Name: 大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶCaco2細胞由来の3次元スフェロイド培養法で大腸がん幹細胞の生物学と化学療法応答を研究する手法です。均一サイズのスフェロイドを大量に生成し、がん幹細胞動態の理解と新薬スクリーニングに応用できます。

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我々は、イメージングおよびアニパス・レケルシュ・ヒスオロジー・プラットフォーム(CRCL、CLB)を認める。私たちは、FOLFOXとFOLFIRIの種類の贈り物のためにセンターレオンベラード(CLB)病院の薬局にお世話になっています。また、ブリジット・マンシップが原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作業は、FRM(Equipes FRM 2018、DEQ20181039598)とインカ(PLBIO19-289)によってサポートされました。MVGとLCは、FRMとCFから支援を受け、ARC財団とセンター・レオン・ベラードから支援を受けました。

注: すべての試薬と材料の詳細は、 材料表に記載されています。
1. スフェロイド形成
<ol><li>スフェロイド培養培地<ol>
<li>4 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)からなる基底培地を調製する。</li>
		<li>ステップ1.1.1から基礎培地に10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を含むDMEM完全培地を調製する。</li>
		<li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li> </li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li><li><li></li><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li> </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61783/61783eq1.jpg"> </li></ol><ol><li><ol><li> </li><li>&amp;E</li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li><li> </li><li> </li></ol>

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<li>Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+gastrointestinal+models+and+organoids+to+study+metabolism+in+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).</li>
<li>Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity%2C+villin+expression%2C+and+enterocytic+differentiation+of+cultured+human+colon+carcinoma+cells%3A+A+survey+of+twenty+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines.</a> Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).</li>
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<li>Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOLFOX%2FFOLFIRI+pharmacogenetics%3A+the+call+for+a+personalized+approach+in+colorectal+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).</li>
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著者は開示するものは何もない

in vitro 3Dモデルは、2Dがん細胞培養の主な実験的欠点を克服し、微小環境や細胞の不均一性を含む典型的な腫瘍特徴をより再現する際に信頼性が高いように見えます。一般的に使用されるスフェロイドの3Dモデルは、足場を含まない(低い付着条件で培養)または足場ベース(培養細胞に生体材料を使用する)です。これらの方法は、使用される足場の性質に依存したり、構造やサイズが可変のスフェロイドを生じさせるため、異なる欠点を提示します。
本プロトコルは、結腸腺癌細胞株Caco2から、足場を含まない方法を用いて均質なスフェロイドを産生するための最適化条件を報告する。スフェロイドは、容易に収穫され、以前に報告された研究41に反して、彼らは正常に成長し、培養中のそれらの成長特性も分析することができる。さらに、この新しい方法により、スフェロイド(a)は活発に増殖し、(b)細胞死の非常に低い速度を提示し、(c)球内に内腔を形成するように編成し、そして(d)成分細胞の分化能力を示す。新しいアプローチの最終目的はCSC生物学の研究に用いられたことを考えると、CS...

大腸癌(CRC)は、世界における癌関連死の第2位の原因である。CRCの開発は、遺伝子変異および/またはエピジェネティックな変化の進行的な獲得および蓄積の結果である2、3、腫瘍抑制遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子3の不活性化を含む。さらに、非遺伝的要因(例えば、微小環境)は、発癌性転換に寄与し、そして促進し、したがってCRCs5の進化に関与することができる。重要なことに、CRCは、未分化CSCおよびバルク腫瘍細胞を含む異なる細胞集団で構成され、いくつかの分化形質を示し、これは正常な結腸暗号6,7における上皮の組織を連想させる階層構造を構成する。
CSCは腫瘍の外観8、その維持と成長、転移能力、および従来の治療法6、7に対する耐性を担うと考えられている。腫瘍内では、CSCを含む癌細胞は、その明確な突然変異およびエピジェネティックなプロファイル、形態学的および表現性の違い、遺伝子発現、代謝、増殖率、および転移電位の点で高レベルの不均一性および複雑さを示す9。したがって、がん生物学、腫瘍進行、および治療に対する耐性の獲得および有効な治療への翻訳をよりよく理解するために、この癌の異質性および階層を捉えるヒト前臨床モデルは重要である10,11である。
In vitro 2Dがん細胞株は、長い間使用されており、腫瘍の発達と治療分子の有効性の基礎となるメカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。しかし、元の腫瘍に見られる形質および遺伝的不均一性の欠如に関するそれらの限界は現在広く認識されている12。また、栄養素、酸素、pH勾配、及び腫瘍微小環境は再生されず、CSCs11,12を含む異なる細胞タイプの維持のために特に重要な微小環境である。これらの主な欠点を克服するために、いくつかの3Dモデルが実験的に対処し、癌の複雑さと不均一性を再現するために開発されました。事実上、これらのモデルは、腫瘍細胞異質性、細胞細胞相互作用、および空間的アーキテクチャを再現し、生体内12、13、14で観察されたものと同様である。新鮮な腫瘍から樹立された原発性腫瘍オルガノイドは、細胞系由来のスフェロイドと同様に、主に15,16個を採用している。
スフェロイドは、細胞を強制的に形成し、細胞凝集体で増殖させるために、足場を含まないまたは足場ベースの方法で培養することができる。足場を含まない方法は、非接着条件下での細胞の培養(例えば、吊り下げ法または超低添付プレート)に基づくが、足場ベースのモデルは、培養細胞12、13、14に天然、合成、またはハイブリッドバイオマテリアルに依存する。スキャフォールドベースのスフェロイドは、最終的なスフェロイド形成が使用される(バイオ)材料の性質および組成に依存するので、異なる欠点を提示する。これまで入手可能な足場を含まないスフェロイド法は基板の性質に依存しないが、それらは構造およびサイズ17、18で変化するスフェロイドを生成する。
この研究は、CSC生物学を研究するためにCaco2結腸腺癌細胞で構成される、サイズが均質であるスフェロイドの堅牢で再現可能な3D培養システムを設計することを目的としていた。Caco2細胞は、時間19,20の経過とともに分化する能力のために特に関心があり、ステムのような可能性を強く示唆している。従って、スフェロイドの長期培養は、化学療法に対する異なる応答を有する異なるCSC集団の存在を明らかにした。

<table><tbody><tr><td>37 & マイクロ;m リバーシブルストレーナー、ラージ&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27250</td><td>50 mL コニカルチューブ</td></tr><tr><td>5-フルオロウラシル</td><td>Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)</td><td></td><td>-ストック溶液、5 mg/100 mL; 最終濃度、50 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 24-well plates</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34411</td><td>1,200 microwells per well for spheroid formation and growth</td></tr><tr><td>Anti Caspase3 - Rabbit</td><td>Cell Signaling</td><td>9661</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td><td>eBioscience/Thermo Fisher</td><td>14-9896-82</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133 (13A4) - ラット</td><td>Invitrogen</td><td>14-133-82</td><td>希釈 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD44 -Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab157107</td><td>希釈 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-PCNA - Mouse</td><td>Dako</td><td>M0879</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-catenin - Mouse</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7963</td><td>希釈 1:50</td></tr><tr><td>黒マルチウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar装置&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Dako ペン</td><td></td><td></td><td>液体のバリアを作成するためのスライド上の円をマークするマーカーペン</td></tr><tr><td>Donkey 抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10037</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td>希釈<td>1:1000</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td>希釈<td>1:1000</td></tr><tr><td>ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)グルタマックス(L-アラニル-L-グルタミンジペプチド)</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogel Mounting Medium with DAPI</td><td>Interchim</td><td>FP-DT094B</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11077</td><td>dilution 1:1000</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>Spheroid image analysis</td></tr><tr><td>Irinotecan&nbsp;</td><td>Gift from Pharmacy CLB</td><td>ストック</td><td>溶液、20 mg/mL、最終濃度、100 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>iScript 逆転写酵素&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Leucovorin</td><td>Gift from Pharmacy CLB</td> <td>ストック</td><td>溶液、50 mg/mL、最終濃度、25 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>ヌクレオスピン RNA XS キット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740902 .250</td><td></td></tr><tr><td>オキサリプラチン</td><td>Gift from Pharmacy CLB</td><td>ストック</td><td>溶液、100 mg/20 mL;最終濃度、10 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX- Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>nucleic acid stain; dilution 1:5000</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05&nbsp;%)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>25300062</tr><tr><td>Zeiss-Axiovert顕微鏡</td><td></td><td></td><td>スフェロイドの画像を取得するための倒立顕微鏡</td></tr></tbody></table>

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

大腸癌は、異質性および腫瘍の発達、維持、および薬剤に対する耐性を担う癌幹細胞(CSC)の集団からなる階層的組織によって特徴付けられる。したがって、特定の標的化に対するCSC特性のより良い理解は、効果的な治療のための前提条件である。しかし、詳細な調査には適切な前臨床モデルの貧弱さがあります。in vitro 2次元(2D)癌細胞株は腫瘍生物学に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは表現型および遺伝的腫瘍不均一性を複製しない。対照的に、3次元(3D)モデルは、ほぼ生理学的癌の複雑さと細胞の不均一性に対処し、再生する。この研究の目的は、CSC生物学を研究するための堅牢で再現性の高い3D培養システムを設計することであった。本手法は、Caco2結腸腺癌細胞から、サイズが均質な3Dスフェロイドを生成する条件の開発と最適化を説明する、長期培養に使用できるモデルである。重要なことに、スフェロイド内では、内腔様構造の周りに組織された細胞は、細胞増殖パターンの差動と、マーカーのパネルを発現するCSCの存在によって特徴づけられた。これらの結果は、化学療法に対する応答を含む細胞の異質性およびCSC生物学を研究するためのこの3Dアプローチの妥当性に関する最初の概念実証を提供する。

スフェロイドの大きさの均質性の欠如は、現在利用可能な3Dスフェロイド培養システム13の主な欠点の1つであるため、この研究の目的は、均質なスフェロイドを得るための信頼性と再現性の高いプロトコルを設定することであった。まず、理想的な作業条件を確立するために、Caco2細胞の異なる数を、専用プレートを用いてマイクロウェル/スフェロイド当たり50〜2,000細胞の範囲で試験した(表1)。事実上、これらのプレート内の各ウェルには1,200個のマイクロウェルが含まれ、ウェル当たり同数のスフェロイドの形成が可能であり、さらに重要なことに、マイクロウェル21当たり1個のスフェロイドの形成が可能となる。培養2日後、1回転楕円体当たり2,000個の細胞を含むウェルは単層として成長し、1回転楕円体当たり50個の細胞が小さく、非均質な回転楕円体を生み出した(図1A)。したがって、これら2つの条件は、さらなる分...

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

この新しいスフェロイド培養法は、がん幹細胞の異なる集団の存在を分析するために腫瘍原性を研究するために使用することができ、また、新薬の高いプットスクリーンを通じてうまく適用することができます。これは、多数の均質なサイズのスフェロイドを生成するための堅牢で反復的な培養システムです。また、これらのスフェロイドは、癌性幹細胞を研究するために使用することができる。この方法は、慢性癌生物学を研究するために設定されていますが、3D培養条件を変更することによって他の癌を研究するために簡単に設定することができます。スフェロイドの形成中にプレートをあまり動かさないように、ストレーナーにスフェロイドを収穫する際には注意してください。井戸ごとに500マイクロリットルの抗付着リンス溶液で24ウェルプレートのウェルを事前に処理することで始めます。数秒後、スイングバケットローターでプレートを遠心し、2ミリリットルの温かい基底培地で各ウェルスリンスします。マイクロウェルから泡が完全に取り除かれていることを確認するために顕微鏡の下でプレートを観察します。気泡が見られない場合は、各ウェルに暖かいDMEM基膜マトリックス培地の1ミリリットルを追加する前に、再びウェルをすすいします。スフェロイド形成を誘導するには、10%FBSおよび1%抗生物質を補ったDMEMの10センチメートル皿の2Dモノ層におけるCaco-2細胞の所望の濃度を参照してください。加湿雰囲気の中で摂氏37度と5%の二酸化炭素の培養のため。80%の合流度に達したら、37°Cと5%の二酸化炭素で2ミリリットルのトリプシン-EDTAで培養を処理する前に、PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。細胞が切り離されたとき完全なDMEMの4ミリリットルでトリプシンを中和する。カウント後、遠心分離によって細胞を収集し、DMEM基膜マトリックス媒体の適切な体積でパレットを再中断し、ウェル当たり1ミリリットルの培地で所望の濃度の細胞を達成する。プリペイド24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を加え、続いてDMEM基膜マトリックス培地を各ウェルに1ミリリットル添加する。播種後、すぐにプレートを遠心分離し、軽い顕微鏡を使用して、細胞がマイクロウェル全体に均等に分布していることを確認します。その後、細胞を乱すことなく48時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れます。スフェロイドを収穫するには、インキュベーションの終わりに、血清ピペットと上清の半分を各ウェルに使用して、スフェロイドをマイクロウェルからそっと取り除きます。すべてのスフェロイドが取り外された場合、ピペットを使用して、各ウェルから15ミリリットルの円錐管の上にある37ミクロンのリバーシブルストレーナーに3D培養物を慎重に移します。残りのスフェロイドを収集し、ストレーナーにこれらの追加のスフェロイドを追加するために、洗浄ごとに1ミリリットルのプリウォーム付きBasal培地でそれぞれ3回洗浄します。最後の洗浄後、顕微鏡下でプレートをチェックし、すべてのスフェロイドがマイクロウェルから取り除かれたことを確認します。その後、新しい15ミリリットルのチューブの上にストレーナーを反転し、チューブにスフェロイドを収集するために新鮮なDMEM基底膜マトリックス媒体でストレーナーの底部を洗浄します。500細胞から上昇するスフェロイドは、時間の経過とともに最も均質なサイズの増加を示しています。スフェロイド当たり500個と600個の細胞で、良好な増殖と低ばらつきを達成できる最適な細胞数であると判断します。基質膜マトリックスの添加は、スフェロイドの成長と均一性を高めます。長期培養では、細胞は3日目に密な多層として現れます。平坦化された細胞はモノ層に配置され、10日目にははっきりと見える。興味深いことに、5日目以降、回転楕円体の中にルーメンが現れます。また、核抗原陽性細胞の増殖の明らかな増加は、10日目までに減少する5日目と7日目に観察される。驚くべきことに、活性化されたCaspace 3は、3日目と5日目のみにおいて非常に少数の細胞において観察される。β-カテニン発現の高レベルは、各時点で観察されている間.アンテロサイトに分化するスフェロイドの可能性は、アルカリホスファターゼおよび溶質キャリアファミリー2A5 mRNA発現によって証明される。さらに、このスフェロイドは、典型的な癌幹細胞マーカーを発現し、大腸癌患者に日常的に投与される併用化学療法治療に応答する。したがって、スフェロイドは異なる細胞集団で構成されています。その後、屈折剤などの刺激に対する細胞特異的応答を分析し、最終的には薬物反応に対してうまく使用することができます。

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