼球を置きます。サンプル採取から60分以内に、閉じた収穫チューブを組織ホモジナイザーに入れ、サンプルを2分間均質化し、その間に30秒の休息期間を有する1分間の均質化期間を有する。均質化後、サンプルを氷の上に置き、ホモゲネートの20マイクロリットルアリコートを使用して、希釈あたり180マイクロリットルのPBSでサンプルを連続的に希釈し、マイナス8に10倍の因子に達するまで使用する。
次に、適切な希釈濃度で正方形の事前温められたBHIプレートの各行にラベルを付け、プレートを45度の角度で傾けて、各希釈液の10マイクロリットルをプレートの上部の個々の行に追加します。プレートを平らにする前に、各サンプルがプレートの底にほぼ達するまで実行します。試料が寒天に吸収されたら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移します。
コロニーは、8時間のインキュベーションの後に見えるように始めるはずです。サンプル中の濃度を正確に表すために、10~100コロニーの間の行を数えます。ベベリングガラス針先端の構築は、マウスの目の中硝子体に細菌を送達するために重要です。
これらの画像では、血液寒天板およびスープ培養管に成長するセレウス菌が示されている。このグラフに示すように、感染後10時間で5つの異なるマウスの目から5つの異なるマウスの目から数え、細菌の1回10〜5番目のコロニー形成ユニットの間の1回と第7コロニー形成単位の1回の間で、典型的には単一の感染した眼から回収することができる。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、マウスの目にその適切な量の細菌を注入することです。
この手順に従って、ELISAによる病態、ELISAによる炎症メディエーター、および高スループットRNAシーケンシングによる遺伝子発現による炎症を研究し、この疾患の病因をよりよく理解することができます。
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概要
この記事は、細菌性眼内炎のマウスモデルにおける眼内注射と細菌定量化の方法を紹介します。このプロトコルは、眼内感染を研究し、新しい治療法の有効性を評価するために設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 感染症
- 免疫学
背景
- 眼内感染は重度の視力低下につながる可能性があります。
- 宿主の免疫反応を理解することは、治療法を開発する上で重要です。
- マウスモデルは一般的に眼疾患の研究に使用されています。
- 微生物の定量化は感染の重症度を評価するのに役立ちます。
研究目的
- マウスの目に微生物を導入するための再現可能な方法を確立すること。
- 感染に関連する宿主の免疫反応と遺伝子発現を測定すること。
- 新しい治療薬の有効性を評価すること。
使用された方法
- 微生物の導入のための眼内注射技術。
- 細菌の培養のためのBHIブロスの使用。
- 感染パラメータの定量的評価。
- 注射部位の可視化と適切な技術実行。
主な結果
- マウスモデルにおける眼内感染の成功的な確立。
- 微生物負荷と免疫反応に関する定量的データの取得。
- 感染中の宿主と病原体遺伝子発現に関する洞察。
- 治療の有効性の評価が実証されました。
結論
- このプロトコルは、眼内感染を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 宿主-病原体相互作用の理解を促進します。
- 眼感染症の新しい治療戦略の開発をサポートします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reproducible intravitreal injection and quantitative infection assessment in mouse models enable rigorous evaluation of intraocular infection mechanisms and therapeutic interventions. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular anti-infective drug discovery. Quantitative outputs and standardized procedures facilitate translational continuity and portfolio triage in ophthalmic R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response pathways in a controlled in vivo system.
- Supports functional validation of therapeutic targets by quantifying infection and immune parameters.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking bacterial load to host gene expression and inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo platform for evaluating anti-infective compounds and delivery strategies.
- Standardizes infection quantitation via CFU enumeration, supporting reproducibility and assay comparability.
- Generates quantitative readouts suitable for downstream screening and efficacy assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery and preclinical validation.
- Enables continuity from mechanistic studies to preclinical efficacy testing in ocular infection models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust infection and immune response data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular anti-infective development, bridging mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on infection mechanisms and immune modulation in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of bacterial load, immune mediators, and gene expression across conditions.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for biomarker and efficacy studies in ocular infection.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for diverse anti-infective and immunomodulatory research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of ocular infections.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of infection modeling and quantitation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical injection and animal model handling.
- Demands access to microinjectors, ophthalmic microscopes, and tissue homogenization infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, harvest, and quantitation protocols.
- Adaptation may be needed for different pathogens or mouse strains as supported by the protocol.
- Careful volume control and technique are critical to ensure reproducibility and data integrity.
