Name: 細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶ細菌性内眼炎マウスモデルにおける硝子体内注入法と細菌定量法。宿主免疫応答や遺伝子発現を評価し、新規治療薬の有効性を検証する再現性の高い技術です。

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著者らは、フェン・リー博士とマーク・ディットマー博士(OUHSC P30ライブアニマルイメージングコア、ディーンA.マギーアイ研究所、オクラホマシティ、OK、米国)の支援に感謝します。私たちの研究は、国立衛生研究所の助成金R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947、およびR01EY024140によってサポートされています。また、P30EY21725(生きた動物イメージングと分析、分子生物学、細胞イメージングのためのNIH CORE助成金)によっても研究が支援されています。私たちの研究はまた、NEIビジョンサイエンス博士後期研修プログラム5T32EY023202、長老派健康財団研究支援助成金、および失明防止研究からディーンA.マギーアイ研究所への無制限の助成金によってサポートされています。

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドと眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の勧告に従って行われました。このプロトコルは、オクラホマ大学保健科学センターの施設動物管理および使用委員会(プロトコル番号15-103、18-043、および18-087)によって承認されました。
1. 滅菌ガラス針
<ol><li>針ピペットの引き手を オンに します。</li>
	<li>ディスプレイに 12.6 が表示されるまで ヒーター ノブを調整します。</li>
	<li>ドアを開けて、5 μL のキャピラリーチューブを上部クランプとヒーターフィラメントに手動で供給し、チューブの半分がフィラメントの下に広がるまで(図 1A)。</li>
	<li>キャピラリーチューブが上部クランプの「V」溝に入っていることを確認します。上部クランプを締めます。</li>
	<li>下側のクランプを開いた後、下側クランプが上限に達するまで垂直スライドを手動で調整します。チューブが下側クランプの「V」溝に入っていることを確認します。下側クランプを締めます。</li>
	<li>ドアを閉めて、「レディ」ライトが点灯していることを確認します。[スタート]ボタンを押してヒーターとプルシーケンスを開始します(図1B)。</li>
	<li>熱と重力がキャピラリーチューブを引き離した後、ヒーターが自動的にオフになっていることを確認します(図1C)、スライドは下方に移動します。</li>
	<li>戸を開けて下さい。キャピラリーチューブの上部を保持したまま、上部クランプを締め付けます。上の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。</li>
	<li>キャピラリーチューブを下のスライドに持ち、下側クランプを締め付けます。下の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。</li>
	<li>0.05 μm アルミナ研磨砥石プレート付きのマイクロ電極ベベラーを使用して、引っ張られた毛細管をベベルして注射針を作成します。</li>
	<li>表面を覆うのに十分な水を研削板にピペット(図1D)。.</li>
	<li>ベベラーを オンに して、60 rpmで回転し始めます。引っ張られたキャピラリーチューブを「V」溝のピペットクランプに入れなさい。クランプを締め、ピペットクランプの角度を30°に調整します。</li>
	<li>粉砕プレートの回転の中心から約 3 分の距離のキャピラリー チューブの先端を調整します。</li>
	<li>マニピュレータの上部にある粗いコントロールノブを調整して、クランプされたキャピラリーチューブを下げます。キャピラリーチューブの先端が水面の下に伸び、粉砕板の研磨面に接触するまでキャピラリーチューブを下げ続けます。</li>
	<li>ベベラーに取り付けられた顕微鏡を使用して、ベベルの進行を監視します。5分後、細かいコントロールを調整して、グラス針を研削板から上げます。</li>
	<li>ガラス針を取り外し、10倍の倍率でキャピラリーチューブの先端を確認します(図1E,F)。</li>
	<li>閉塞がないことを確認するには、ガラスの針をシリンジのピペットホルダーに挿入し、空気を99%エタノールの1 mLチューブに押し込みます。針の先端に気泡が形成される場合、針は閉塞を持たないし、マイクロインジェクションに使用することができます。このプロセスはまたガラスの針の無菌性を保障する。</li>
	<li>1つの毛細管は5 μLまで液体を握ることができる。毛細管を10セクションにマークして、針の距離を計算して0.5 μLのボリュームにマークします。将来の準備のために0.5 μLを保持する距離でスケールをマークします。5 μL 針の場合、0.7 mm 離れた距離は 0.5 μL に相当します (図 1G)。</li>
</ol>2.バチルス・セレウス文化
<ol><li>バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。</li>
	<li>5%の羊の血液寒天プレート上の単一コロニー分離のためのB.セレウスATCC 14579のストリークフリーザーストックは、37°Cで一晩インキュベートする(図2A)。</li>
	<li>ピペット5 mLの無菌脳心注入(BHI)は、10 mLの無菌スナップキャップチューブにブロスする(図2B)。滅菌ループまたは針を使用して、寒天プレートから B.セレウス ATCC 14579の単一コロニーを選び、液体BHIを接種する。</li>
	<li>サンプルを簡単に渦を出す。スナップキャップチューブを回転インキュベーターに入れる。温度を37°C、速度を200rpmに設定します。18時間後、培養器から培養液を取り除く(図2B)。</li>
</ol>3. ビトリアルインジェクション用の細菌希釈液
<ol><li>バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。</li>
	<li>1マイクロリットル当たり200コロニー形成単位(CFU/μL)を達成するために新鮮なBHIの10 mLに加える一晩 のB.セレウス 培養の体積を計算する。例えば、BHIの B.セレウス の一晩培養は約2 x 108 CFU/mLに複製され、10μLの一晩培養を10mLの新鮮なBHIにピペット化することによって200 CFU/μLに希釈することができる。</li>
	<li>1.5 mLマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養のピペット1mL。このチューブを氷の上に置いて、ビトリアルインジェクションまで続けます。細菌培養物を希釈して60分以内にビトリアル注射を行う。</li>
</ol>4. マウスのビトリア内注射
<ol><li>バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。</li>
	<li>手術台の上に医療の下パッドを置くことによって処置の場所を準備する。</li>
	<li>マイクロインジェクター をオンに し、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。ガスの供給がおよそ60 psiになるまでタンクレギュレータを調節して下さい。</li>
	<li>マイクロインジェクタで、画面にバランスが表示されるまでモードを押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。ステンレス製のピペットホルダーを、インジェクタの「充填/出力」に取り付けられたチューブに接続します。この管は常に注入器に接続される。</li>
	<li>ピペットホルダーのコネクタを針の周りにしっかりとねじ込んで、ピペットホルダーのもう一方の端に毛細血管針を挿入します。</li>
	<li>眼科顕微鏡をオンにし、その光を50%の強度に点灯します。手術台の手順部位に顕微鏡を調整し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。</li>
	<li>手順が始まる前に、ペダル離脱反射をテストしてマウスが適切に麻酔されていることを確認します。麻酔のためのあなたのIACUC承認されたプロトコルに従ってください。</li>
	<li>麻酔マウスを医療下パッドの上に置き、鼻を右に向け、左側に傾きます。</li>
	<li>眼科顕微鏡を通してマウスの右目を見て、眼の両側の逆作用鉗子のトングを開いて注射部位を露出させることで蓋を開けて、注射部位を露出させる(図3C)。</li>
	<li>マイクロインジェクターに接続されたマウスパッドを左クリックして、キャピラリー針に200 CFU/μL希釈液を充填します(図3D)。</li>
	<li>左手で動物の頭を固定し、針の先端を目の手足に置きます。針をベベルアップ位置と45°角度にして、マウスの目を穿刺しますが、注射時には針の鋭い先端(約0.5mm)のみが挿入されるようにします。</li>
	<li>針先を挿入したら、マウスヘッドからマウスパッドに左手を動かし、マウスパッドを右クリックしてB.セレウス希釈液の0.5 μLを注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから(図3E)1、19、26、27、32、34、36、37、38を取り除きます。</li>
	<li>鉗子を放し、加温パッドに座っているケージにマウスを置きます。麻酔から回復するまでこれらのマウスを監視する(図3F)。</li>
	<li>マウスが麻酔から回復したら、ケージを適切なラックに戻します。マウスが電気レティノグラフィーによるレチン機能解析を受ける場合、ケージは適切な暗い適応のために暗い部屋に戻す必要があります。</li>
</ol>5.収穫管の準備
<ol><li>1 mmの無菌ガラスビーズを1.5 mLのスクリューキャップチューブに入れます。</li>
	<li>乾燥した設定でオートクレーブでこれらのチューブを殺菌します。チューブを室温まで冷ましてから使用してください。</li>
	<li>1x無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10 mLを無菌15 mL遠心チューブに加えます。</li>
	<li>1錠のプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットをチューブに加えます。19、27、29、34、35を渦によって混ぜます。</li>
	<li>プロテアーゼ阻害剤を含む1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)のピペット400μLをオートクレーブ収穫チューブに各オートクレーブ収穫管に入れた。チューブにラベルを付け、氷の上に置きます。(図4A)</li>
</ol>6. 目の収穫
<ol><li>バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。</li>
	<li>マウスをCO2 吸入で安楽死させる。安楽死を確認するために二次的な方法を使用してください。</li>
	<li>安楽死させたマウスヘッドを安全に保持し、感染した眼の両側の細かい先端鉗子を開きます。頭に向かって押し下げて目をプロトーゼします。トングが目の地球の後ろになったら、トングを一緒に絞ります。鉗子を頭から引き離して眼球を取り外す(図4B)。</li>
	<li>すぐに眼球を標識された収穫管に入れます。氷の上にチューブを60分以下に置きます(図4C)。</li>
</ol>7. 眼内細菌数
<ol><li>バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。</li>
	<li>すべての収穫管がしっかりと閉じられ、組織ホモジナイザーの中でバランスが取れているか確認してください(図5A)。サンプルを均質化するために1分間、組織ホモジナイザーをオンにします。30 s を待ってから、さらに 1 分間電源を入れます。氷の上にチューブを置く(図5B,C)。</li>
	<li>ホモジネートの20 μLを180 μLの無菌1x PBSに順次移して、各サンプルを10倍に連続して希釈します。10-7の因子に達するまで希釈する(図5D)。</li>
	<li>適切な希釈因子で暖かい、正方形のBHIプレートの各行にラベルを付けます。各希釈液の10 μLを、約45°の傾きの上部BHIプレートに一列に移動します。サンプルがプレートの底に近くなるまで実行し、プレートを平らにして配置します(図5E)39。</li>
	<li>サンプルをBHI寒天に吸収したら、プレートを37°Cインキュベーターに移します。コロニーは、インキュベーターに入れられた後8時間目に見えるように開始する必要があります。</li>
	<li>B.セレウスコロニーの成長前にインキュベーターからプレートを取り出し、個々のコロニーを識別するのを妨げる(図5F)。</li>
	<li>サンプル中の濃度を正確に表す場合は、10~100コロニーの間の行を数えます。たとえば、45 コロニーを持つ10-4 の希釈分率を持つ行は、4.5 x 10 5 CFU/mL の濃度を 持つことになります。</li>
	<li>1眼あたりの細菌の総数を計算するには、濃度に0.4を掛け、眼の均質化に使用される1x PBSのミリリットル体積を表します。たとえば、4.5 x 105 CFU/mL濃度は、1眼あたり1.8 x 105 CFU B.セレウス に変換されます。</li>
</ol>8. サンプルの保存
<ol><li>ホモジュネートサンプルをラベル付きの冷凍庫ボックスに入れ、この箱を-80°Cの冷凍庫に入れます。これらのサンプルは、後でELISAによる炎症性メディエーター分析に使用することができる。</li>
</ol>

著者らは開示する財政的な矛盾を持っていません。

強力な抗生物質、抗炎症薬、および虚内切開手術が可能であっても、細菌性子宮内膜炎は患者を盲目にすることができます。臨床研究は、眼内炎の研究に有用であった;しかし、眼科医炎の実験モデルは、迅速かつ再現性の高い結果を提供し、治療水準の進歩に変換することができ、患者の視覚結果を向上させます。
マウスアイの膜状ボリュームは約7μL40です。この小さい容積は限られた量の物質を注入することを可能にする。1.0 μL を超えるボリュームは、眼の損傷を避けるために注入しないでください。このプロセスでは、再現性と正確性を確保するために、特定の機器と技術の実践が必要です。内眼炎は霊長類、豚、ウサギ、ラット、モルモット、マウス28、41、42、43、44、45で研究されている。<su...

細菌性心内炎は炎症を引き起こす壊滅的な感染症であり、適切に治療しないと視力や失明を引き起こす可能性があります。眼内炎は、目1、2、3、4、5の内部に細菌が入り込んだ結果である。一度目に入ると、細菌は複製し、毒素やその他の有害因子を産生し、繊細な眼下の細胞および組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある。眼の損傷は、炎症によっても引き起こされ得るが、眼の内部に炎症細胞が流入する炎症経路の活性化に起因する1、5、6。子宮内膜炎は、眼内手術(術後)、眼への貫通傷害(心的外傷後)、または異なる解剖学的部位(内因性)7、8、9、10から眼への細菌の転移性の広がりから起こり得る。細菌性眼内炎の治療には、抗生物質、抗炎症薬、または外科的介入3、4、11が含まれる。これらの治療を受けても、視力や目自体が失われる可能性があります。細菌性心内炎後の視覚予後は、一般に、治療効果、提示時の視力、および感染性生物の毒性によって異なる。
セレウス菌(B.セレウス)は、心的外傷後心内膜炎7、12を引き起こす主要な細菌病原体の1つである。B.セレウス心内炎の症例の大半は急速な経過を有し、数日以内に失明を引き起こす可能性がある。B.セレウス心内炎の特徴は、急速に進化する眼内炎症、眼痛、視力の急速な喪失、発熱を含む。B. セレウスは、一般的に眼感染症2、4、12を引き起こす他の細菌と比較して目に急速に成長し、多くの病原性因子を有する。したがって、治療介入を成功させるためのウィンドウは、1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25である。 この感染症の治療は、通常、他の毒性の低い病原体によって引き起こされる心内炎の治療に成功するが、B.セレウス心内膜炎は一般的に有意な視力低下に苦しむ患者の70%以上をもたらす。これらの患者の約50%は、感染した眼の摘出または摘出を受ける7、16、22、23である。B.セレウス眼内炎の破壊的かつ迅速な性質は、即時かつ適切な治療を必要とする。最近、疾患開発の基礎的なメカニズムを見極める上での進歩は、介入のための潜在的な標的を特定した19,26,27.B.セレウス眼内炎の実験的マウスモデルは、感染のメカニズムを識別し、視力低下を防ぐ可能性のある潜在的な治療法をテストするのに引き続き有用である。
B.セレウスを有するマウスの実験的眼内感染は、子宮内膜炎28の間に細菌および宿主因子、ならびにそれらの相互作用を理解するためのインストゥルメンタルモデルであった。このモデルは、外傷後または術後の事象を模倣し、怪我の間に細菌が目に導入される。このモデルは非常に再現性が高く、試験的療法のテストや、ケアの標準の改善のためのデータを提供するのに有用であった1、6、 19、29、30。他の多くの感染モデルと同様に、このモデルは感染の多くのパラメータの独立した制御を可能にし、感染結果の効率的で再現可能な検査を可能にする。過去数十年にわたるウサギの同様のモデルの研究は、目2、4、13、14、31におけるB.セレウス毒性因子の影響を調べた。個々または複数の病原性因子を欠く変異株B.セレウスを注入することにより、これらの病原性因子の疾患重症度への寄与は、異なる時間の感染時における細菌の濃度または視覚機能13、14、27、31、32の喪失などの結果によって測定することができる。さらに、特定の炎症性宿主因子26、29、33、34、35を欠くノックアウトマウス株に感染することにより、このモデルでホスト因子が検討されている。このモデルは、感染後に目に新しい化合物を注入することによって、この疾患の潜在的な治療法をテストするのにも有用である30,36.本稿では、B.セレウスにマウスの眼を感染させること、感染後の眼を収穫すること、眼内細菌負荷を定量化すること、および疾患の重症度の追加パラメータをアッセイするために標本を保存することを含む詳細なプロトコルを記述する。

<table><tbody><tr><td>2-20 & マイクロ;Lピペット</td><td>RANIN</td><td>L0696003G</td><td>NA</td></tr><tr><td>37oC インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-690-625D</td><td>NA</td></tr><tr><td>バクトブレイン ハートインフュージョン</td><td>BD</td><td>90003-032</td><td>NA</td></tr><tr><td>セルマイクロインジェクター</td><td>MicroData Instrument, Inc.</td><td>PM2000</td><td>NA</td></tr><tr><td>細い先端の鉗子</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-122</td><td>NA</td></tr><tr><td>ガラスビーズ 1.0 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079110</td><td>NA</td></tr><tr><td>インキュベーター シェーカー</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>NB-I2400</td><td>NA</td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーピペット 5 マイクロリットル</td><td>キンブル</td><td>71900-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>マイクロピペット ベベラー</td><td>サッター インストゥルメント Co.</td><td>BV-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>顕微鏡 Axiostar Plus</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>顕微鏡 OPMI Lumera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>Model 607</td><td>NA</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット 30-300 &micro;L</td><td>Biohit</td><td>15626090</td><td>NA</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット 5-100 &micro;L</td><td>Biohit</td><td>9143724</td><td>NA</td></tr><tr><td>ニードル/ピペットプーラー</td><td>Kopf</td><td>730</td><td>NA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td></td> 1897315 <td>分子グレード</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>ロシュ</td><td>4693159001</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>逆作用鉗子</td><td>Katena</td><td>K5-8228</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

眼内細菌感染は視力にとって危険である。研究者は、動物モデルを使用して、感染に関連する宿主および細菌因子および免疫応答経路を調査し、実行可能な治療標的を同定し、失明を予防するための薬物を検査する。細胞内注射技術は、眼の後部の膜腔に生物、薬物、または他の物質を直接注入するために使用される。ここでは、マウス眼での感染を開始するこの注射技術と眼内細菌を定量する技術を実証した。 セレウス菌 は脳心注入液培地中で18時間成長し、100コロニー形成ユニット(CFU)/0.5μLの濃度に再懸濁した。ケタミンとキシラジンを併用してC57BL/6Jマウスを麻酔した。ピコリットルマイクロインジェクターとガラス毛細血管針を用いて、0.5μLの バチルス 懸濁液をマウス眼の中硝子に注入した。対照眼は滅菌培地を注射したか(外科的制御)、注入されなかった(絶対対照)。感染後10時間で、マウスを安楽死させ、無菌手術用ピンセットを使用して目を採取し、400μLの無菌PBSおよび1mmの無菌ガラスビーズを含むチューブに入れた。ELISAまたは骨髄ペルオキシダーゼアッセイの場合、プロテイナーゼ阻害剤をチューブに添加した。RNA抽出のために、適当なリシスバッファーを添加した。目を組織ホモジナイザーで1〜2分間ホモジナイザー化した。ホモジェナートをPBSで10倍に連続して希釈し、寒天プレートにトラック希釈した。ホモジエートの残りの部分は、追加のアッセイのために-80°Cで保存した。プレートを24時間インキュベートし、1眼当たりのCFUを定量化した。これらの技術は、マウスの目に再現性の感染症をもたらし、生存可能な細菌、宿主の免疫応答、および宿主および細菌遺伝子発現のオミックスの定量を促進する。

再現性の接種およびビトウィーン内注入手順の精度を生成することは、微生物内眼炎のモデルを開発する上で重要なステップです。ここでは、グラム陽性 バチルスセレウスを用いたビトリア内注入手順を実証した。5匹のC57BL6マウスの中部に100CFU/0.5μLの B.セレウス を注入した。10時間の後の感染後、我々はおよそ1.8 x 10 5 CFU/眼に B.セレウス の眼内成長を 観察した。 図1 は、マウスの目の中に細菌を送達するためのガラス針の構造を示しています。血液寒天板や培養管に成長する セレウス菌 を 図2に示す。 図3 は、空気加圧注入システムを用いたマウスのビトリアル内注入手順を示す。 図4 は、感染した眼を所望のポスト感染後に収穫する過程を示す。 図5</s...

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。

Intraocular bacterial infections are a danger to the vision. Researchers use animal models to investigate the host and bacterial factors and immune ...

当社のプロトコルは、眼内感染の病因と新しい治療効果を研究するために、マウスの目に微生物および治療薬を再現可能に導入することを可能にします。我々の技術は、マウスモデルで眼内感染を確立することを可能にし、微生物の定量、宿主免疫応答、感染関連宿主および病原体遺伝子発現、および新しい治療効果を促進する。注射部位、針角、および送達の可視化は、この技術の実行を成功させるために重要であり、適切な眼の収穫は、感染パラメータの定量化に不可欠である。バイオセーフティレベル2の施設では、10ミリリットルのスナップキャップチューブに5ミリリットルのBHIスープを加え、滅菌ループを使用してオーガープレート培養物から5ミリリットルのスープに単一のB.セレウスコロニーを移管します。短い渦の後、18時間毎分200回転で37°C回転インキュベーターでサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、新鮮なBHIの10ミリリットルでマイクロリットル濃度あたり200コロニー形成単位に培養を希釈し、ボルテックス後、氷上の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養物を1ミリリットル加えます。ビトリアルインジェクションの場合は、マイクロインジェクターをオンにして、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。マイクロインジェクタのモードを押して、画面にバランスが表示されるまで押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。ステンレス鋼のピペットホルダーをインジェクタの充填出力に取り付けたチューブに接続し、ベベリングガラスキャピラリーピペットチップ針の周りにピペットホルダーコネクタをしっかりとねじ込み、ピペットホルダーのもう一方の端にキャピラリー針を挿入できるようにします。眼科顕微鏡をオンにし、光強度を処置部位の上に50%位置に設定し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスを右側を指し示した医療アンダーパッドの左側に置きます。眼科顕微鏡の目的を通して右目を見つけ、逆作用鉗子のトングを眼の両側に置いて注射部位を露出させる。マイクロインジェクターに接続されたマウスを左クリックして、調製した毛細血管の針を希釈された細菌溶液で満たし、頭を左手で固定し、針の先端を置き、ベベル側を上に、目の四肢に置きます。針を45度の角度で、目を穿刺し、針の鋭い先端の0.5ミリメートルのみが挿入されるのに注意してください。針先を挿入したら、左手でマウスパッドを右クリックして0.5マイクロリットルのB.cereus溶液を注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから取り外し、鉗子を離すと目自体がソケットに戻ります。完全な回復まで監視と温暖化パッド上の回復ケージにマウスを転送します。適切な実験エンドポイントで、プロテアーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのPBSを氷上の1つの目あたりオートクレーブ収穫チューブに加え、感染した眼の両側に開いた微細な先端鉗子を置きます。先端を頭に向かって押し下げて目を突き止める。トングが目の地球儀の後ろになったら、トングを一緒に絞り、鉗子を頭から引き離して眼球を取り外します。その後、すぐに適切にラベル付け収穫管に眼球を置きます。サンプル採取から60分以内に、閉じた収穫チューブを組織ホモジナイザーに入れ、サンプルを2分間均質化し、その間に30秒の休息期間を有する1分間の均質化期間を有する。均質化後、サンプルを氷の上に置き、ホモゲネートの20マイクロリットルアリコートを使用して、希釈あたり180マイクロリットルのPBSでサンプルを連続的に希釈し、マイナス8に10倍の因子に達するまで使用する。次に、適切な希釈濃度で正方形の事前温められたBHIプレートの各行にラベルを付け、プレートを45度の角度で傾けて、各希釈液の10マイクロリットルをプレートの上部の個々の行に追加します。プレートを平らにする前に、各サンプルがプレートの底にほぼ達するまで実行します。試料が寒天に吸収されたら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移します。コロニーは、8時間のインキュベーションの後に見えるように始めるはずです。サンプル中の濃度を正確に表すために、10~100コロニーの間の行を数えます。ベベリングガラス針先端の構築は、マウスの目の中硝子体に細菌を送達するために重要です。これらの画像では、血液寒天板およびスープ培養管に成長するセレウス菌が示されている。このグラフに示すように、感染後10時間で5つの異なるマウスの目から5つの異なるマウスの目から数え、細菌の1回10〜5番目のコロニー形成ユニットの間の1回と第7コロニー形成単位の1回の間で、典型的には単一の感染した眼から回収することができる。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、マウスの目にその適切な量の細菌を注入することです。この手順に従って、ELISAによる病態、ELISAによる炎症メディエーター、および高スループットRNAシーケンシングによる遺伝子発現による炎症を研究し、この疾患の病因をよりよく理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、細菌性眼内炎(眼の硝子体腔への細菌の侵入に起因する眼内感染)を模倣するマウスモデルを、細菌懸濁液を眼に注入することで生成する方法を説明しています。このマウスモデルは、疾患のメカニズムを研究し、その治療法を評価するのに役立ちます。...

細菌性眼内膜炎マウスモデル:マウスの眼への細菌懸濁液の硝子体内注入による細菌性眼内炎の作製法

このビデオでは、セレウス菌によって引き起こされる細菌性眼内炎のマウスモデルから得られた眼のホモジネートからの細菌感染を定量化する技術について説明しています。この手法は、マウスモデルにおける宿主免疫応答と、宿主および眼の細菌遺伝子発現への依存性を研究するのに役立ちます。...

細菌感染定量アッセイ:細菌性眼内炎のマウスモデルにおける眼内細菌負荷を定量化する方法

このビデオでは、感染後のブドウ膜炎を研究するためのプライムされたマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)のマウスモデルを生成する方法を示します。以前に同じ免疫原で免疫されたマウスに熱死結核菌の硝子体内注射によるPMUの誘導に際し、眼の慢性炎症の進行を画像診断および病理組織学的検査を用いて解析する...

感染後ブドウ膜炎を研究するためのプライムマイコバクテリアブドウ膜炎のマウスモデル

このビデオは、感染後ブドウ膜炎のマウスモデルにおける眼の炎症を検出および定量化するためのin...

マウスモデルにおけるブドウ膜炎の評価のための光干渉断層撮影イメージング

このビデオは、マウスの眼に硝子体内送達後の蛍光バイオ粒子のミクログリア取り込みを測定するためのフローサイトメトリーを示しています。フローサイトメトリーは、CD11bを発現する生細胞を検出し、緑色蛍光を示す食作用性ミクログリア細胞を、Ly6C発現単球やLy6G発現好中球などの他の骨髄系細胞と区別します。...

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

出典: Park, SW, et al.マウス網膜色素上皮における遺伝子治療のためのウイルスベクタの輪部アプローチ‐網膜下注射J. Vis. 経験。(2015年)このビデオでは、マウスモデルで網膜色素上皮(RPE)にウイルスベクターを網膜下注射する方法を説明しています。麻酔と眼の準備から正確なレンチウイルスベクター送達までの手順が詳細に説明されており、RPE...

マウスモデルにおける網膜色素上皮へのウイルスベクターの網膜下注射

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。...

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

このプロトコルは、マウスにプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)を誘発するための手順を概説しています。この方法は、マウスモデルシステムで信頼性が高く堅牢な眼の炎症を引き起こすのに役立つ手順を概説します。このプロトコルを使用して、免疫学的、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスアッセイでさらに評価するために、単一の動物からブドウ眼と炎症を起こしていない仲間の目を生成しました。...

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。...

マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法

学ぶ細菌性内眼炎マウスモデルにおける硝子体内注入法と細菌定量法。宿主免疫応答や遺伝子発現を評価し、新規治療薬の有効性を検証する再現性の高い技術です。

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

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