Name: ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶラット骨格筋からの線維-刺激性前駆細胞(FAPs)と筋原性前駆細胞(MP)の同定・分離・特徴付け方法。コラゲナーゼ処理とフローサイトメトリーにより、筋損傷後の細胞動態を解析し、再生医療研究に応用可能です。

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オタワ大学のフローサイトメトリーコア施設と、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのセントマイケルズ病院ユニティヘルストロントのフローサイトメトリーコア施設に、この原稿に記載されているフローサイトメトリー/FACSプロトコルの最適化に関する専門知識とガイダンスに感謝します。この作品は、デザインによる医学による新しいアイデア2018ファンド(MbDNI-2018-01)からJBに資金提供されました。

この議定書を実施する調査官は、地元の動物倫理委員会/ケア委員会の許可を受ける必要があります。すべての動物の仕事は、セントマイケルズ病院ユニティヘルストロント動物ケア委員会(ACC #918)によって承認され、カナダ動物ケア評議会(CCAC)が定めたガイドラインに従って行われました。フローサイトメトリープロトコルの概略を 図1に示します。下流のアプリケーションが FACS とその後の細胞培養である場合、すべてのステップは適切な無菌技術で完了する必要があります。
1. 筋肉の収穫
<ol><li>局所の生体および動物倫理委員会のガイドラインに従って適切な麻酔薬と犠牲を使用してラットを麻酔します。このプロトコルは、例として、成人雌ルイスラット(200〜250g)から胃頭筋を収穫する。ラットを2-3%イオブルランを用いて麻酔し、T61の心臓内注射によって屠殺した。</li>
	<li>動物が犠牲になったら、後肢全体を剃って筋肉の位置を容易にし、収穫された組織の毛皮汚染を最小限に抑えます。</li>
	<li>無菌メスを使用して、皮膚に2つの切開を行います:足首関節の円周の周りの最初の周りと足首から股関節への後肢の内側の正中線上の2番目。</li>
	<li>皮膚と表面筋層を剥離して、大腿骨の内側および内側顆に由来し、アキレス腱で挿入する基礎となる胃腸炎を明らかにする。</li>
	<li>鈍い解剖を使用して胃腸を周囲の組織から分離し、腱でのみ筋肉を取り扱い、クラッシュ傷害を避ける。</li>
	<li>鋭いはさみでアキレス腱をできるだけ遠位に移すことによって、胃腸を挿入から分離する。切断したら、鉗子でアキレス腱をつかみ、下敷きの骨から胃腸を静かに剥がします。それでも筋肉を片手に鉗子で保持し、胃食道の2つの起源を見つけ、内側と内側の大腿骨顆で切断する。</li>
	<li>できるだけ多くの血液を除去するために、無菌のガーゼに対して優しく切除された胃腸をブロットします。無菌表面の筋肉をトリミングし、余分な結合組織だけでなく、アキレス腱を削除します。</li>
	<li>重量ボートに筋肉を入れ、精密スケールを使用して重量を量る。このプロトコルは、200〜600 mgの範囲の湿った体重で筋肉を消化するように最適化されています。オペレータは、必要に応じて、他の下流アッセイのために過剰な収穫された組織を細分化することができる。</li>
	<li>さらに、流量サイトメトリーに使用する収穫した筋肉をさらに3~4個(約1〜2cm3)に分け、氷冷1x PBSに沈水します。すべてのサンプルが収穫されるまで氷の上で冷たく保ちます。</li>
</ol>2. 筋肉の消化
<ol><li>PBSから筋肉を取り除き、無菌10cm細胞培養皿に入れます。そっと裂け、そして、部分がおよそ3-4 mm3になるまで鉗子でティッシュを軽く引き裂き、できるだけ多くの結合組織を取り除く。十分にみじん切りにしたら、6 mL DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含む無菌50 mL円錐状チューブに移します。</li>
	<li>コラゲナーゼII溶液(ストック濃度4800 U/mL)の365 μLに300 mMCaCl2溶液の10 μLを加え、コラゲナーゼ酵素を活性化します。活性化コラゲラーゼII溶液を、組織スラリーを含む50 mL円錐管に加えます。最終的なコラゲローゼII濃度は250 U/mLです。</li>
	<li>37°C、240 x gで1時間シェーカーにチューブをインキュベートし、15分ごとに手動で旋回して、チューブの側面に付着した組織を取り除くようにします。</li>
	<li>1時間後、シェーカーからチューブを取り出し、サンプルごとに100 μL(4,800 U/mL)と50μLのディスパーゼ(4.8 U/mL)を加えます。</li>
	<li>溶液が均質になるまで血清学的ピペットを15〜20回使用したピペットサンプル。複数のサンプルを処理する場合は、サンプルのクロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルに個別の滅菌ピペットを使用してください。</li>
	<li>37°Cと240 x gで30分間シェーカーに再びインキュベートします。15分後、サンプルを手で振って、チューブの側面から付着組織を外します。</li>
</ol>3. 単一細胞懸濁液の生成
<ol><li>10 G針の10 mLシリンジを通してサンプルをゆっくりと剪断し、10サイクルで使用します。 注:1サイクルは、注射器に筋肉溶液を取り込み、チューブに戻す必要があります。過度の泡立ちが細胞死を余しにする可能性が高い39の原因となるため、剪断をゆっくりと完了して気泡を最小限に抑えるようにしてください。</li>
	<li>40 μmのセルストレーナーを無菌50 mL円錐形チューブに置き、5 mL DMEM + 10% FBS + 1% P/Sを湿潤させます。</li>
	<li>ピペット1 mLのサンプルを細胞ストレーナーを介して一度に。</li>
	<li><li> </li><li></li><li></li><li><li></ol><ol><li></li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li><li><li><li></li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li> </li></ol><ol><li> <ol><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li><li><li> </li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61750/61750eq01v2.jpg"> </li></ol></li><li> <ol><li></li><li><li><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li> </li></ol></li><li> </li><li><li><li> </li><li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li><li><li><li></ol></li></ol>

著者らは開示する矛盾はない。

ラットの筋肉のための最適化された、検証されたFAPs分離プロトコルは、生物学的または技術的な理由のためにマウスで実現不可能な傷害モデルを研究したい研究者にとって不可欠です。例えば、マウスは、慢性局所的、または長期脱退などの神経変性傷害を研究するための最適な動物モデルではない。生物学的には、マウスの短い寿命と急速な老化は、老化の交絡因子からの脱用による筋肉のイコナを正確に引き出すことを困難にする。技術的な観点から、重度の萎縮による筋肉量の大幅な減少は、効果的なフローサイトメトリック分析には不十分であろう。実際、マウスの FAPs 分離プロトコルは、正常な筋肉をグループ化して、並べ替えられた FAPs29の収率を上げることを提案しています。これは、分析のための十分な筋肉組織を得るための技術的な障壁を解決しながら, それは同時に筋肉固有のレベルでFAPsを評価することから研究者を制限します..特定の筋肉群は繊維型組成、血管化の程度、およびミトコンドリアの数47に本質的に異なるため、例えばフローサイトメトリック解析のために複数の異なる筋肉を組み合わせ...

線維-異形成前駆細胞(FAPs)は、筋肉恒常性、修復、再生に重要な役割を果たす骨格筋中の常駐多能前駆細胞の集団であり、逆に、筋肉損傷に対する病理学的応答を媒介する。その名の通り、FAPはもともと線維芽細胞および脂肪細胞1に分化する可能性のある前駆体集団として同定され、慢性傷害および疾患における骨格筋の線維脂肪浸潤の主要なメディエーターであると言われた。さらなる研究は、FAPsが骨形成および軟骨形成の追加可能であることを明らかにした2、3、4。したがって、それらは間葉または間質前駆子3、5、6、7、8として文献でより広く公示されている。急性骨格筋損傷において、FAPsは、活性化された筋肉衛星細胞およびそれらの下流筋性前駆細胞(MP)の対応する1、9、10に有利な環境を提供するために一過性増殖することによって再生筋形成を間接的に助ける。正常な再生と並行して、FAPsはアポトーシスを受け、その数値をベースラインレベル1、9、10、11に戻します。対照的に、慢性筋損傷では、FAPはプロアポトーシス信号を上書きし、持続性9、10、11および異常な筋肉修復をもたらす。
IN Vivo研究では、現在までに1、7、9、10、11、12、13、14までのマウス動物モデルを利用した、FAPsが筋肉応答を媒介する細胞および分子機構を評価する。遺伝子組み換えマウスはこれらの分析に使用するための強力なツールですが、動物の小さなサイズは、外傷性脱化などの筋肉萎縮が深遠である長期的な局所的な傷害モデルでの研究のための組織の可用性を制限します。さらに、筋力と身体機能の測定には、ex vivoまたはマウスの終了を必要とするその際の測定、または筋肉収縮性能15、16、17、18、19、20の評価を可能にする手術および/または全身麻酔薬を必要とするインビボ法が必要です。 .ラットでは、十分に検証され、世界的に利用された筋肉機能分析、歩行分析などのより複雑な運動行動(例えば、坐骨機能指数、CatWalk分析)の分析に加えて存在し、目を覚まし、動物21、22、23、24で起こって行われる.これはさらに動物実験における最小の罹患率の原理、および使用される研究動物の数を最適化する。ラットはそれによって、FAPsの調査官に、タンパク質および細胞分析のためのより大きな負傷した筋肉容積の追加の柔軟性および警報動物における筋肉複合体静的および動的機能活性および行動の連続評価を行う能力を提供する。
FAPsは、フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、主に全筋サンプルから同定され、単離されています。これらは、サイズ、粒度、および細胞表面または細胞内マーカー25の特異的組み合わせなどの特徴に基づいて複数の特定細胞集団を同定することができるレーザーベースのアッセイである。これは、骨格筋などの器官系の研究において非常に有利であり、恒常性および再生は複雑で多因子的なプロセスであり、多くの細胞タイプによって調整される。精細な研究では、マウス骨格筋1のフローサイトメトリック法を使用して、MPと同様にFAPsを同定した。彼らは、内皮(CD31)、造血薬(CD45)、または筋原性(Integrin-α7[ITGA7])由来の細胞に特異的な表面抗原を欠いていたが、間葉系幹細胞マーカーSca-1(幹細胞抗原1)1および線維化細胞細胞に分化された表面抗原を欠いていたため、FAPsが本質的に間葉系であることを実証した。他の研究は、代替幹細胞マーカーの発現に基づいて筋肉中間葉系前駆細胞の分離に成功したことを示した、血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)2、7、8およびさらなる分析は、これらは、FAPs3と同じ細胞集団である可能性が高いことを明らかにした。正の選択マーカーとしてSca-1またはPDGFRαのいずれかを使用してフローサイトメトリーで一般的に識別される1,9, 10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 .PDGFRαの使用はヒト組織に対して優先的であるが、マウスSca-1の直接的なヒトホモロゲーとしては、まだ32を同定していない。さらに、他の細胞表面タンパク質は、MP(例えば、VCAM−1)のマーカーとして報告されており、FAPsの分離33の間に筋形成系統の細胞の指標としてITGA7に代わる可能性がある。
フローサイトメトリー/FACSは骨格筋1、9、10、11、13、29におけるFAPsの役割と病原性ポテンシャルを研究するための強力な方法論であるが、それは技術的に必要な試薬の特異性と最適化によって制限される。フローサイトメトリック同定とFAPsの単離はマウス動物モデル1、9、10、11、29で開発され、実施されているため、他のモデル生物の中でのFAPsの研究を希望する研究者にとっては課題となっています。処理対象の最適な組織サイズや、試薬や抗体の特異性や入手可能性など、多くの要因は、使用する種によって異なります。
新しい動物モデルでFAPsを研究するための技術的な障壁に加えて、それらは主に急性の有毒な設定で研究されています - 通常、筋肉内化学注射または心毒を介して。FAPsの長期的なダイナミクスの評価は、主にデュシェンヌの筋ジストロフィーの評価に限定され、mdxマウスモデル9、10、11、および肩筋筋症に対して同時腱管切れと脱用が行われる大規模なローテーターカフ涙などの組み合わせ筋損傷のモデル.慢性外傷性脱児の唯一の侮辱に対するFAPsの反応は、重工業、農業、および出生時外傷(上腕神経叢損傷)34、35、36、37で重大な罹患率を有する職場における事故において一般的に起こり、顕著な罹患率を有する、しばしば短期間の期間11、38に限定される。
ラットの腫性および線維性骨格筋の健康から、また重度の萎縮性および線維性骨格筋から、FAPおよびMPを同定し、単離する方法について述べる。まず、組織消化およびフローサイトメトリー染色プロトコルを用いたCD31-/CD45-/Sca-1-FAおよびCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPの同定が実証され、その後の知見の検証は、FACS分離細胞の培養および免疫細胞化学染色を通じて行われる。この方法を用いて、ラットにおける長期隔離された脱用傷害モデルにおける新規のFA時間コースも報告する。

<table><tbody><tr><td>5 mL ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ 細胞ストレーナーキャップ付き</td><td>ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 細胞培養皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル細胞培養プレート</td><td>ThermoFisher</td><td>130185</td><td></td></tr><tr><td>12 mm ガラスカバースリップ、No.2</td><td>VWR</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>10 mLシリンジ</td><td>ベクトン・ディッケンソン</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>FroggaBio</td><td>91014</td><td></td></tr><tr><td>20ゲージ針</td><td>ベクトン・ディッケンソン 305176</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mL 血清ピペット</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>40&micro;m細胞ストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50mL 遠心チューブ</td><td>FroggaBio</td><td>TB50</td><td></td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation ビーズ&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA10497</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム、試薬グレード</td><td>バイオショップ</td><td>AMC303.500</td><td></td></tr><tr><td>APCコンジュゲーションキット、50-100&micro;g</td><td>Biotium</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex 水性埋込媒体</td><td>メルク</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>Biolaminin 411 LN</td><td>Biolamina</td><td>LN411</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Bioshop</td><td>CCL444.500</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Plus アブソリュート カウンティング ビーズ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C36995</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ギブコ</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ 'Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>(+)4.5 g/L D-グルコース (+)L-グルタミン (+)110 mg/L ピルビン酸ナトリウム </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>FACSClean Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FACSRinse Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td></td><td></td>340346</tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Σ</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー シース液</td><td>Beckton Dickenson</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>蛍光 実装 媒体</td><td>Dako</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス Alexa Fluor 555 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 555 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10 Media</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>11550043</td><td>(+) フェノールレッド (+) L-グルタミン (-) HEPES</td></tr><tr><td>ハンク's 平衡塩溶液 (HBSS) (1X)</td><td>マルチセル</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化馬血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ライヒェルト</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、最小 99.5% 滴定</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>ヒト トランスフォーミング成長因子 &β;1 (hTGF-&beta;1)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8915LF</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5879</td><td>別名 3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>別名 2-プロパノール</td></tr><tr><td>ルイスラット、女性</td><td>チャールズ リバー キングストン</td><td>004 (株コード)</td> <td>200-250 グラム</td></tr><tr><td>使用 LSRFortessa X-20卓上サイトメーター</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5417R</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗CD31::FITC 抗体</td><td></td><td>Abcam ab33858</td><td>クローンTLD-3A12</td></tr><tr><td>マウス抗CD45::FITC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>202205</td><td>クローンOX-1</td></tr><tr><td>マウス抗CD106::P E抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>200403</td><td>別名 VCAM-1</td></tr><tr><td>マウス 抗 MHC 抗体</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク (DSHB)</td><td>該当なし</td><td>別名 MF20</td></tr><tr><td>マウス 抗 Pax7 抗体</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク (DSHB)</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン、10 %</td><td>シグ</td><td>マ HT501128</td><td></td></tr><tr><td>オイル レッド O</td><td>ミリポア Σ</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 結合キット</td><td>Abcam</td><td>ab102903</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>(-)塩化カルシウム (-)塩化マグネシウム </td></tr> 重<tr><td>炭酸カリウム、試薬グレード</td><td>Bioshop</td><td>PBC401.250</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗線維芽細胞特異的タンパク質 1 (FSP-1) 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-32347</td><td>FSP-1 別名 S100A4</td></tr><tr><td>ウサギ抗インテグリン-a7 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab203254</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>抗ラミニン抗体</td><td>シグマ</td><td>L9393</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>抗ペリリピン-1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab3526</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>抗SCA-1抗体ミリ</td><td>ポアシグマ</td><td>AB4336</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>組換え抗コラーゲンI型抗体Abcam</td><td></td><td>ab260043</td><td>Col1a1</td></tr><tr><td>ウサギ組換え抗PDGFRとしても知られていますアルファ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab203491</td><td></td></tr>組<tr><td>換えヒトFGF-塩基性</td><td>Gibco</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S2002</td><td></td></tr>トリ<tr><td>トン-X-100</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151</td><td></td></tr>トロ<tr><td>グリタゾン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T2573</td><td></td></tr>ツ<tr><td>イーン-20</td><td>バイオショップ</td><td>TWN510</td><td></td></tr></tbody></table>

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(faps)および筋原性前駆腫(mp)の同定、分離、および特徴付け

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

線維-異形成前駆体(FAPs)は、筋形成前駆腫(MP)と共に、筋恒常性、傷害、および修復において重要な役割を果たす骨格筋の中に存在する間質細胞である。FAPsの同定および単離のための現在のプロトコルは、フローサイトメトリー/蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用し、これまでの 生体内機能 を評価する研究はマウスのみで行われてきた。ラットの大きな固有のサイズは、骨格筋傷害モデルにおけるFAPsのより包括的な分析を可能にします, 特に重度の萎縮性筋肉で、または研究者が複数の下流アッセイを行うためにかなりの組織質量を必要とする場合.ラットはさらに、動物の沈下や犠牲を必要としない筋肉機能アッセイの選択肢を増やし、連続評価を可能にすることで罹患率と動物の使用を最小限に抑えます。マウスに最適化されたフローサイトメトリー/FACSプロトコルは、種特異的であり、特に市販の抗体の特性によって制限される。それらはラットまたは非常に線維性の筋肉からFAPsを分離するために最適化されていません。.表面マーカーCD31、CD45、Sca-1、およびVCAM-1の微分発現に依存して、健康なラット骨格筋と両方からのFAPsとMPの同定と分離のためのフローサイトメトリー/FACSプロトコルが開発された。ラット特異的として、フローサイトメトリー検証された一次抗体は厳しく制限され、Sca-1を標的とする抗体の社内コンジュゲーションが行われた。このプロトコルを用いて、Sca-1の結合が成功することが確認され、FACS分離されたFAPsおよびMPの細胞培養および免疫染色によって、FAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定が検証された。最後に、新しいFAPsのタイムコースを長期(14週間)ラット脱樹モデルで報告します。この方法は、研究者が新しい動物モデルでFAPsを研究する能力を提供する。

Sca-1およびVCAM-1を含む新規抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによるFAおよびMPの同定 ラット筋のFAPsを同定するためのゲーティング戦略は、マウス29のフローサイトメトリープロトコルに基づいており、CD31(内皮)およびCD45(造血)陽性細胞(系統[Lin]と呼ばれます)のゲートであり、リンジ陰性(Lin-陰性)からのFAPsマーカーSca-1およびMP MarkerGA7の蛍光プロファイルを調べる。市販のフルオロフォア結合、およびラットSca-1およびITGA7に対するフローサイトメトリー検証抗体がない場合、ラットSca-1::APC抗体を自己結合し、MPを同定するための代替戦略を実施しました。VCAM-1は、最近、ラットMP33 およびラット特異的な、共役した、フローサイトメトリー検証抗体を標的とするVCAM-1の単一の選択マーカーであることが示されたように、ITGA7とは対照的...

このプロトコルは、ラット骨格筋から線維-異量体形成前駆体(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)を単離する方法を概説する。筋肉損傷モデルにおけるラットの利用は、分析のための萎縮性筋肉からの組織の可用性の増加と、自由に動く動物の筋力と歩行を評価するための検証された方法のより大きなレパートリーを提供する。

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

FAPsは筋肉再生および病理学的線維症のメディエーターであるため、我々のプロトコルは、FAPダイナミクスポスト筋肉損傷およびin vitroまたはex vivo研究のためのFAPsの単離の特徴付けを可能にする。現在までに、マウスから分離されたFAPsに関する研究が行われてきました。当社のプロトコルは、より大きなラットからのFAPsの効果的な分離を可能にし、下流アッセイにはるかに大きな組織可用性を提供します。長期の組織処理時間は、FAPsの生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。複数のサンプルを同時に処理する場合、2 つのオペレーターがプロトコルを並行して実行して、分離された細胞の生存率を最大化することをお勧めします。採取した筋肉組織を無菌10センチメートル細胞培養皿に入れることから始めます。組織を鉗子で軽く引き裂いてミンチし、結合組織を取り除き、約3〜4ミリメートルの立方体片を得る。6ミリリットルのDMEMと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む無菌50ミリリットルの円錐管にミンスター組織を移す。次に、300ミリモルの塩化カルシウム溶液を10マイクロリットル加えてコラゲラーゼII溶液を365マイクロリットル活性化します。活性化コラゲラーゼII溶液を組織スラリーに加えるため、1ミリリットル当たり250単位の最終濃度を得ます。チューブの側面に付着した組織を取り除くために、1時間、240 x gで37度の摂氏37度でチューブをインキュベートします。1時間のインキュベーションの後、100マイクロリットルのコラゲザーゼIIと50マイクロリットルのディスパーゼをサンプルに加えます。次いで、溶液が均質になるまで、血清ピペットを使用してピペットサンプルを15〜20回使用する。サンプルを摂氏37度で30分間、15分ごとに手動で240 x gずつインキュベートします。20ミリリットルの注射器を通して筋肉溶液サンプルをゆっくりと剪断し、20ゲージの針を10サイクルで切り取ります。その後、40ミクロンの細胞ストレーナーを無菌50ミリリットルの円錐管に置き、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補充したDMEMの5ミリリットルをピペットで湿らせる。サンプルをストレーナーを通して一度に1ミリリットルをピペットします。サンプル全体を濾過したら、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMでセルストレーナーを洗い、サンプルの総体積を25ミリリットルにします。サンプル体積を15ミリリットルの円錐形チューブ2つに均等に分割し、遠心分離機を摂氏15度、400 x gで15分間分割します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを室温で1ミリリットルのRBCライシスバッファーに7分間再懸濁する。その後、9ミリリットルの洗浄バッファーを加え、体積を摂氏15度、400 x gで15分間10ミリリットル、遠心分離機に持ち込みます。遠心分離後、上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁させる。適切な量の細胞を別の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、トリパンブルー染料と混ぜます。ヘモサイトメーターを用いて、光顕微鏡で生細胞を数える。フローサイトメトリーの場合、実験サンプルあたり1〜200万個の細胞を無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。サンプルの体積を洗浄バッファーで 1 ミリリットルにし、チューブを氷の上に置きます。実験のすべてのコントロールを設定します。細胞コントロールの場合、アリコート500、000〜100万細胞を1ミリリットルの洗浄バッファー内の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、氷の上に置く。実験が初めて行われる場合は、単染色細胞懸濁液も含める必要があります。ビーズコントロールを設定するには、ラベル付けされた1.5ミリリットルの遠心分離管それぞれに約150,000個の正補正ビーズを追加します。生存率チューブから細胞体積の半分を移し、死んだラベルの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブをリフレッシュして生存率制御を準備します。死んだチューブを摂氏65度で2~3分間インキュベートし、氷の上に置きます。インキュベーション後、死んだ細胞を生存チューブに戻します。500 x gおよび摂氏4度の実験および対照サンプルを含む単細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引した後、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞ペレットを再懸濁する。制御条件または実験条件に従って抗体を追加し、サンプルを軽くフリックして完全な混合を確実にします。その後、暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。補償ビーズの場合は、暗い温度で15分間チューブをインキュベートします。1細胞の懸濁液に900マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、補償ビードコントロールのために900マイクロリットルのPBSを加えることによって、各サンプルの体積を1ミリリットルに持って来なさい。遠心分離機単一電池懸濁液は500 x g、摂氏4度で5分間、補償ビーズは300 x g、摂氏4度で5分間コントロールします。サンプルの遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを300マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、ビーズは300マイクロリットルのPBSおよび150,000の負の補償ビーズで制御する。氷上の細胞サンプルとビーズサンプルをアルミニウム箔の下で室温に保ちます。フローサイトメトリーの取得を進めるため、線維-刺激性前駆物質および筋原性前駆物質を同定する格子戦略を設定します。代表的な分析では、健康ラット胃腸筋から発生した報酬ビーズおよび細胞懸濁液の単一染色を伴うSca-1 APC抗体の結合に成功することが確認された。Sca-1 APCの5つの異なる濃度を単細胞懸濁液に滴定し、最小限のバックグラウンド染色で最大の蛍光強度に基づいて抗体の最適濃度を同定した。ラット胃腸管内のFAPsおよびMPのフローサイトメトリック同定は、ここに示す格子戦略を用いて行った。サンプルは、ビーズを数える破片を除外するために最初にゲートされました。次に、細胞をゲートして、前部散乱および側面散乱特性の両方によって二重を除外した。得られた細胞の生存率をSYTOXブルーで染色することにより評価した。SYTOXブルーネガティブシングルは、リン+フラクションを除外するためにCD31とCD45について評価された。リン集団が評価された。Sca-1に対して単一陽性であった細胞は、FAPを指定し、VCAM-1に対して単一陽性であった細胞を、MPに指定した。並べ分け後すぐに共同免疫染色を行い、新たに単離されたFAPsの集団は、Pax7陽性細胞による汚染のないPDGFRalphaに対して陽性染色を示した。逆に、MPの分類された集団は、PDGFRalpha陽性細胞の不在でPax7に陽性に染色された。FAPsは、線維芽細胞特異的タンパク質1およびペリリピン1の発現を有する脂肪発生分化培地において、12日目に分化線維芽細胞および脂肪細胞をそれぞれ実証した。成熟した脂肪細胞からの中性トリグリセリドおよび脂質の存在は、オイルレッドO染色で明らかであった。さらに、FAPsはコラーゲン型Iの存在とミオサイトの汚染の欠如を実証した。12日目に筋形成分化培地で増殖したMPは、成熟した筋細胞と融合した多核筋管の存在を示し、線維芽細胞および椎細胞汚染を明らかにした。この技術を使用して、長期間培養するために生きた細胞を単離する場合、研究者は無菌技術を使用し、同時に良好な細胞生存率を確保するために効率的に作業する必要があります。

identification-isolation-characterization-fibro-adipogenic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。...

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

健康な筋肉組織を筋肉内脂肪で置き換えることは、ヒトの疾患および状態の顕著な特徴である。このプロトコルは、筋肉内脂肪を視覚化、画像化、定量化する方法を概説し、筋肉内脂肪形成の根底にあるメカニズムの厳密な研究を可能にします。...

骨格筋における筋肉内脂肪形成とその細胞起源を調べるためのガイド

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

このプロトコルの目標は、口腔顔面筋線維症モデルを確立することです。凍結傷害後のマウス咬筋と前脛骨筋の組織型の比較により、咬筋線維症が確認された。このモデルは、口腔顔面筋線維症の根底にあるメカニズムのさらなる調査を容易にします。...

口腔顔面筋線維症モデルを確立するためのマウス咬筋の凍結損傷

ここで紹介するプロトコールは、シングルセルマスサイトメトリーによる筋幹細胞および前駆細胞の同定と高次元解析、およびFACSによるそれらの精製を可能にし、それらの機能の詳細な研究を可能にします。このアプローチは、疾患モデルにおける再生動態の研究や、薬理学的介入の有効性の検証に適用することができます。...

高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析

このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。...

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

学ぶラット骨格筋からの線維-刺激性前駆細胞(FAPs)と筋原性前駆細胞(MP)の同定・分離・特徴付け方法。コラゲナーゼ処理とフローサイトメトリーにより、筋損傷後の細胞動態を解析し、再生医療研究に応用可能です。

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

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