Name: 細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ乳がん幹細胞の単離と機能評価法。細胞・組織サンプルから高純度・高生存率でBCSCを分離し、in vitroおよびin vivoアッセイで腫瘍形成能と転移制御メカニズムを解明する手法です。

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研究室のメンバーの有益な議論とサポートに感謝します。乳がん幹細胞と腫瘍微小環境に関する私たちの研究は、カナダがん研究協会研究所および米国陸軍国防総省乳がんプログラム(Grant # BC160912)からの助成金によって資金提供されています。V.B.はウエスタン・ポスドク・フェローシップ(ウエスタン大学)の支援を受けており、A.L.A.とV.B.はどちらもカナダ乳がん協会の支援を受けています。CLは、カナダ政府からのバニエカナダ大学院奨学金によってサポートされています。

同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集することは、施設倫理委員会によって承認された承認された人間の倫理プロトコルの下で実施されました。患者由来の異種移植片モデルを生成するために使用されたすべてのマウスは、施設が承認した動物施設で維持および収容された。マウスを用いた患者由来の異種移植片モデルからの腫瘍組織は、施設動物管理委員会によって承認された承認された倫理プロトコルに従って生成された。
1. 細胞株の作製
<ol><li>バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下ですべての細胞培養および染色手順を実行します。滅菌済みの細胞培養皿/フラスコおよび試薬を使用してください。</li>
	<li>ヒト乳がん細胞を37°Cに維持し、ウシ胎児血清(FBS)および各細胞株に特異的に必要な成長因子を添加した定義培地に5%CO2 を入れます。</li>
	<li></li><li></ol><ol><li><li><li></ol><ol><li><li><li></li><li> </li><li></li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></ol><ol><li><li></li><li> </li><li></li><li> </li><li><li></li><li><li></li><li></li><li>&amp;B </li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61775/61775fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61775/61775fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61775/61775fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61775/61775fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li><li><li></li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61775/61775fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61775/61775fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li><li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

乳がんの転移と治療に対する抵抗性は、世界中の女性の死亡の主な原因となっています。乳がん幹細胞(BCSC)の亜集団の存在は、転移の増強に寄与する26、43、44、45、46および治療抵抗性21、47、48に寄与する。したがって、将来の治療の焦点は、より良い治療結果を達成するためにBCSCを根絶することを目指すべきであり、これには、in vitroおよびin vivoの両方の方法を使用してBCSCの機能特性を単離および特徴付けるための正確な方法が必要です。
<p class="jove_co...

ヒト乳がん幹細胞(BCSC)の細胞的および分子的メカニズムを理解することは、乳がん治療で直面する課題に取り組むために重要です。BCSCの概念の出現は21世紀初頭にさかのぼり、CD44 + CD24-/低乳がん細胞の小さな集団がマウスで不均一な腫瘍を生成できることが判明しました1,2。その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が高い(ALDHhigh)ヒト乳がん細胞も同様の幹細胞様特性を示すことが観察されました3。これらのBCSCは、自己複製および分化が可能な細胞の小さな集団を表し、バルク腫瘍の不均一な性質に寄与する1、2、3。進化的に保存されたシグナル伝達経路の変化がBCSCの生存と維持を促進することを示唆する証拠の蓄積4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 .さらに、細胞外因性微小環境は、異なるBCSC機能を指示する上で極めて重要な役割を果たすことが示されている15、16、17。これらの分子経路とBCSC機能を調節する外的要因は、乳がんの再発、転移18、および治療に対する耐性の発達に寄与しており19,20,21、治療後のBCSCの残存存在は、乳がん患者の全生存に大きな課題をもたらします22,23。.したがって、これらの因子の前臨床評価は、乳がん患者のより良い治療結果と全生存期間の改善を達成するために有益である可能性のあるBCSC標的療法を特定するために非常に重要です。
いくつかのインビトロヒト乳癌細胞株モデルおよびインビボヒト異種移植片モデルが、BCSCを特徴付けるために使用されています24、25、26、27、28、29。連続継代のたびに細胞株が継続的に再増殖する能力により、これらはオミクスベースおよび薬理ゲノム研究を実施するための理想的なモデルシステムになります。しかし、細胞株は、患者サンプルで観察された不均一性を再現できないことがよくあります。したがって、細胞株データを患者由来のサンプルで補完することが重要です。BCSCを最も純粋な形で単離することは、BCSCの詳細な特性評価を可能にするために重要です。 この純度を達成することは、BCSCに特異的な表現型マーカーの選択に依存します。 現在、ALDH高CD44 + CD24-細胞表現型は、最大純度の蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、バルク乳がん細胞集団からヒトBCSCを区別および分離するために最も一般的に使用されています1、3,26。さらに、自己複製、増殖、分化などの単離されたBCSCの特性は、in vitroおよびin vivo技術を使用して評価できます。
例えば、インビトロコロニー形成アッセイは、異なる処理条件30の存在下で50個以上のコロニーを形成するために単一細胞が自己複製する能力を評価するために使用することができる。マンモスフェアアッセイは、足場非依存条件下での乳がん細胞の自己複製の可能性を評価するためにも使用できます。このアッセイは、無血清非接着培養条件における各連続継代において、単一細胞がスフェア(BCSCと非BCSCの混合物)として生成および増殖する能力を測定する31。さらに、3次元(3D)培養モデルを使用して、 in vivo 微小環境を厳密に再現し、潜在的なBCSC標的療法の活性の調査を可能にする細胞-細胞間および細胞-マトリックス相互作用を含むBCSC機能を評価できます32。in vitroモデルの多様なアプリケーションにもかかわらず、in vitroアッセイのみを使用して in vivo 条件の複雑さをモデル化することは困難です。この課題は、マウス異種移植片モデルを使用して in vivoでのBCSC挙動を評価することで克服できます。特に、このようなモデルは、乳癌転移33を評価し、疾患進行中の微小環境との相互作用を調査し34、 in vivo イメージング35、および抗腫瘍剤34の患者特異的毒性および有効性を予測するための理想的なシステムとして役立つ。
このプロトコルは、不均一な乳がん細胞のバルク集団から最大純度でヒトALDH高CD44 + CD24-BCSCを単離するための詳細な説明を提供します。また、3つのin vitro技術(コロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、および3D培養モデル)と、BCSCのさまざまな機能を評価するために使用できるin vivo腫瘍異種移植アッセイの詳細な説明も提供します。これらの方法は、BCSC生物学の理解および/または新規BCSC標的療法の調査を目的として、ヒト乳がん細胞株または初代患者由来の乳がん細胞および腫瘍組織からのBCSCの単離および特性評価に関心のある研究者による使用に適しています。

<table><tbody><tr><td>7-アミノアクチノマイシンD(7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>提案:0.25 &micro;g/1x106</td></tr>細胞 <tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)基質</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されている。ALDH基質調製については、製造元の指示に従って</td></tr>ください <tr><td>基底膜抽出物(BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>商品名Matrigel</td></tr><tr><td>で販売されています細胞培養プレート:6ウェル</td><td>コーニング</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート:60mm</td><td>コーニング</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート:96ウェル超低接着</td><td>コーニング</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー:40ミクロン</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>幹細胞技術</td><td>7001</td><td>PBS中の3mg/mLコラーゲンを1:30希釈液で調製</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td></td><td>Sigma 11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>コニカルチューブ:50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>ディ</td></tr><tr><td>スパーゼ</td><td>ステムセルテクノロジー</td>ズ <td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x、L-グルタミンおよび15 mM HEPES付き</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0.1 mg/mL 最終濃度</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&nbsp;</ストロング></td></tr><tr><td>フローチューブ:5ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>ポリプロピレン丸底チューブ</td></tr><tr><td>メタ</td><td>ノールフィッシャー</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD24 抗体</td><td></td><td>BD 561646</td><td>R-フィコエリトリンおよびシアニン色素 結合 クローン:ML5</td></tr><tr><td>マウス 抗ヒト CD44 抗体</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-フィコエリトリン結合、クローン:G44-26</td></tr><tr><td>N、N-ジエチルアミノベンズアルデヒド (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>ALDEFLOUR Assay kitの一部として市販されています。製造元の指示に従ってください DEAB調製</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, カルシウムおよびマグネシウムなし</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media組成</強い ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x、L-グルタミンと 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>シグマ</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>16634</td><td>5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D オルガノイド培地 組成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x、L-グルタミンおよび 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>シグマ</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>神経反射 &β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Σ</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro;メートル</td></tr></tbody></table>

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

乳がん幹細胞(BCSC)は、遺伝性または後天性の幹細胞のような特徴を持つがん細胞です。頻度が低いにもかかわらず、乳がんの開始、再発、転移、治療抵抗性の主な原因です。乳がんを治療するための新しい治療標的を特定するためには、乳がん幹細胞の生物学を理解することが不可欠です。乳がん幹細胞は、CD44、CD24などのユニークな細胞表面マーカーの発現およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性に基づいて単離および特徴付けられます。これらのALDH高CD44+CD24- 細胞はBCSC集団を構成し、下流の機能研究のために蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離することができます。科学的問題に応じて、異なるインビ トロ および インビボ の方法を使用して、BCSCの機能的特性を評価することができます。ここでは、乳がん細胞の不均一な集団と乳がん患者から得られた原発腫瘍組織の両方からヒトBCSCを単離するための詳細な実験プロトコルを提供します。さらに、BCSC機能の評価に使用できるコロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、3D培養モデル、腫瘍異種移植アッセイなど、下流のin vitro および in vivo 機能アッセイを強調しています。

記載されたプロトコルは、細胞株または解離した腫瘍組織のいずれかからの乳癌細胞の不均一な集団からのヒトBCSCの単離を可能にする。特定の細胞株または組織サンプルについて、汚染された非BCSC集団が変動する可能性があるため、BCSCを最大純度で単離するための均一な単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 厳格な選別戦略を適用すると、汚染された非BCSCの存在が最小限に抑えられ、乳がん細胞の割合を収集する能力が得られます。癌細胞のバルク集団と区別する細胞表現型を示す幹細胞のような特徴を持つ。ALDH酵素活性の増強、高レベルの細胞表面マーカーCD44を発現し、CD24の低/陰性発現を示すヒト乳癌細胞は、ALDH高CD44+CD24-表現型を有し、BCSCに分類することができる。バルク集団におけるBCSCの割合は、細胞株または患者によって異なる可能性があり(図2)、多くの場合、疾患の病期に依存し、より侵攻性の乳がんは通常、BCSCの割合が高くなります26...

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

この技術により、研究者は乳がん幹細胞を最大純度と生存率で単離し、in vitroおよびin vivoの両方の機能特性評価アッセイの性能を向上させることができます。単離された乳がん幹細胞は、腫瘍原性や転移を制御する分子イベントの解明や、これらの細胞を標的とする治療戦略の設計にも活用できます。関心のある細胞や組織の種類に特異的なわずかな修飾により、この方法は他のシステムにも適用できます。細胞培養物から単一細胞懸濁液を生成するには、80%コンフルエントな乳がん細胞培養物をPBSで洗浄し、適切な細胞解離溶液で室温で5分間細胞を処理します。細胞が分離したら、5ミリリットルの培地を加えて細胞解離溶液を中和し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁してカウントします。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ALDH基質バッファーの1ミリリットルあたり10〜6細胞で細胞を再懸濁します。組織サンプルから単一細胞懸濁液を生成するには、外科用ブレードを十字型で使用して、腫瘍組織を約1mmのサイズに細かく刻みます。10ミリリットルの解離緩衝液が入った50ミリリットルの円錐管にピースを置きます。チューブをパラフィルムでシールし、シェーカーで摂氏37度で40分間インキュベートし、消化した組織片を遠心分離によって沈殿させます。5ミリリットルのピペットを使用してペレットを5ミリリットルのトリプシンに再懸濁し、組織を37度の水浴中で5分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、組織を数回激しくピペットで動かして単一細胞を放出し、チューブ内の総容量を25ミリリットルにするのに十分なDMEM/F-12培地を追加します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1ミリリットルのDisplace DNAseに再懸濁し、摂氏37度の水浴中で5分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、PBSで総容量を10ミリリットルにします。ピペッティングで細胞を混合し、40ミクロンの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに継ぎます。遠心分離後、細胞を5ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁してカウントします。コロニー形成アッセイを実施するには、選別後、細胞を完全培地に再懸濁し、1本あたり2ミリリットルの培地を含む3本のチューブのそれぞれに適切な数の乳がん幹細胞を添加し、10倍を2本目、10倍を2倍、または10倍を2本目の細胞に5倍標識します。ピペットを5回上下させて細胞懸濁液を完全に混合し、細胞を6ウェルプレートの個々のウェルにプレートします。プレートを静かに渦巻かせて均一な細胞分布を取得し、コロニーが現れるまでプレートを細胞培養インキュベーターに置きます。インキュベーションの終了時に、ウェルあたり1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、ウェルあたり500マイクロリットルの0.05%クリスタルバイオレット溶液で細胞を30秒間染色します。インキュベーションの最後に、ウェルごとに2ミリリットルの水でウェルを2回洗浄して余分な色素を除去し、4倍または10倍の倍率の光学顕微鏡でウェルあたりのコロニーの総数をカウントして記録します。マンモスフィアアッセイを行うには、ソーティング後、細胞を完全なマンモスフィア培地に再懸濁し、96ウェルの超低接着細胞培養プレートでウェルあたり1平方センチメートルの面積あたり第2の細胞の10倍の着座密度でプレート化する。光学顕微鏡でウェルあたりのマンモスフィアの数を数える前に、プレートを細胞培養インキュベーターに5〜10日間置きます。3D培養モデルを設定するには、気泡のない96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの基底膜抽出物を慎重に追加し、プレートを摂氏37度に1時間置いて溶液を重合させます。ゲル層の乾燥を避けるために、10分後に100マイクロリットルのPBSを追加します。インキュベーションの終了時に、選別した細胞を3D培養培地濃度200マイクロリットルあたり10〜3番目の細胞の5〜50倍に懸濁し、96ウェルプレートの各ウェルのPBSを細胞を含む培地200マイクロリットルに交換します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに10〜14日間置いてから、培養物のオルガノイド形成を評価します。ALDH酵素活性が増強されたヒト乳がん細胞は、CD44を高レベルで発現し、CD24の発現レベルは低から負であり、乳がん幹細胞として分類できます。バルク集団内の乳がん幹細胞の割合は、細胞株または患者によって異なり、多くの場合、疾患の病期によって異なり、より侵攻性の高い乳がんは通常、乳がん幹細胞の割合が高くなります。単一の乳がん細胞が自己再生し、50個の細胞のコロニーを生成する能力は、コロニー形成アッセイによって評価できます。乳がん幹細胞がアンカレッジに依存しない実験条件下で自己複製する能力は、マンモスフィアアッセイによって評価できます。乳がん細胞と基底膜抽出物を培養することで、乳がん幹細胞はin vivo条件を再現する3D構造を形成することができます。さらに、in vivoマウス異種移植モデルを使用して、非乳がん幹細胞またはバルク細胞集団と比較した乳がん幹細胞の成長、自己複製、分化、および/または腫瘍開始能力の違いを理解することができます。この手順の後、単離された乳がん幹細胞は、トランスクリプトーム、キノミクス、およびメタボローム研究に使用できます。この方法は、研究者に、腫瘍の開始、転移、再発、および治療抵抗性における乳がん幹細胞の役割を調査する機会を提供します。

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Research

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Cancer Research

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がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

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婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

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マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるApi5誘導幹性を明らかに

学ぶ乳がん幹細胞の単離と機能評価法。細胞・組織サンプルから高純度・高生存率でBCSCを分離し、in vitroおよびin vivoアッセイで腫瘍形成能と転移制御メカニズムを解明する手法です。

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

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