バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

このプロトコールは、さまざまな真菌成長段階での揮発性および不揮発性抗真菌化合物の相対的な有効性を正確に並べて比較する方法を提供します。この方法は、多種多様な分子を含む乾燥または液体の形態で使用される植物由来製品の抗真菌活性を評価するのに適しています。この方法は、植物由来製品の施用方法に関する貴重な情報を提供することができ、特に生物的防除の分野に適しています。

この手順を実演するのは、Sup'Biotech研究所のエンジニアアシスタントであるValentina Gligorijevicです。分生子の採取には、トリコデルマ菌糸体培養物に0.05%Tween 20を3ミリリットル重ね、菌糸が引き裂かれないように菌糸を押さないように注意しながら、熊手で分生子を分生子から放出します。分生子がすべて放出されたら、マイクロピペットを使用して分生子溶液を迅速に回収し、分生子溶液を15ミリリットルのチューブに加えてカウントします。

真菌プレートを調製するには、PDA培地を含む9cmのシャーレに100マイクロリットルの胞子を10倍で6mmの濃度で沈殿させ、滅菌ヘラを使用して直径2mmのガラスビーズ10グラムをプレートに加えます。次に、プレートを前後に静かに振って、プレートを完全に回転させて寒天の表面全体に胞子を均等に分散させるまで、プレートを90度のセグメントで回転させます。次に、プレートを摂氏30度でインキュベートし、成長阻害分析を行います。

ガーリックパウダーによる接触阻害アッセイを行うには、滅菌ヘラを使用して、所望のガーリックパウダーの量を個々の50ミリリットルチューブに計量し、一般に0.25〜16ミリグラム/ミリリットルの範囲の濃度を得る。各チューブに約45°CのPDAを10ミリリットル加え、各チューブを数回慎重に反転させて、粉末を寒天全体に均一に分散させます。

すぐに、均質化された懸濁液を直径5センチメートルのシャーレに注ぎ、寒天を室温で固化させます。接触阻害アッセイを行うには、直径5mmの滅菌ステンレス鋼チューブを使用して、対照皿および抗真菌化合物処理皿の寒天の中心に円をプロットし、滅菌爪楊枝を使用して寒天シリンダーを廃棄します。次に、直径5mmの新しいステンレス鋼管を使用して、15〜20個の円を真菌プレートにランダムにプロットし、滅菌爪楊枝を使用して、胞子、菌糸、または菌糸体で覆われた円柱をPDAプレートの空の領域に慎重に移します。

次に、プレートを摂氏30度のインキュベーターに戻します。気相抗真菌阻害アッセイ用のプレートを調製するには、抗真菌化合物を含むPDA培地10mまたはPDA培地のみを含む直径5cmのシャーレの蓋に10ミリリットルのPDA培地を注ぎ、寒天を室温で固化させます。50ミリリットルの遠心チューブをキャリブレーションツールとして使用して、寒天の中央にPDAの円を作り、滅菌ヘラを使用して円の周りの寒天を取り除きます。

直径5mmの滅菌ステンレス鋼チューブを使用して、蓋の媒体の中心に円をプロットし、滅菌つまようじを使用してオーガーシリンダーを廃棄します。次に、直径5mmの滅菌ステンレス鋼チューブを使用して、準備した真菌プレートにランダムにプラグを付け、滅菌爪楊枝を使用して、胞子、菌糸、または菌糸体でコーティングされたプラグをアッセイプレートの蓋に慎重に移します。この解析では、3つの抗真菌化合物によって引き起こされるトリコデルマ種SBT 10-2018の増殖阻害を、各真菌のステージで実証された接触および気相阻害アッセイを用いて評価しました。

カルベンダジムに対する高い胞子感受性は、トリコデルマと抗真菌化合物が接触していた初期の菌糸および菌糸ネットワークと比較して観察されました。対照的に、カルベンドジムは、この物質の揮発性が低いため、真菌が殺菌剤から離れた場所に置かれた場合、トリコデルマに対して抗真菌効果がありませんでした。.胸腺尋常性エッセンシャルオイルを抗真菌化合物として使用した場合、0.025%エッセンシャルオイルで菌糸体の成長阻害と比較して、胞子と初期の菌糸に対してより高い感度が観察されました。

予想通り、尋常性胸腺のエッセンシャルオイルは、真菌とオイルの間の距離に関係なく、同一の抗真菌活性を示しました。ニンニク粉末を使用した場合、胞子の発芽と早期の菌糸の伸長に対して、菌細胞の成長よりも高い有効性が観察されました。真菌プレートの準備中は、胞子が寒天プレートの表面に均一に分布し、同等の結果が得られるように特に注意を払う必要があります。