懸濁液中の金ナノ粒子のサイズに対する非対称流量場流分画

このプロトコルは、未知の金ナノ粒子サンプルのサイズを決定するためのUV-vis検出と組み合わせた非対称流動フロー分画の使用について説明する。

非対称流場-流れ分画を外部サイズキャリブレーションと組み合わせて使用することは、懸濁液中の金ナノ粒子のサイズ分布を正確に決定するための強力なツールです。AF4は、1ナノメートルから1000ナノメートルまでの全サイズ範囲をカバーします。サンプル成分のサンプル組成から独立しており、分散が不十分な複雑なサンプルにも適用できます。

AF4の優れた点は、さまざまな性質やサイズのナノ粒子だけでなく、タンパク質、ウイルス、合成または天然の高分子も含む、非常に幅広いアプリケーション範囲にあることです。まず、任意の金ナノ粒子サイズの標準試料を1リットルあたり50ミリグラムで2分間ボルテックスし、その後、標準試料を超純水で1対4の比率に希釈します。次に、希釈した溶液をさらに2分間ボルテックスして、均質化された懸濁液を得ます。

システムをクリーニングした後、AF4カートリッジを開いてAF4メンブレンを交換できるようにします。新しいメンブレンをUPWですすぎ、カートリッジを再度組み立てます。次に、カートリッジをAF4-UV-visシステムに再接続します。

洗浄したAF4-UV-visシステムを、チップ流量1ミリリットル/分、フォーカス流量1ミリリットル/分、クロスフローレート1.5ミリリットル/分に適用することにより、ろ過および脱気溶離液で少なくとも30分間フラッシュし、メンブレンを平衡化し、システムを安定させ、潜在的な漏れがないか確認します。システム圧力は、4〜12バールの一定レベルに達する必要があります。任意の金ナノ粒子サイズ標準を使用して質量回収率と保持時間の変動を決定することにより、AF4-UV-visシステムを適格化するには、分離力を加えずに直接注入を実行します。

次に、分離力を適用して分画を実行します。外部サイズキャリブレーションボルテックス用の金ナノ粒子サイズ標準を調製するには、50ミリグラム/リットルの金ナノ粒子サイズ標準液のすべてを2分間使用し、各サンプルを超純水で1対4の比率で分析するために希釈します。サイズ標準が整いましたら、FFF法タブで検出器の流量を500μL/分、注入流量を500μL/分、注入時間を0.1分に設定してください。

分離力を定義せずに溶出時間を8分に設定し、最初の標準物質の10マイクロリットルをシステムに注入します。すべてのサイズ標準が測定されたら、最初の標準を50マイクロリットルシステムに注入します。検出器の流量を毎分500マイクロリットルに設定します。

遅延を 2 分、注入流量を 200 マイクロリットル/分、5 分間、移行時間を 0.2 分に設定します。フォーカス流量は自動的に計算されます。溶出時間を60分、クロスフローレートを1ミリリットル/分に設定してください。

このAF4法は、一定のクロスフローレートを使用し、その後、10分間にわたって毎分0マイクロリットルまで線形減衰します。リンスステップを9分に設定し、チップの流量は毎分500マイクロリットルです。すべての金ナノ粒子サイズ標準試料を分画したら、未知なる金ナノ粒子サンプルを調製し、示したように未知なる金ナノ粒子サンプルの直接注入測定と分画を行います。

データを分析するには、データをインポートします filesシステムソフトウェアに。概要タブで測定値を表示し、検出器リストからUV-vis検出器信号を選択します。各測定の関心領域とベースラインを定義し、必要に応じて信号とベースラインのビューを調整します。

信号処理ツールボックスを使用してノイズの多い信号を平滑化し、処理パラメーターを他の実行に割り当てる関数を使用して、パラメーターを他の測定値に割り当てることができます。質量回収計算を実行するには、直接注入の測定と分画データを開きます。直接注入キャリブレーションを挿入し、直接注入キャリブレーション設定ビューからそれぞれの直接注入測定値を選択します。

サンプルの注入量と濃度は、ピーク面積と注入量を相関させるために使用されます。次に、選択した粒子プリセットへの割り当て機能を使用して、取得したキャリブレーション関数をそれぞれの分画測定値に割り当てます。次に、この式を使用して、分画測定と直接注入測定のそれぞれのUV-visピークの下の面積を比較することにより、金ナノ粒子の質量回収を計算します。

結果を照会するには、定量的結果計算を開きます。ピーク面積に基づく質量濃度を示します。質量回収率は、この値を注入された濃度と比較することで得られます。

粒子径キャリブレーションウィンドウの[粒子サイズ]タブで、[キャリブレーション対象の選択]参照テーブルで適切な各測定値をクリックして、すべてのキャリブレーション実行を選択します。測定値は、選択されるとテーブルに表示されます。すべてのキャリブレーション測定の流体力学的半径を入力します。

関数と式は、粒度校正機能ウィンドウに表示されます。未知の金ナノ粒子サンプルの測定にキャリブレーション機能を割り当てるには、割り当ての実行を選択リストでそれぞれの分画を選択し、粒度分布計算を開いて結果を表示します。計算されたサイズは、ピークの最大値にラベル付けされたサイズ分布ウィンドウに表示されます。

また、以前に作成した粒子径キャリブレーションは、未知の金ナノ粒子サンプル測定のキャリブレーションとしてリストされます。1 つのサンプルのすべての測定値を平均化するには、[サンプルの平均信号] チェック ボックスをオンにします。結果はピーク最大ラベルに表示されます。

ここでは、AF4で分画され、532ナノメートルの波長での粒子の吸光度の紫外可視分光法測定によって検出された金ナノ粒子サイズ標準の代表的なオーバーレイが示されています。各ナノ粒子のそれぞれの紫外可視分光法ピーク最大値におけるすべての保持時間の相対標準偏差は、3倍測定から得られた1.1%未満でしたこれらのデータの線形回帰分析により、2乗相関係数R二乗が0.9958の線形較正関数が得られました。次いで、未知の金ナノ粒子サンプルから9つのAF4-UV-vis分光法フラクトグラムを得たとき、それぞれの保持時間の相対標準偏差は有意に低く、0.1〜0.5%の範囲であった金ナノ粒子サイズ標準の分画から得られた粒子サイズ較正機能を使用し、これらのデータをUV-vis分光法ピーク最大で得られた未知の金ナノ粒子サンプルの保持時間と相関させ、 全体の平均流体力学的半径を計算できます。

さらに、金ナノ粒子サンプルの著しい凝集または溶解、または粒子の膜表面への有意な吸着がないことを示す合理的な質量回収率を得ることができました。外部サイズキャリブレーションとAF4分析を使用する場合、同じAF4メソッドがすべてのサイズ標準とサンプル自体に一貫して適用されることが最も重要です。AF4により、研究者はナノ粒子サンプルの特性をよりよく理解することができます。

したがって、これは、最終的にナノ対応製品の有効性を向上させるのに役立つ重要な品質管理ツールです。