Name: 内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぶ内皮ネットワーク上への3D乳房上皮スフェロイドのバイオプリンティング法。迅速な創薬スクリーニングモデル構築と個別化医療への応用を実現する革新的組織工学技術です。

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この研究は、NIH 1R01HL140239-01によってAMCに資金提供されました。ドレクセル大学の細胞イメージングセンターに感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、3Dアーキテクチャにおいても内皮細胞との共培養のための3Dアーキテクチャにおけるバイオプリントスフェロイドの初のプロトコルです。重要なプロトコルステップには、乳房上皮スフェロイドおよびHUVECネットワークの初期形成が含まれる。乳房上皮スフェロイドはマトリックス溶液から容易に破壊されるため、授乳中には細心の注意が必要です。同様に、乳房上皮スフェロイドは、マトリックス溶液からピレットされ、ネットワークに混合されたときに注意して治療する必要があります。HUVECネットワークは、それぞれ単層または死を形成するため、密度が高すぎる状態でメッキを行ったり、16時間以上放置したりしてはならない。最後に、すべてのバイオプリンティングは、細胞の生存率を最大化するために37°Cの無菌環境で発生する必要があります。
乳房上皮スフェロイドは、アルギン酸およびアルギン酸コラーゲンブレンドを含むマトリゲル以外の様々なバイオインクでバイオプリントすることができる。我々は、スフェロイドが実行可能であり、アルギン酸塩ベースのバイオインク41に印刷さ...

3D in vitro血管化腫瘍モデルは、がんの成長と転移の機械化研究に不可欠なツールです。特に乳癌の場合、マトリゲルで培養された乳房上皮細胞は、生体内乳腺アシヌスアーキテクチャ1、2、3、4、5、6、7、8に似た偏光スフェロイドに整理する。3D乳房上皮細胞培養も細胞機能に影響を与え、表皮成長因子(EGF)受容体変調8、9の違いを示す3D培養で、オンコジーン機能, ErbB210を含む;成長とアポトーシスシグナル11、12;と化学療法抵抗13,14.血管内皮細胞は、従来の2D培養15、16、17、18との3Dと同様に環境刺激に対して異なる反応を示す。しかし、血管内皮および乳房上皮相互作用の理解の多くは、2D培養に条件付き培地またはトランスウェル挿入物を用い、または2つの細胞タイプが物理的に19、20、21、22、23に分離された3Dモデルから来ている。これらの共培養モデルは、3D培養と細胞-細胞接触の両方が血管内皮に重要であるので、限られた生理学的洞察力を提供する – 乳房上皮細胞相互作用24,25,26.
3Dがんモデルは、ヒドロゲル内または設計された足場5、27、28、29の中で、吊り下げスフェロイド形成、バイオプリンティング、磁気アセンブリ、培養を含む様々な技術を用いて製造されている。最近では、3D腫瘍モデルが、それぞれの3D構造に配置された複数の細胞タイプで作成されました。腫瘍オンチッププラットフォームの一例では、癌、内皮細胞、および間質細胞をマトリックスに混合し、次いでポリジメチルシロキサン(PDMS)装置の中の3つの中央組織室に注入した。組織室は、動脈と静脈を表す2つの外側のチャネルで接していた。培養の5〜7日後、内皮細胞は血管系の近くに小さな腫瘍を形成するために増殖した微小血管網と癌細胞を形成した。このプラットフォームは、その後、スクリーニング薬と薬物の組み合わせ30に使用されました。特定の機械的刺激(例えば、肺の機械的緊張)31,32を有する転移および癌タイプを研究するために、追加の腫瘍オンチッププラットフォームが作成された。しかし、これらのプラットフォームは、一般的にそれぞれの3D構造に血管系と癌の両方を含みはありません。
バイオファブリケーションは、細胞の位置を厳密に空間制御できるため、3D in vitro血管化腫瘍モデルを進める上で大きな約束を示しています。過去10年間のバイオプリンティングの成長にもかかわらず、腫瘍33、34に特に焦点を当てた研究はほとんどありません。ある例では、ゼラチン/アルギン酸/フィブリノーゲンヒドロゲル中のHeLa細胞の3Dプリンティングを使用して、インビトロ子宮頸癌モデルを作成した。腫瘍細胞を個々の細胞としてバイオプリントし、次いでスフェロイドを形成させ、これはより高い増殖速度、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の増加、および2D培養35における細胞よりも高い化学抵抗性を示した。これらの研究では、他の多くの36,37と同様に、解ciaciaされた細胞懸濁液をバイオプリントし、次に細胞培養物に必要な機械的および生化学的手掛かりを与えて細胞が3D構造を形成することを可能にした。しかし、細胞自己集合は数日または数週間かかる場合があり、複雑な空間的および時間的環境的手掛かりを必要とすることがあり、または2つの細胞タイプが共同培養される場合には起こらない場合がある。例えば、2D共培養において内皮細胞における細胞死を誘導した乳房上皮細胞、および解約乳房上皮細胞は、アルギン酸/ゼラチンヒドロゲル38にバイオプリントした際に3Dスフェロイドを形成しなかった。解体乳房上皮または癌細胞は、円形PDMS型に包絡された場合にのみ、アルギン酸塩ベースのバイオインクでスフェロイドを形成した。他の場合には、スフェロイドは、超低添付着円状ウェルプレート中に懸濁液滴を使用して形成し、次いでアルギン酸系バイオインク39,40に混合した。
このプロトコルでは、代替3D組織バイオマニュファクチャリング法について説明します。解約細胞を播種してこれらの細胞が3D構造を形成するのを待つのではなく、血管管ネットワーク上に3D腫瘍回転楕円体を作成してバイオプリントし、ほぼ即座に使用できる腫瘍共培養モデルを作成する方法を説明する。腫瘍スフェロイドは、インビトロで成長させるか、またはヒト組織(オルガノイド)に由来する。同様に、血管管は、微小血管断片の脂肪組織に由来することができるか、または成長させることができる。バイオインクは、生物学的に不活性なアルギン酸から、生物学的に活性の高いマトリゲル41まで及ぶ。この3D腫瘍共培養モデルは、様々な細胞構造およびバイオインクを用いて作成することができるので、複数の細胞型、細胞外マトリックス、およびケモカイン勾配15、42を組み込むことができる。現在の製剤では、内皮ネットワークを浸透させることはできませんが、将来の反復は、この方法をマイクロ流体またはオンチップシステムと統合することができます。内皮ネットワーク上のバイオプリンティング3D乳房上皮スフェロイドは、薬物検査および個別の精密医療27のためのヒト乳房モデルの迅速なバイオファブリケーションを可能にする。

<table><tbody><tr><td>37°;Cインキュベーター、5%CO2、湿度95%</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>セルインキュベーション</td></tr><tr><td>3Dバイオプリンター</td><td>カスタムメイド</td><td>なし</td><td>バイオプリンティングに使用</td></tr><tr><td>8ウェルチャンバースライド</td><td>VWR、Radnor、PA</td><td>53106-306</td><td>スフェロイドの播種用</td></tr><tr><td>25ゲージニードル</td><td>シグマ、ミズーリ州セントルイス</td><td>Z192406-100EA</td><td>バイオプリンティング シリンジ針</td></tr><tr><td>無水エタノール (200プルーフ)</td> <td>シグマ、ミズーリ州セントルイス</td><td>E7023-500ML</td><td>メディア成分の再構成</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;)2フラグメントヤギ抗マウスIgG Jackson</td><td>ImmunoResearch、ペンシルバニア州ウェストグローブ</td><td>115006020</td><td>二次ブロック - 免疫蛍光</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>ウシインスリン</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A 培地添加</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>ブロッキング剤 - 免疫蛍光</td></tr><tr><td>ファルコン70 & マイクロ;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>大きなスフェロイドまたはクラスター化されたスフェロイドの除去</td></tr><tr><td>CellTracker&trade;赤 CMTPX染料</td><td>サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>C34552</td><td>HUVECチューブ用プレステイン</td></tr><tr><td>コンパクト遠心分離機</td><td>Hermle-Labnet、エジソン、ニュージャージー州</td><td>Z206A</td><td>細胞遠心分離用</td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A メディア添加剤</td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 mL</td><td>VWR、Radnor、PA</td><td>62406-200</td><td>細胞の収集と再懸濁</td></tr><tr><td>Countess II-FL細胞カウンター</td><td>サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>AMQAF1000</td><td>計数細胞</td></tr><tr><td>ガラスピペット (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>細胞再懸濁</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>11320033</td><td>MCF10A 基礎培地</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 基礎培地</td></tr><tr><td>内皮基礎培地-2 (EBM-2)</td><td>ロンザ、ダーラム、NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVECの基礎培</td></tr>地<tr><td>内皮成長培地-2(EGM-2)</td><td>ロンザ、ダーラム、ノースカロライナ</td>州<td>CC-3162</td><td>Bulletkit(成長因子を含む)</td></tr><tr><td>を伴うAlexa Fluor&trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher、Waltham、MA</td><td></td><td>ラベリング MDA-MB-231 スフェロイド</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Cytiva、ローガン、ユタ州</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 培地添加物</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>免疫蛍光標識成分</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>免疫蛍光緩衝液成分</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>核染色免疫蛍光</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>16050130 MCF10A 培地添加</td>物</tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>シグマ、セントルイス、ミズーリ</td><td>州H0888-5G</td><td>MCF10A 培地添加</td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)</td><td>細胞アプリケーション、サンディエゴ、CA</td><td>200-05f</td><td>内皮細胞株</td></tr><tr><td>インテグリン&アルファ;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>免疫蛍光スフェロイド標識成分</td></tr><tr><td>ライブデッドアッセイ</td><td>サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>L3224</td><td>細胞生存率のための生細胞および死細胞染色アッセイ</td></tr><tr><td>LSM 700 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス、ソーンウッド、ニューヨーク</td><td></td><td>細胞の可視化に使用</td></tr><tr><td>マトリゲル-成長因子減少 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>スフェロイド形成</td></tr><tr><td>MCF10A細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>乳房細胞株</td></tr><tr><td>MDA-MB-231細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>乳房細胞株</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>細胞固定剤</td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー, ウォルサム,</td><td>MA 15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC 培地添加</td></tr><tr><td>物 リン酸緩衝液生理食塩水 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>トリプシン化前の細胞の洗浄バッファー</td></tr><tr><td>リン酸バッファー 生理食塩水 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>免疫蛍光緩衝液成分</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>免疫蛍光封入剤培地</td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子, EGF</td><td>Peprotech, Rockyニュージャージー州ヒル</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ アッセイ培地成分</td></tr><tr><td>アジ化</td>ナトリウム<td>シグマ、ミズーリ州セントルイス</td><td>S2002-25G</td><td>免疫蛍光緩衝液成分</td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (10 mL)</td><td>VWR、Radnor、PA</td><td>75846-757</td><td>バイオプリンティング プロセス</td></tr><tr><td>組織培養皿 (10cm)</td> <td>VWR、Radnor、PA</td><td>25382-166</td><td>単層細胞培養</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma、ミズーリ州セントルイス</td><td>T8787-250ML</td><td>免疫蛍光緩衝液成分</td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.4%</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>細胞カウンター添加剤</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td>細胞<td>剥離</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>免疫蛍光緩衝液成分</td></tr><tr><td>血管内皮増殖因子 (VEGF<sub)>165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

内皮ネットワーク上の3d多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

バイオプリンティングは、生体組織アーキテクチャの重要な特徴をより良く再現する3Dヒトがんモデルを製造するための有望なツールとして浮上しています。現在のレイヤーごとの押出バイオプリンティングでは、個々の細胞が複雑な空間的および一時的な手がかりと共にバイオインクで押し出され、階層組織の自己集合を促進します。しかし、このバイオファブリケーション技術は、細胞間の複雑な相互作用、バイオインク、生化学的および生物物理学的手掛かりに依存しています。したがって、自己組立には数日または数週間かかる場合があり、特定のバイオインキを必要とすることがあり、複数の細胞タイプが関与している場合には必ずしも起こらない場合がある。そこで、様々なバイオインクで形成された3D乳房上皮スフェロイドを直接バイオプリントする技術を開発しました。バイオプリントされたプレフォーム3D乳房上皮スフェロイドは、印刷後の生存率と偏光アーキテクチャを維持した。さらに、3Dスフェロイドを血管内皮細胞ネットワークに印刷し、共培養モデルを作成しました。したがって、新しいバイオプリンティング技術は、従来のバイオプリンティング技術よりも低コストで柔軟性を持って、より生理学的に関連する3Dヒト乳房モデルを迅速に作成します。この多目的なバイオプリンティング技術は、追加のバイオインクで他の組織の3Dモデルを作成するために外挿することができます。

乳房上皮細胞は、マトリックス溶液上および2%マトリックス溶液を有する培養培地で5〜8日後に3Dスフェロイドに自己組織化すべきである。非腫瘍性MCF10A乳房上皮スフェロイドは円形に見え、中空中心を有し、インテグリンα6はスフェロイドの外縁に偏光している(図1、差し込みは中空の中心を示す)。高侵襲性MDA-MB-231乳癌上皮細胞は不規則なスフェロイドを形成する。回転楕円体は直径が100~300μm程度の場合に使用してください。回転楕円体が大きくなりすぎて近くに入ると、スフェロイドが結合してメガスフェロイドを形成します。さらに、MDA-MB-231乳房上皮スフェロイドは、マトリゲル培養で長期間維持された場合、スフェロイドから移行する細胞を示し得る。
HUVECは、6〜8時間のまばらで無血清培養の後、チューブのようなネットワークに自己組織化する必要があります。サンプルは、1〜3細胞のラインを並行して形成する接続を持つ多細胞ノードを有する。HUVEC ネットワークは、位相コントラスト顕微鏡で画像化することも、セルトラッカーと H...

このプロトコルの目的は、多細胞スフェロイドとして乳房上皮細胞を、薬物スクリーニング研究に使用できる3D乳房内皮共培養モデルを迅速に作成するために、多細胞性スフェロイドとして直接バイオプリントすることです。

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

当社のプロトコルは、乳房上皮スフェロイドなどの事前に形成された3D細胞構造の印刷を容易にし、生物学的に関連するモデルやさまざまなバイオインクの迅速な形成を可能にします。この技術の主な利点は、血管ネットワークへの3D腫瘍スフェロイドのバイオプリンティングを容易にし、あらゆる実験的研究にほぼ即座に使用できることです。これらの3Dバイオプリント組織モデルは、個別化精密医療のために拡張できる迅速なin vitroプラットフォームを提供します。この汎用性の高い3Dバイオプリンティング法は、血管系との3D相互作用が重要な他の生理学的システムにも適用できます。乳房上皮スフェロイド形成のためには、まず200マイクロリットルのピペットチップを30分間凍結し、成長因子減少マトリックス溶液を氷上に置く。チップが凍結したら、ウェルごとに1つの新しい氷冷ピペットチップを使用して、8ウェルチャンバースライドの各ウェルの側面と角に沿って30マイクロリットルの氷冷マトリックス溶液を追加し、中央に最後のドロップを追加して均一なコーティングを確保します。すべてのウェルがコーティングされたら、スライドを摂氏37度、二酸化炭素5%で15〜20分間インキュベートします。マトリックスが重合している間に、MCF 10Aアッセイ培地にMCF 10A細胞を10倍で5細胞/mLの濃度で再懸濁します。インキュベーションの終了時に、50マイクロリットルの細胞と450マイクロリットルのMCF 10Aスフェロイド増殖培地を各ウェルに加え、すぐにスライドをインキュベーターに戻します。4日ごとにチャンバースライドを45度の角度に傾けて、ウェルごとに200マイクロリットルの上清を新鮮なスフェロイド成長培地と交換できるようにします。HUVECネットワーク形成のためには、実証されているようにマトリックス溶液でコーティングされた8ウェルチャンバースライドを調製し、10 cmのHUVECの皿を10マイクロリットルの赤血球トラッカーダイで細胞培養インキュベーターで30分間事前に染色します。インキュベーションの終わりに、内皮細胞を10ミリリットルの温かいPBSで洗浄してから、2ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAで処理します。摂氏37度および5%二酸化炭素で5分後、内皮の成長媒体2の5ミリリットルのトリプシンを中和し、遠心分離のための25ミリリットルの円錐管に細胞を移す。ペレットを5ミリリットルの無血清内皮基礎培地に再懸濁し、計数用に2個、細胞を1ミリリットルあたり6個の細胞濃度の10倍に希釈します。次に、5つのHUVECに1回10を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに6時間置きます。培養の5〜8日後、代表的な位相コントラスト顕微鏡画像で各ウェル内のスフェロイドの数を数え、チップの最後の0.5センチメートルを取り外した1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、8ウェルチャンバースライドの各ウェルからすべてのスフェロイドを慎重に収集します50マイクロリットルのチューブに入れます。インク濃度100μLあたり100スフェロイドで適切なバイオインクにスフェロイドを再懸濁し、プールしたスフェロイドを10ミリリットルの滅菌シリンジにロードします。シリンジに25ゲージの滅菌針を装備し、シリンジをバイオデポジションシステムに取り付けます。HUVECネットワークの各ウェルから培地を取り出し、100マイクロリットルの乳房上皮スフェロイドをHUVECネットワークチャンバースライドの6つのウェルのそれぞれに1分間に1ミリリットルのスフェロイドの流量で押し出します。次に、400マイクロリットルのMCF 10Aスフェロイド増殖培地を各ウェルに加え、共培養物を細胞培養インキュベーターに24〜96時間置きます。実証されたように、5〜8日間の培養後、非腫瘍性MCF 10A乳房上皮スフェロイドは、スフェロイドの外縁に分極したインテグリンα-6を持つ中空の中心で丸く現れるはずです。高侵襲性のMDA-MB-231乳がん上皮細胞は不規則なスフェロイドを形成し、マトリゲル培養物に長期間維持されると、スフェロイドから細胞が移動することを示す可能性があります。実証されたように、6〜8時間のスパース無血清培養の後、HUVECネットワークは位相コントラストまたは共焦点顕微鏡でイメージングできます。乳房上皮スフェロイドをHUVECネットワークにバイオプリンティングした後、スフェロイドとネットワークの両方が少なくとも24時間元の形態を維持する必要があります。このプロトコルを試行する際に覚えておくべき主なことは、クラスタリングを避けるために、印刷前にスフェロイドを慎重に取り扱うことです。バイオプリンティングおよび共培養後、腫瘍細胞の生存率、増殖、遊走、および内皮ネットワークとのその他の生化学的相互作用を、薬理学的治療の有無にかかわらず測定できます。私たちは、共培養バイオプリンティングの2時間後から薬物試験を開始できることを実証し、抗がん剤パクリタキセルによる内皮ネットワークへのスフェロイド添加試験を行いました。

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

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