COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化
2020年12月14日
緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。
このプロトコールの重要性は、さまざまな抗菌条件下でin vitroバイオフィルム構造を定量するためのシンプルで再現性のあるフレームワークを提供することです。この手法の主な利点は、COMSTATの手動操作に関連する主観的なばらつきを排除するのに役立ち、最終的に研究センター間での実験の標準化と透明性を促進することです。緑膿菌の培養物をイメージングするには、適切なレーザー励起波長とフィルターセットを備えた共焦点顕微鏡のステージにプレートを置きます。
また、20〜25倍の水浸レンズを使用して、基層から各バイオフィルムセグメントの上部まで、0.3マイクロメートル刻みで少なくとも6つの層状のzスタック画像をキャプチャします。次に、COMSTAT 解析のためにイメージを OME-TIFF として保存します。すべての画像を取得したら、ImageJでCOMSTAT2パッケージを開き、デスクトップ上にソースフォルダを作成します。
フォルダに OME-TIFF を 1 つ追加し、ソース フォルダから OME-TIFF を開きます。バイオマスを含まない空のレイヤーをすべて削除します。「ファイル」、「インポート」、および「イメージシーケンス」を選択して、ファイルを ImageJ にインポートします。
ソースフォルダを開かずに検索して強調表示し、[選択]をクリックします。シーケンスオプションウィンドウが表示されたら、[OK]をクリックします。「イメージ」、「変換」、および「Z を反転」を選択して、バイオフィルムの向きを反転し、基層がスタックの一番上になるようにします。画像のプロパティを定義するには、[画像とプロパティ]を選択すると、ソースウィンドウが表示されます。
長さの単位をミクロンに指定し、ボクセルの深さを 0.3 に定義して、[OK] をクリックします。「イメージ」、「調整」、および「しきい値」を選択します。しきい値ウィンドウで画像のしきい値を調整するには、下側のスライダーを右端に置いて最大しきい値を手動で設定し、上のスライダーを使用して最小しきい値を設定します。次に、画像ウィンドウのスライダーを使用して各レイヤーをスクロールし、スタック全体でバックグラウンドノイズが十分に除去されていることを確認し、[設定]を選択して下限しきい値を固定します。
[しきい値レベルの設定] ウィンドウで [OK] を選択し、同様に最大しきい値を設定および固定します。[適用] を選択し、表示される [スタックをバイナリに変換] ウィンドウで [OK] をクリックし、しきい値ウィンドウを終了します。「Plugins」、「Bio-Formats」、および「Bio-Formats Exporter」を選択して、ソースフォルダに新しいファイル名でファイルを保存します。
Bio-Formats Exporter multiple filesウィンドウが表示されたら、OKを選択します。Bio-Formats Exporterオプションウィンドウが表示されたら、再度OKを選択します。COMSTATを実行するには、プラグインとCOMSTAT2を選択すると、バージョン情報ウィンドウが表示され、[Observed Directories]ウィンドウで選択 OK.In、[Add]を選択し、ソースフォルダを見つけて強調表示し、[Choose]を強調表示してクリックします。「Images in Directories」ウィンドウが表示され、分析対象のOME-TIFFがリストされます。
COMSTAT2.1 ウィンドウで、[Automatic Thresholding Otsu's Method] と [Connected Volume Filtering] の選択を解除して、ソフトウェアが個々の OME-TIFF にプリセットしきい値を使用するようにします。COMSTAT2.1ウィンドウで、[バイオマス]、[厚さ分布]、および[表面積]を選択し、[実行]をクリックしてプログラムを実行します。出力データはログウィンドウに表示されます。
測定値は、ソースフォルダにTXTファイルとして自動的に保存されます。この代表的な解析では、感染した嚢胞性線維症患者から培養した緑膿菌分離株を使用して、このアプローチの長所を実証し、in vitroバイオフィルム構造の抗菌薬による変化を不正確に定量化しました。ライブセルイメージングは、バイオフィルム特異的モノクローナルおよびトブラマイシン処理の前後の緑膿菌バイオフィルム構造の変化を視覚化することもできます。
COMSTATのデータ解析により、処理されたバイオフィルム構造と対照培養物の間に有意差があることが明らかになりました。トブラマイシン処理した培養物では、平均厚さとバイオマスの明らかな減少が観察されました。しかし、抗体の存在下では、緑膿菌のバイオフィルムはこれらのトブラマイシンによる構造変化に対して抵抗性を示しました。
表面とバイオボリュームの比率を調べると、トブラマイシンに曝露したバイオフィルムと非曝露したバイオフィルムの両方で抗体の存在下で有意な減少が観察され、抗体処理培養物における凝集体の形成が示されました。この手順は、バイオフィルムマトリックスを破壊するために使用されるさまざまな抗菌剤の効果を定量的に評価または比較するために実行できます。この手法を一般的なフレームワークとして使用することで、研究者は、バイオフィルムの不均一性をよりよく表現するために、新しい数学的モデルやアルゴリズムプラグインをImageJに含めるために、プロトコルを改良するさまざまな方法を模索することができます。
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概要
本研究では、さまざまな抗菌条件下におけるPseudomonas aeruginosaのバイオフィルム構造を定量化するための再現可能なフレームワークを提示します。このプロトコルは、バイオフィルム構築の評価を標準化し、研究センター間での透明性を高めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- バイオフィルム研究
- 抗菌有効性
背景
- Pseudomonas aeruginosaは、嚢胞性線維症患者における一般的な病原菌です。
- バイオフィルムの構造は、治療結果に影響を及ぼす可能性があります。
- 抗感染剤を評価するには、バイオフィルムの特性を定量化することが不可欠です。
- COMSTATソフトウェアは、バイオフィルムを客観的に分析するための手法を提供します。
研究目的
- 臨床分離株間におけるバイオフィルム構造の変動を定量化すること。
- 異なる抗菌剤の有効性を評価すること。
- バイオフィルム解析における主観的な変動を排除すること。
使用した手法
- バイオフィルム構造のイメージングのための共焦点顕微鏡。
- バイオフィルム特性の定量化のためのCOMSTATソフトウェア。
- イメージングには20〜25倍の水浸レンズを使用。
- 0.3 µm刻みでのz-stack画像の取得。
主な結果
- 分離株によってバイオフィルム構造に差異が観察された。
- 本プロトコルにより、実験間での標準化された解析が可能となった。
- COMSTAT解析により、バイオフィルム評価のための客観的な指標が得られた。
- バイオフィルムの特性に基づいて、抗菌薬の有効性を評価した。
結論
- 本プロトコルは、バイオフィルム研究における再現性を向上させます。
- 標準化により、実験結果の信頼性が高まります。
- 今後の研究では、さらなる調査のためにこの枠組みを活用することが可能です。
よくある質問
産業界への適用性
バイオフィルム構造に対する抗菌効果を標準化して定量化することは、抗感染症薬開発におけるターゲットバリデーションを後押しします。バイオフィルムの客観的な指標を用いることで、化合物の曝露と構造的な結果を関連付け、治療候補物質のメカニズム的なリスク低減が可能になります。このアプローチは、研究室間でのバイオフィルム表現型の評価におけるばらつきを抑えることで、前臨床スクリーニングにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： バイオフィルムの厚さ、バイオマス、および表面積対バイオボリューム比の変化を定量化することで、抗菌メカニズムの解析を可能にする。
- 運用的価値： 画像解析における主観的なばらつきを低減し、異なる施設間での再現性のある標的結合評価を支援する。
- 予測的価値： 抗バイオフィルム efficacy の定量的しきい値を提供することで、go/no-go 判断を容易にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物スクリーニングキャンペーンに向けて、標準化された定量的な読み取り値（バイオマス、厚さ分布、表面積）を生成します。
- 運用的価値： ハイコンテンツ共焦点プラットフォームと互換性のある、再利用可能なイメージングおよび解析ワークフローを確立します。
- アッセイの準備状況： 抗菌剤または抗バイオフィルム剤の下流評価に向けた、検証済みのバイオフィルムシステムを準備します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：in vitroでのバイオフィルム表現型を、嚢胞性線維症感染症から得られた臨床的に重要なPseudomonas aeruginosa分離株に結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：バイオフィルム構造への抗菌効果と細菌の生存能への影響を区別し、作用機序を明確にします。
- リスク調整後の推進：耐性表現型を誘導することなくバイオフィルム構造を破壊する化合物の優先順位付けを支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、構造活性相関を明らかにするための定量的なバイオフィルム表現型解析を提供します。
- 探索生物学：抗菌治療とバイオフィルム構造の測定可能な変化を関連付けることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：固定しきい値の設定とユーザー依存のセグメンテーションの排除により、アッセイの標準化と再現性を可能にします。
- 分析：抗菌条件の直接比較を可能にする、客観的かつ定量的な出力（バイオマス、厚さ、表面積）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連する P. aeruginosa 分離株を用いることで、前臨床の連続性とバイオマーカーの一致を高めます。
- エンタープライズ再利用：他のバイオフィルム形成病原体や抗菌薬クラスに適応可能な標準化されたフレームワークを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：不均一なバイオフィルム構造の誤解を最小限に抑えることで、抗バイオフィルム活性の予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：COMSTAT操作における主観的なばらつきを排除し、標準化とラボ間の比較可能性を高めます。
- 戦略的価値：バイオフィルムの影響に関する特性評価の不備に起因する前臨床段階での移行失敗を減らし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：定量的なバイオフィルム破壊しきい値に基づいた、リスク調整後の推進決定を可能にします。
実施上の検討事項
- z-stackの取得および前処理を行うための、共焦点顕微鏡法と画像処理に関する専門知識が必要です。
- 適切な励起波長と20–25xの水浸対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡へのアクセスが必須となります。
- COMSTAT2によるバッチ解析を行うため、標準化された画像フォーマット（OME-TIFF）とフォルダ構成にする必要があります。
- 異なるバイオフィルムモデルや抗菌メカニズムに適用する場合、調整上の検討が必要です。
- 自動COMSTAT解析前の手動による画像前処理に時間を要することが制限となります。
