Name: 組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: 学ぶ組織サンプルのショットガンプロテオミクスワークフロー。ラベルベースとラベルフリーの定量法を組み合わせ、Orbitrap Fusion質量分析計を用いてタンパク質動態を解析し、バイオマーカー発見に貢献します。

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我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。

この研究は、インド工科大学ボンベイ校(IITB-IEC/2016/026)の機関審査委員会と倫理委員会によって審査され、承認されました。患者/参加者は、この研究に参加するために書面による同意を提供しました。
1. 組織のライセートの準備
注:氷の上で以下の手順をすべて実行して、プロテアーゼを非アクティブに保ちます。メスと使用されるチューブが無菌であることを確認して、クロスコンタミネーションを避けてください。
<ol><li>ビーズの鼓動チューブに~30mgの組織を取り、200μLの1xリン酸緩衝液生理塩分(PBS)と渦を加えます。 注:この研究では、新鮮な凍結したヒト脳腫瘍組織を、ライセート調製のために採取した。プロトコルは、組織の種類(軟部または硬い組織)および組織の細胞の複雑さに応じていくつかの変化を伴う任意の新鮮な凍結組織に使用することができる。</li>
	<li>その後、チューブを回転して組織を沈め、ピペットを使用してPBSを慎重に除去します。組織に残っている血液の痕跡がまだある場合は、別のPBS洗浄を行います.</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って、300 μLの尿素分解バッファー(8 M尿素、50 mM Tris pH 8.0、75 mM NaCl、1 mM MgCl2)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)を加えます。 注:リシスバッファーの体積は、超音波処理プロセス中に組織を粉砕し、抽出されたものを中断するのに十分でなければなりません。あまりにも少ないリシスバッファーは非効率的な組織のリシスを生じ得、あまりにも多くのリシスバッファーは、タンパク質のリゼートを希釈します。</li>
	<li>チューブを氷の上に置き、5 sのパルスサイクル(それぞれON/OFF)で2.5分間40%の振幅で組織を超音波処理します。</li>
	<li>チューブにジルコニウムビーズを加え、氷の上に5分間インキュベーションして90 sのビーズビーターを使用して組織を均質化します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>組織が適切に均質化されたら、チューブを氷の上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、サンプルを4°Cで15分間6,018 x g で遠心分離し、上清から細胞デブリを分離します。</li>
	<li>新鮮なラベル付きチューブに上清を収集し、さらに使用するまでアリコートとして-80°Cで保存します。</li>
</ol>2. タンパク質定量と組織ライセートの品質チェック
<ol><li>補足ファイル1に記載されているようにブラッドフォードの試薬を使用して、組織ライセート中のタンパク質濃度を定量化する。</li>
	<li>タンパク質定量に続いて、12%SDS-PAGEゲルで10μgの組織ライセートを実行し、ライセートの品質を確認します。 注: さらに下流処理は、ライセートが品質チェックをクリアする場合にのみ実行する必要があります。</li>
</ol>3. タンパク質の酵素消化
注: 酵素消化の手順を 図 1aに示します。
<ol><li>消化のために、50 μgのタンパク質を取り、ddH2Oを加え、容積を20 μLにします。</li>
	<li>次に、ストックから20 mM Tris(2-carboxyethyl)ホスフィン(TCEP)を調製し、ストックから0.8μLをタンパク質のリセートに加えてタンパク質中のジスルフィド結合を減少させ、サンプルを37°Cで60分間インキュベートします。</li>
	<li>40 mM のヨウドアセトアミド (IAA) を ddH2O で調製し、1.6 μL を加えて、減少したシステイン残基をアルキル化します。暗闇の中で室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>25 mM Tris pH 8.0 および 1 mM CaCl2 を含む希釈バッファーを 1:8 の比率で加え、尿素濃度をサンプル中の 1 M 未満に希釈します。この時点で、pH を確認します。 注:消化酵素としてトリプシンを使用する場合は、尿素の濃度が1M未満であることを確認してください。</li>
	<li>消化を行うために、1:50の酵素/基質比でトリプシンを加えます。一晩消化のために16時間揺れるドライバスで37°Cでチューブをインキュベートします。 注意:トリプシン酵素は自己消化しやすい反応性の高いプロテアーゼです。余分な注意を払い、氷の上にトリプシンの追加を迅速に実行します。</li>
	<li>16時間のインキュベーションの後、消化されたペプチドを真空濃縮器で乾燥させます。</li>
</ol>4. 消化ペプチドの脱塩
注:ペプチドの脱塩を実行するには、C18ステージのヒントを使用してください。
<ol><li>50 μLのメタノールを加えて、C18ステージ先端をアクティブにします。先端を1,000 x g で2分間RTで遠心する。2 回繰り返します。</li>
	<li>50 μLのアセトニトリルを0.1%のギ酸に加えて、ステージ先端を洗浄します。チューブを1,000 x g で2分間RTで遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>50 μL の 0.1% (v/v) FA を追加して、カラムを平衡化します。再度、RTで2分間1,000 x g で遠心を行い、濾液を捨てます。</li>
	<li>乾燥した消化したペプチドを0.1%のギ酸の50 μLで再構成する。 注:サンプルを渡している間、ステージの先端の内部に気泡の形成を避けてください。段階の先端は、乾燥がペプチドの損失につながる可能性がありますので、遠心段階の間に完全に乾燥させるべきではありません。</li>
	<li>活性化ステージ先端に再構成されたペプチドを加え、2分間1,000 x g で遠心分離してサンプルをステージ先端に通します。この手順を少なくとも 4 回繰り返します。フロースルーは4°Cで保存してください。</li>
	<li>サンプルを洗浄するには、50 μLの 0.1%(v/v)のギ酸を加えます。遠心分離のステップを繰り返し、濾液を捨てます。</li>
	<li>ペプチドの溶出のために、0.1%のギ酸(v/v)の40%(v/v)ACNの50 μLを加え、遠心分離によって段階の先端を通過する。新鮮なチューブに濾液を収集します。50%および60%のACNを0.1%のギク酸で繰り返し、同じ新鮮なチューブに濾液を集める。</li>
	<li>真空濃縮器を使用して、新鮮なチューブに集めた脱塩ペプチドを乾燥させます。 注:乾燥した脱塩ペプチドを注入する準備ができているか、6ヶ月間-20°Cで保存することができます。長期保存(>6ヶ月)の場合は、-80°Cで保存してください。</li>
</ol>5. 脱塩ペプチドの定量化
<ol><li>乾燥した脱塩ペプチドを0.1%FAに再構成する。</li>
	<li>70%エタノールを使用して、リントフリー組織でフォトメトリック測定プレートを拭きます。</li>
	<li>0.1%FAの2 μLを使用してブランクを設定します。</li>
	<li>2 μLの再構成サンプルを複製でプレートに追加します。</li>
	<li>分光光度計にプレートを置き、205 nmおよび280 nmで吸光度を測定します。</li>
	<li>次の式を使用して、モルの吸収率 (ε) を計算します。 ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205] 注:モル吸着率(ε)は、電子転移の確率、または種が入射している特定の波長の放射線をどれだけ吸収するかを測定するものです。εの値は、31 mL mg-1cm-1 ~ 33 mL mg-1cm-1の範囲内にする必要があります。値が範囲内に収まらない場合は、サンプルが適切に消化されないことを示します。</li>
	<li>次の式を使用して、μg/μLでペプチド濃度を計算します。 ペプチドの濃度 = 純OD (205) / 0.051 * ε</li>
</ol>6. 消化ペプチドの無ラベル定量(LFQ)
注: ラベルなしの数量には、 補足ファイル 2に記載されている LC パラメータと MS パラメータを使用します。質量分析計で同じタイプのサンプルの3つの生物学的複製を実行したときに、高いカバレッジデータが得られました。
<ol><li>液体クロマトグラフィーのセットアップ<ol>
<li>脱塩ペプチドを定量した後、バイアル内の2μgのペプチドを取り、0.1%FAを使用して体積を10 μLにします。脱塩ペプチドの濃度は200 ng/μLになります。</li>
		<li>液体クロマトグラフィーシステムのオートサンプラーを開き( 材料表を参照)、バイアルをオートサンプラーの内部に置きます。</li>
		<li>0.1%(v/v)FAを使用して、事前列と分析列を平衡化します。</li>
		<li>バイアルから脱塩した消化ペプチドを1μg取り出し、カラムにロードします。</li>
		<li>サンプルの複雑さに応じて、LC の勾配を設定します。本実験では、LC勾配を組織試料のラベルフリー定量に120分間使用した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>MSセットアップ:プロテオミクスアッセイを最適化する前に、システム適合性のためのソフトウェアを使用してウシ血清アルブミン(BSA)のいくつかのペプチドを監視し、BSAのカバレッジを分析することによって、機器の品質管理チェックを行います(図2A、B)。取得パラメータは MS データ取得ソフトウェアを使用して計測器に設定されました (資料一覧を参照)。<ol>
<li>ソフトウェアを開き、 インスツルメントを ダブルクリックし、デフォルトパラメータを持つペプチドIDからテンプレートを選択します。</li>
		<li>補足ファイル 2を使用して MS パラメータを設定し、新しい方法として保存します。</li>
		<li>次に、サンプルの詳細を記入するソフトウェアを開きます。 [シーケンスセットアップ] をダブルクリックし、サンプルタイプ、サンプル名、ファイル保存場所、計測器方法ファイル、注入量、サンプル位置などの詳細を入力します。</li>
		<li>すべての情報が入力されたら、行を選択して 、実行を開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 消化ペプチドの標識ベース定量(iTRAQ)
メモ:ラベルベースの定量は、iTRAQやTMT試薬などの異なるアイソバリックラベルを使用して行うことができます。ここで、iTRAQ 4-plexは、3つの組織サンプルからの消化されたペプチドの標識化に使用した。iTRAQ 4-plex ラベル付けの手順は、以下に挙げます。
<ol><li>iTRAQ試薬を用いた消化ペプチドの標識化 注:この実験では、3つの組織サンプルからのペプチドが使用されています。各組織サンプルから、80 μgの消化ペプチドを4つのチューブに取り込み、iTRAQ試薬(114、115、116、および117)で標識します(詳細な実験パラメータについては 補足ファイル3 を参照)。<ol>
<li>iTRAQ試薬を使用する前に、試薬の各バイアルを室温(約5分)にしてください。各バイアルの底部に溶液を持って来るために約30 sの短いスピンを与えます。 注:各バイアルに10~15μLの溶液が存在することを確認してください。</li>
		<li>iTRAQ標識の場合、iTRAQ標識キットに用意されている溶解バッファーの20 μLで乾燥したペプチドを再構成します。</li>
		<li>キットに付属のバイアルから70μLのエタノールを加えてラベルを再構成し、30 sの溶液を混合し、10秒回転させます。 注:すべての手順は、製造元の指示に従って実行することをお勧めします。</li>
		<li>均質に混合されたiTRAQラベル(114、115、116、および117)をペプチドサンプルを含むそれぞれのチューブに加え、標識反応を起こさせます。</li>
		<li>30 sのチューブをボルテックスして各チューブの成分を混合し、チューブを10 s回転してチューブの底に戻します。 注:pHペーパーを使用して溶液のpHを確認してください。pH は 8 より大きくする必要があります。ない場合は、pHを調整するために溶解バッファーの10 μLまで追加します。</li>
		<li>各チューブを室温で90分間インキュベートします。反応の最後に、MSグレードの水を加えることによってチューブ内の余分な非結合標識をクエンチする。</li>
		<li>室温で30分から1時間インキュベートします。</li>
		<li>インキュベーションが終わったら、標識された内容物をすべて1本のチューブに移し、真空濃縮器で標識ペプチドを乾燥させます。 メモ:同様のラベル付け手順に従って、TMTラベル付けすることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体クロマトグラフィーのセットアップ<ol>
<li>サンプルを0.1%のギ酸で再構成し、ナノLCのオートサンプラーを開き、オートサンプラーの内部に置きます。LC セットアップの 補足ファイル 2 に記載されているパラメータを使用します。</li>
		<li>サンプルの複雑さに応じて、LC の勾配を設定します。この実験では、180 minのLC勾配を組織試料のラベルベース定量(iTRAQ)に使用した。 注: 複雑性の低いサンプルでは、短い勾配でほとんどのペプチドを効率的に分離できます。しかし、サンプルが非常に複雑な場合は、ペプチドのより良い分離のために長い勾配を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ITRAQ テクニックの MS セットアップ<ol>
<li>ラベルベースの定量で MS/MS フラグメンテーションの 35% に設定された衝突エネルギーを除き、ラベルなしの定量に使用されるのと同じ方法でラベルベースの定量のすべての MS パラメータを設定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. データ分析
<ol><li>LC質量分析装置から得られた生の(MS/MSスペクトル)ファイルを、市販の解析ソフトウェアを使用して解析します( 材料表を参照)。 注:71,785個のタンパク質配列を含むユニプロト(UP000005640)のヒト参照プロテオームデータベースを使用して、セクエストHTとマスコット(v2.6.0)検索エンジンを使用してタンパク質同一性を取得しました。ラベルなしの数量とラベルベースの定量のパラメータについては、 補足ファイル 4を参照してください。</li>
</ol>

<ol><li>Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+revolutionizing+disease+detection+and+patient+tailoring+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy.</a> Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).</li>
<li>Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blasting+into+the+microworld+of+tissue+proteomics%3A+a+new+window+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mass+spectrometry-based+proteomics+to+discoveries+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).</li>
<li>Faria, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+timely+shift+from+shotgun+to+targeted+proteomics+and+how+it+can+be+groundbreaking+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research.</a> Frontiers in Oncology. 7, 13(2017).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+technologies+for+the+identification+of+disease+biomarkers+in+serum%3A+advances+and+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead.</a> Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).</li>
<li>Chen, E. I., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+proteomics+by+quantitative+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics.</a> Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).</li>
<li>Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+Plasmodium+falciparum+induced+alterations+in+humans+from+different+endemic+regions+of+India+to+decipher+malaria+pathogenesis+and+identify+surrogate+markers+of+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity.</a> Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).</li>
<li>Ray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+analysis+and+multipronged+quantitative+proteomics+reveal+oxidative+stress+and+cytoskeletal+proteins+as+possible+markers+for+severe+vivax+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria.</a> Scientific Reports. 6, 24557(2016).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+quantitative+proteomic+analyses+indicate+modulation+of+various+signal+transduction+pathways+in+human+meningiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas.</a> Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).</li>
<li>Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+meningiomas+for+the+identification+of+surrogate+protein+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers.</a> Scientific Reports. 4, 7140(2014).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+Technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: Technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
<li>Rudnick, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+Clinical+Proteomic+Tumor+Analysis+Consortium+%28CPTAC%29+common+data+analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline.</a> Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。また、疾患の進行に関連するシグナル伝達および経路のメカニズムについても説明する。組織定量プロテオミクス分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。ほとんどの手順は、製造元の指示に従って調整されています。高品質のデータを取得するには、次の手順が最も重要です。したがって、これらの手順を実行する間は、特別な注意が必要です。
タンパク質の不完全な消化およびケラチンの汚染は、タンパク質の被覆率(n<1000)を少なくし、それによって実験全体に影響を与える可能性があります。サンプルのpH(pH8)およびサンプル中の尿素の濃度(1M未満)は、タンパク質の効率的な消化を保証します。新鮮なバッファーの使用と注意してサンプルの取り扱いはケラチン汚染の可能性を減らします。iTRAQ試薬は非常にコストがかかり、MS/MSおよびソフトウェアを実行してデータを分析するには、高度なMSプラットフォームが必要です。プロテオミクス実験は、iTRAQ/TMT試薬...

プロテオミクス技術は、疾患1の検出および予後に役立つ候補マーカーの同定と定量を可能にする可能性を有する。質量分析の分野における最近の進歩は、タンパク質レベルでの臨床研究を加速しています。研究者たちは、質量分析法ベースのプロテオミクスを用いて、いくつかの疾患の複雑な病態生物学の課題に取り組もうとしており、現在はタンパク質同定と定量化に対する感度の向上を提供している。タンパク質の正確な定量的測定は、健康な個人と病気の個人のタンパク質間の動的および空間的な協調を理解するために重要である3;しかし、このようなプロテオーム規模の分析は容易ではありません。
臨床検体のプロテオミクスプロファイリングの大きな制限の1つは、生物学的サンプルの複雑さである。多くの異なる種類のサンプルが、細胞株、血漿、および組織4、5などのプロテオームの疾患を研究するために調査されてきた。細胞株は、疾患進行の異なる段階を模倣するインビトロ実験のモデルとして広く使用されています。しかしながら、細胞株の1つの大きな制限は、細胞培養6の過程で遺伝子と平解な変化を容易に獲得する点である。プラズマなどの体液は、バイオマーカー発見の魅力的な源となる可能性があります。しかし、タンパク質の豊富さとダイナミックレンジのタンパク質濃度により、血漿プロテオミクスは少し難しい7.ここで、最も豊富なタンパク質から生まれたペプチドは、質量/電荷比が同じ6であっても、低い豊富なタンパク質由来のものを抑制することができる。ここ数年で枯渇と分画技術の進歩がありましたが、良好なカバレッジを得ることは、依然としてプラズマプロテオミクス8、9の大きな限界です。疾患生物学のプロテオーム学的調査のための組織の使用は、組織サンプルが疾患部位に最も近く、疾患生物学10,11に対するより良い洞察を提供するために高い生理学的および病理学的情報を提供するので好ましい。
本稿では、組織試料の定量的プロテオミクスの簡易プロトコルを提供しました。このバッファーは質量分析法に基づく調査と互換性があるため、8 M 尿素を含むバッファーを組織のライセート調製に使用しました。しかし、質量分析計に注入する前に、塩を除去するためにペプチドをきれいにすることが必須です。覚えておかねない重要なポイントの1つは、トリプシンが8M尿素濃度で低い活性を示すため、タンパク質消化のためのトリプシンを添加する前に尿素濃度を1M未満に減らすことです。定量的なグローバルプロテオミクスの2つのアプローチ:iTRAQ(相対および絶対定量のためのアイソバリックタグ)とラベルフリー定量(LFQ)を用いたラベルベースの定量法について説明しました。iTRAQベースの定量プロテオミクスは、主に生物学的状態(例えば、正常と疾患または治療されたサンプル)で変化する複数のサンプルを比較するために使用されます。このアプローチは、ペプチド12のN末端一次アミンを標識する等圧試薬を利用する。iTRAQ試薬は、1つのN-メチルピペラジンレポーターグループ、バランサ基、およびペプチド13のN末端一次アミンと反応する1つのN-ヒドロキシスクッチイミドエステル基を含む。各条件から消化されたペプチドは、特定のiTRAQ試薬で標識される。標識に続いて、反応を停止し、異なる条件からの標識ペプチドを単一のチューブにプールする。この組み合わせサンプル混合物は、同定と定量のために質量分析計によって分析される。MS/MS分析後、低分子質量のレポーターイオン断片が生成され、これらのレポーターイオンのイオン強度がタンパク質の定量化に使用されます。
別のアプローチとして、標識フリー定量法を用いて、安定同位体を有するペプチドを標識することなく、複合体サンプル中のタンパク質の相対数を決定する。

<table><tbody><tr><td><強>試薬</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル(MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンフィック</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸(MSグレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール (MS グレード)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>メタノール (MS グレード)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>MS グレード水</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス <td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>シグマ</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>メルク</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (MS グレード)</td><td>ピアス</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td>5000205</tr><tr><td>尿素</td><td>メルク</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 カラム</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>ステージチップ</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ</td><td>BioSpec製品</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーズビーター(ホモジナイザー)</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー(分光光度計)</td><td>Thermo</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>プローブ Sonicator</td><td>Sonics Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Drybath</td><td>Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion 質量分析計</td><td></td><td>Thermo FSN 10452</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC</td><td></td><td>Thermo EASY-nLC1200</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer</td><td>Thrermo</td><td>プロテオーム ディスカバラー 2.2.0.388</td><td></td></tr></tbody></table>

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

質量分析の最近の進歩は、堅牢で再現可能なデータセットの生成と共に深いプロテオミクス分析をもたらしました。しかし、かなりの技術的進歩にもかかわらず、患者の血液、CSF、および組織などの生体検体からのサンプル調製は依然としてかなりの課題を抱えています。バイオマーカーを同定するために、組織プロテオミクスはしばしば、研究結果をベンチから診療所に翻訳する魅力的なサンプル源を提供する。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病などの癌や神経変性疾患の早期診断のための潜在的な候補バイオマーカーを明らかにすることができます。組織プロテオミクスはまた、タンパク質の豊富に基づいて全身情報の富を生成し、興味深い生物学的な質問に対処するのに役立ちます。
定量的プロテオミクス解析は、ラベルベースとラベルフリーアプローチの2つの大きなカテゴリに分類できます。標識ベースのアプローチでは、タンパク質またはペプチドは、SILAC(細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識)、ICAT(同位体コード化アフィニティータグ)、TMT(タンデム質量タグ)またはiTRAQ(相対および絶対定量のための同位体タグ)などの安定同位体を使用して標識されます。標識ベースのアプローチは、タンパク質をより正確に定量できるという利点を有し、またアイソバリックラベルを用いて、複数のサンプルを1回の実験で分析することができる。ラベルフリーのアプローチは、ラベルベースのアプローチに代わるコスト効率の高い方法です。特定のコホートに属する数百の患者サンプルを分析し、臨床特徴に基づいて他のコホートと比較することができる。ここでは、ライフサイエンス、特にバイオマーカー発見ベースのプロジェクトでの応用に不可欠な、ラベルフリーおよびラベルベースのプロテオームプロファイリング法を用いた組織サンプルの最適化された定量プロテオミクスワークフローについて説明しました。

私たちは、発見プロテオミクスには、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスアプローチの2つの異なるアプローチを使用してきました。SDS-PAGE上の組織サンプルのタンパク質プロファイルは、インタクトなタンパク質を示し、プロテオミクス分析のために考慮することができた(図2A)。装置の品質管理チェックは、システム適合性ソフトウェアを介して監視され、機器性能の日単位の変動を示した(図2B)。BSAサンプルの91%の配列カバレッジをLC勾配の30分で観察した(図2C)。LC勾配は、500ngの市販HeLa細胞消化を用いて最適化され、1時間の勾配で1488タンパク質と比較して2hの勾配で2425タンパク質を観察した(図2D)。プール組織サンプルの3つの技術的複製すべてで平均2428個のタンパク質を同定することができました(図2E)。...

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

タンパク質の正確な定量的測定は、生物学に戻って病気を理解するためにタンパク質間の動的かつ空間的な協力を理解するために重要です。この実験の全体的な目的は、バイオマーカー発見のためのラベルフリーおよびラベルベースのタンパク質プロファイリングを組み合わせた、組織サンプルの統合された定量プロテオミクスワークフローを提供することです。本研究では、標識ベースの標識のないアプローチを用いてタンパク質を定量化するために、オービットラップ・フュージョンという計器を用いた。組織のリシスは、LC-MS-MS実験を成功させる最も重要なステップの1つです。ビーズの鼓動管に30mgの組織を取る。PBSで洗浄した後、8つの大臼歯、トリス、NaClおよびMgCl2を含む尿素溶菌緩衝液の300マイクロリットルを加える。プローブ超音波処理器を使用して、組織の内容物を解凍します。別のサイクルに対してこれを繰り返します。チューブの底に無傷の組織を観察した場合は、チューブにジルコニウムビーズを加え、ビーズビーターを使用して90秒間、氷の上に5分間インキュベーションして組織を均質化します。サンプルを摂氏4度で15分間遠心分離し、上清から細胞の破片を分離します。新鮮なチューブに上清を収集し、均一に溶液を混合します。ブラッドフォード試薬を用いて組織ライセート中のタンパク質濃度を定量化する。この場合、サンプルのODを595ナノメートルで測定し、この画面に示すように標準グラフを使用して推定します。タンパク質定量に続いて、12%SDS-PAGEゲルで10マイクログラムの組織ライセートを実行し、ライセートの品質を確認します。インソリューション消化の最初のステップは、TCEPを使用して、ジスルフィド結合の減少を含みます。TCEPの添加に続いて、37°Cで1時間チューブの内容物をインキュベートします。次のステップは、還元された二硫化結合の再形成を防ぐためにアルキル化を伴う。ヨウドアセトアミドのようなアルキル化剤を添加し、チューブを暗く10分間インキュベートします。インキュベーション後、4~8体積の希釈バッファーで希釈することにより、尿素の最終濃度を1モル未満に下げます。この時点で、pHを確認することをお勧めします。次のステップは、トリプシンをチューブに加え、効率的な消化のためにチューブを一晩インキュベートすることを含む。翌日、消化したペプチドを真空濃縮器で乾燥させ、脱塩工程に進みます。ペプチドの脱塩を行うために、C18段階のヒントを使用してください。50マイクロリットルのメタノールを加えてC18段先端を活性化し、1000Gで先端を2分間遠心分離する。今度は、0.1%のギ酸に50マイクロリットルのアセトニトリルを加えてステージ先端を洗浄し、再び先端を遠心分離する。乾燥した消化されたペプチドを0.1%のギ酸の50マイクロリットルで再構成する。活性化された段階の先端に再構成されたペプチドを加える。この手順を少なくとも 4 回繰り返します。試料を洗浄するには、0.1%のギ酸を50マイクロリットル加え、遠心分離工程を繰り返します。ペプチドの溶出のために、0.1%のギ酸に40%ACNの50マイクロリットルを加え、遠心分離によって段階先端を通過する。0.1%のギ酸で50%と60%ACNでこのステップを繰り返し、新鮮なチューブに濾液を集める。脱塩したペプチドを真空濃縮器で乾燥させます。LC-MS-MSの実行に先立ち、Scopes法を用いてペプチドを定量化してください。このために、再構成したサンプルを2マイクロリットルのマイクロドロッププレートのウェルに積み込み、205ナノメートルと280ナノメートルで吸光度を測定します。このスライドで説明した式から濃度を計算します。脱塩ペプチドは、いったん乾燥すると、ラベルベースの定量化の準備が整います。iTRAQ標識の場合、乾燥したペプチドは、iTRAQ標識キットに用意されている20マイクロリットルの溶解バッファーで再構成されなければならない。キットに付属のバイアルからエタノールを添加してラベルを再構成し、十分に混ぜ合わせます。すべての手順は、製造元の指示に従って実行することをお勧めします。均質に混合されたiTRAQラベルをそれぞれのチューブに加え、標識反応を起こすのを可能にします。反応の最後に、MSグレードの水を加えることによってチューブ内の余分な非結合標識をクエンチし、30分から1時間インキュベートする。次に、標識された内容物をすべて単一のチューブに移し、標識されたペプチドを乾燥させます。サンプルを0.1%のギク酸に再構成した後、NanoLCのオートサンプラーを開き、オートサンプラーの内部にサンプルを置きます。サンプルをオートサンプラーに入れたら、液体クロマトグラフィーと質量分析の適切なパラメータを設定することが重要です。ここでは、LC-MS を使用したラベルなし定量と iTRAQ ベースの定量の両方のパラメータについて説明します。ラベルなしの定量の場合、120分の勾配が単一の未分離れたサンプルとして注入されている。この期間は、サンプルの複雑さに基づいて増減できます。この実験では、溶液Bの流れを1%ギ酸中80%のアセトニトリルである溶液Bに対して、300ナノリットルの流れを設定した。同様に、iTRAQ実験の勾配を設定することができます。サンプルが分画されていないので、90分の勾配が使用されています。ラベルフリー定量と iTRAQ ベースの定量の両方の MS パラメータをここで確認できます。最初の手順では、グローバル パラメータをクリックしてアプリケーション モードを設定します。ペプチドモードを選択し、使用するLC勾配に従って方法の持続時間を設定します。実験のスキャン パラメータを定義します。MS-OT オプションをクリックすると、パラメータが表示されます。使用中の検出器タイプはオービットラップに設定されています。この機器で使用できる他のオプションには、イオントラップが含まれています。解像度は 60,000 に設定されており、実験の必要性と種類に応じて、使用可能なさまざまなオプションを選択できます。質量範囲は正規であり、スキャン範囲は375から1700に設定されます。その他のパラメータは MS アプリケーションのデフォルトです。強度しきい値が設定され、充電状態が 2 ~ 6 の範囲で設定されています。動的除外は 40 秒に設定され、質量許容値は 10 に維持されています。次のパラメータセットには MS-MS パラメータが含まれます。分離モードは四重極で選択されており、分離窓は2に設定され、分離オフセットはオフに設定されており、活性化タイプは通常プロテオミクス実験のHCDです。衝突エネルギーは固定するか、またはアシストすることができます。標識されたサンプルは、より高い衝突エネルギーを必要とするため、iTRAQ実験では衝突エネルギーを35に設定し、LFQ実験では30に設定することが推奨されます。ここで使用される検出器のタイプはオービットラップです。スキャン範囲モードは自動になります。他のパラメータは、iTRAQ実験およびラベルフリー定量実験のデフォルトです。概要をクリックすると、実験に使用されるすべての LC パラメータと MS パラメータの概要が表示されます。あなたは一つ一つのパラメータを見て、校正を行うことができます。それが完了したら、ファイルをクリックしてメソッドファイルとして保存します。保存すると、メソッドを実行すると、生のファイルが取得されます。そして、これらの生のファイルは、プロテオーム発見ソフトウェアを使用して分析することができます。この図は、BSAのシーケンスカバレッジを3つの技術的な反復で示しています。これは、機器の再現性を示しています。さて、この図は、3つの異なる生物学的サンプルで同定されたペプチドスペクトル一致、ペプチド、およびタンパク質の数における均一性を示しており、これは再び、装置の再現性に関するアイデアを与える。ここで、ベン図は、ラベルフリー実験およびラベルベースの実験において、3つの異なるサンプルで同定された一般的なタンパク質および排他的タンパク質を表す。これらの棒グラフは、LFQおよびiTRAQ実験で同定された1%FDR後のペプチドスペクトル一致、ペプチド基、総タンパク質、タンパク質基、およびタンパク質数の数を示す。生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。組織定量プロテオーム分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。技術的な反復の使用はサンプルが異なった時間ポイントで実行される場合でさえ、良い再現性を保障する。ここでは、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスの2つの定量方法を用いて組織サンプルの分析を示しました。定量的プロテオミクス技術の選択は、サンプルの数、MSプラットフォームの利用可能性、および対処されるべき生物学的問題に依存し得る。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。...

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

ここでは、質量分析ベースの定量プロテオミクス解析のための自動化された血漿タンパク質消化法を紹介する。このプロトコルでは、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化反応のための液体の移動およびインキュベーションステップが合理化され、自動化されています。所望の精密の96の井戸版を準備するのにおよそ5時間かかる。...

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。...

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

オープンソースのロボット液体処理システムを操作して、半自動タンパク質サンプル調製を行い、洗剤の除去、タンパク質消化、ペプチド脱塩のステップをカバーするための詳細なプロトコルと3つのPythonスクリプトが提供されています。...

オープンソースのラボロボットによるショットガンプロテオミクスサンプル処理

Shotgun 質量分析ベースのリピドミクスは、さまざまなげっ歯類組織からの 1...

げっ歯類組織のショットガンリピドミクス

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

質量分析ベースのプロテオミクスデータは、オープンデータベースで利用でき、無料のツールを使用してアクセスできます。データベースの検索と説明が複雑であることを考えると、多くの生物学者はこれらのデータセットを利用するための知識を欠いています。ここでは、基本的なプロテオミクスデータ検索に無料のツールを使用するためのガイドを提供します。...

無料の計算ツールを使用した質量分析ベースのプロテオミクスデータのナビゲート

γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

学ぶ組織サンプルのショットガンプロテオミクスワークフロー。ラベルベースとラベルフリーの定量法を組み合わせ、Orbitrap Fusion質量分析計を用いてタンパク質動態を解析し、バイオマーカー発見に貢献します。

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

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