マウスモデルにおける心筋梗塞後のMSC負荷注入性ヒドロゲルの筋内移植

この方法は、梗塞性心臓の移植細胞の保持と生存率が低いことへの適用性が低いなど、現在の悪化した心臓治療の主要な問題に対処するのに役立ちます。この問題に対処するために、この方法は、マウスモデルで注射可能なハイドロゲルを使用して幹細胞による心筋内心筋移植を研究するための信頼性の高い技術を提供でき、心筋梗塞後の心臓組織の修復と再生を調査するために使用する優れたプラットフォームです。この技術の主な利点は、in-situ架橋カバー注射可能なハイドロゲルを使用して、心筋内移植後の移植幹細胞の保持と生存を改善するための実行可能な方法であることです。

これらのハイドロゲルは、幹細胞だけでなく、成長因子、遺伝物質、薬物も送達して、梗塞性心組織の治療効果を最大化するなど、心臓組織工学に多様な機会を提供します。invitro実験の手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるEunmi Leeです。Eun-Hye ParkとEunhwa Seongの研究技術者が、生体内実験の手順を実演します。

間葉系幹細胞(MSC)を100mmの培養皿で、摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。細胞が80%のコンフルエントに達したら、皿をDPBSで2回洗い、摂氏37度で1ミリリットルのトリプシン代替品と3分間インキュベートします。次に、9ミリリットルの培地を細胞に加え、Gの500倍で3分間遠心分離します。

得られた上清を破棄します。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、細胞懸濁液を氷上に保持します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーで希釈し、自動セルカウンターを使用して細胞濃度を測定します。

MSCを1ミリリットルあたり7番目の細胞の1×10の密度に再懸濁し、それらを1ミリリットルのチューブに移します。PBSで6.25%GHのコンジュゲート溶液を調製し、2つのバイアルに分離します。次に、GH溶液をHRP1ミリリットルあたり6マイクログラムまたは0.07%過酸化水素と混合します。

細胞懸濁液をGの1000倍で短時間遠心分離し、得られた上清を慎重に吸引します。次に、セルペレットをGH溶液Aと混合し、GH溶液AとGH溶液BのMSCをデュアルシリンジの両側にロードします。GH溶液とMSCを組み合わせた300マイクロリットルを、最終密度500万細胞/ミリリットルで8ウェルチャンバースライドにプレートします。

in situハイドロゲル形成とその後の酵素架橋によるMSCカプセル化の後、10%FBSと1%の抗生物質抗真菌溶液を含む700マイクロリットルのDMEMを添加します。スライドを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。手術前に、脱毛クリームを使用してマウスの胸部を剥離し、ヨウ素で皮膚を滅菌します。

マウスを手術台に置き、カテーテルを気管に挿入して挿管し、機械換気によって酸素を補給します。手術用ハサミで皮膚をやさしく切ります。次に、マイクロハサミで肋間筋を貫通します。

5-Oシルク縫合糸を使用して左肋骨の2番目と3番目の肋骨を分離し、胸腔を開いた状態に保ちます。左前下行冠状動脈を、8-0のニードルホルダーを使用して慎重に結紮します。ポリプロピレン製縫合糸を縫合し、電気焼灼を使用して縫合糸を切断します。左前心室壁の即時の色の変化を観察します。

心筋梗塞を誘発した後、10マイクロリットルのMSCローディングGH溶液を梗塞境界ゾーンの2つの異なるポイントに注入します。開いた胸腔を修復し、5-0縫合糸を使用して筋肉と皮膚を閉じます。気管チューブを取り外し、回復中はマウスを赤外線ランプの下のケージに入れます。

心エコー検査を実施し、左室前壁、左室内壁、左室後壁の対応する線を測定して、心臓壁の厚さ、チャンバーの寸法、および分数短縮を取得します。in vivo移植に先立ち、GHヒドラゲル中のMSCの増殖と生存は、3D in vitro生死細胞染色アッセイによって確認されました。代表的な画像は、GHハイドロゲル内の分岐ネットワークを示す十分なMSC増殖を示しました。

MSCの広範な多細胞3D構造が14日目に明確に観察され、GHハイドロゲルがカプセル化された細胞に適切な微小環境を提供できることが示されました。心筋梗塞の誘発後、MSCローディングGHハイドロゲルを心筋内梗塞領域に移植した。MSCとゲルは梗塞領域内で適切に維持されました。

MSCはGHハイドロゲルに良好に統合されていました。MSCローディングGHハイドロゲルの治療効果を検証するために、移植後28日目に心エコー検査と組織学的分析により心機能および心機能の変化を評価し、異なる治療群間で比較しました。代表的な心エコー検査では、MSCゲル治療群のフラクショナル短縮、駆出率、収縮期末容積などの心機能の改善が示されました。

さらに、組織学的分析では、MSCゲル治療群では、他の群よりも線維化が少なく、梗塞壁が厚く、梗塞サイズが小さいことが示され、このプロトコルがLVリモデリングを大幅に減衰させたことを示しています。この技術により、マウスモデルにおいて、心筋梗塞後の幹細胞の長期化と増殖を達成し、心筋梗塞後の心臓の構造と機能の大幅な改善をもたらしました。この技術は、大動物での使用や、心臓組織の修復と再生を提供することにより、梗塞後心不全を予防するための新しい戦略としての臨床応用に拡張できます。