Name: 液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶペプチドグリカンの半定量分析。液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスを用いて、細菌の細胞壁構成を詳細に解析する方法です。抗菌薬耐性や細胞分裂の理解に貢献します。

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著者らは、このプロトコルの改良に貢献したジェニファー・ゲデス・マカリスター博士とアンソニー・クラーク博士に感謝の意を表します。この作業は、C.M.K(PJT 156111)に授与されたCIHRからの運営助成金と、E.M.A.に授与されたNSERCアレクサンダーグラハムベルCGS Dによってサポートされました。 BioRender.com 日にフィギュアが作成されました。

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
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<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルは、細菌培養物からペプチドグリカンを精製する方法、LC-MS検出のプロセス、およびバイオインフォマティクス技術を使用した組成の分析について説明しています。ここではグラム陰性菌に着目し、グラム陽性菌の分析を可能にするには若干の修正が必要になります。
ムロペプチドの調製は、1960年代に最初に製造されて以来、実質的に同じままです9,11,15。精製されると、嚢(セクション1.2.18)は、ストレプトマイセス・グロビスポラス由来のムラミダーゼ酵素ムタノリシンを使用して個々のムロペプチドに消化されます。ムタノリシンは、β-1,4-グリコシド結合を切断することによってPG構造を消化し、ペプチド側鎖が付加されたGlcNAc-MurNAc二糖からなる個々のムロペプチドを放出し、修飾または架橋を含みます(図1</stron...

ペプチドグリカン(PG)は、タンパク質やその他の細胞成分の構造的サポートを提供しながら、細胞の形態を維持するのに役立つ細菌の決定的な特徴です1,2。PGの骨格は、β-1,4結合N-アセチルムラミン酸(MurNAc)とN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)が交互に結合しています1,2。各MurNAcは、隣接する二糖結合ペプチドに架橋することができるᴅ-ラクチル残基に結合した短いペプチドを持っています(図1A、B)。この架橋により、細胞全体を囲む網目状の構造が生成され、しばしば嚢と呼ばれます(図1C)。PG合成中、前駆体は細胞質内で生成され、フリッパーゼによって細胞質膜を横切って輸送される。前駆体は、続いてトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ酵素によって成熟PGに組み込まれ、それぞれグリコシド結合およびペプチド結合を生成する3。しかし、一旦組み立てられると、PGを修飾および/または分解して成長および分裂を含む多くの細胞プロセスを実行する細菌によって産生される多数の酵素が存在する。さらに、PGのさまざまな修飾は、細胞シグナル伝達、抗菌剤耐性、および宿主免疫回避に関与している株、増殖条件、および環境ストレスに特異的な適応を与えることが示されています4。例として、一般的な修飾は、PG 4,5,6を分解する宿主産生リゾチーム酵素へのグリカンβ-1,4結合へのアクセスを制限することによって耐性を付与するMurNAc上のC6アセチル基の付加である。腸球菌では、ペプチド側鎖の末端ᴅ-Alaをᴅ-Lacで置換すると、抗菌剤であるバンコマイシン7,8に対するより大きな耐性が付与されます。
PGの単離および精製の一般的な手順は、1960年代に記載されて以来、比較的変わっていません9。細菌膜は、SDSによる熱処理によって溶解され、続いて結合タンパク質、糖脂質、および残りのDNAを酵素的に除去します。精製された無傷の嚢は、続いてGlcNAcとMurNAcの間のβ-1,4結合の加水分解によって個々の成分に消化することができる。この消化により、構造修飾および/または架橋が損なわれていないGlcNAc-MurNAc二糖が生成され、ムロペプチドと呼ばれます(図1B)。
PGの組成分析は、最初に高圧液体クロマトグラフィー分離(HPLC)を介して行われ、各ムロペプチドを精製し、続いてムロペプチド10,11を手動で同定しました。それ以来、これは液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)に取って代わられ、検出感度が向上し、個々のムロペプチドを精製する手動作業負荷が軽減されます。しかし、ムロペプチドの手作業による同定の時間と複雑さは依然として制限要因であり、実施される研究の数を減らしています。近年、「オミック」技術の出現により、自動LC-MS特徴抽出が強力なツールになり、非常に大規模なデータセットからの複雑なサンプル中の個々の化合物を迅速に検出および同定できるようになりました。特徴が特定されると、バイオインフォマティクスソフトウェアは、複雑なデータセット間のわずかな違いでも分離し、ユーザーにグラフィカルに表示する差分分析を使用して、サンプル間の変動を統計的に比較します。PG組成の分析のための特徴抽出ソフトウェアの応用は、探求され始めたばかりであり12,13,14、バイオインフォマティクス分析12に結合されています。ペプチド断片化を予測するタンパク質データベースが容易に入手でき、完全に自動化された同定を可能にするプロテオミクス解析とは異なり、ペプチドグリコミクス用の断片化ライブラリは現在存在しません。しかしながら、特徴抽出は、ムロペプチド同定を予測するために既知および予測された構造データベースと組み合わせることができる12。ここでは、PG組成の自動同定とバイオインフォマティクス鑑別分析のためのムロペプチドライブラリと組み合わせたLC-MSベースの特徴抽出を使用するための詳細なプロトコルを紹介します(図2)。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18逆相カラム - AdvanceBio ペプチドカラム (100 mm x 2.1 mm 2.7 & micro;m)</td><td>Agilent</td><td></td><td>LC-MSデータ収集</td></tr><tr><td>加熱マントルコントローラー、Optichem</td><td></td><td>Fisher 50-401-788</td><td>for 4% SDS boil</td></tr><tr><td>加熱マントル、1000mL 半球</td><td>状フィッシャー</td><td>CG1000008</td><td>4% SDS沸騰</td></tr><tr><td>インキュベーター、37°C;</td><td>糖類精製およびMSサンプル調製のための</td>C <td></td><td></td></tr><tr><td>Leibigコンデンサー、300MM 24/40、</td><td>4%SDS沸騰</td>液用フィ<td>ッシャー</td><td>CG121805</td></tr> 糖類<tr><td>の凍結乾燥用</td><td></td><td>Labconco</td><td></td> 糖類の凍結乾燥用</tr><tr><td>4</td><td>%SDS沸騰</td>質量分析計用<td>フィ</td><td>ッシャー90-691-18</td></tr><tr><td>Q-TOFモデルUHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>LC-MSデータ収集</td></tr><tr><td>微量遠心分離フィルター、Nanosep MF 0.2 &micro;m</td><td>フィッシャー</td><td>50-197-9573</td><td>MS注入前のサンプルのクリーンアップ</td></tr><tr><td>レトルトスタンド</td><td>フィッシャー</td><td>12-000-102</td><td>4% SDS煮沸</td></tr>用 <tr><td>レトルトクランプ</td><td>フィ</td><td>ッシャーS02629</td><td>4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>丸底フラスコ - 1リットルパイレックス</td><td>フィッシャー07-250-084</td><td></td><td>4%SDS煮沸</td></tr>用 <tr><td>ソニケーターモデル120</td><td>フィッシャーFB120</td><td></td> サ<td>ッカキュリ精製用</td></tr><tr><td>ソニケーター - マイクロチップ</td><td>フィ</td><td>ッシャーFB4422</td><td>糖類精製用</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td></td><td>サッカキュリー洗浄ステップ</td></tr><tr><td>超遠心ボトル、Ti45</td><td>フィッシャー</td><td>NC9691797</td><td>サッカキュリ洗浄ステップ</td></tr><tr><td></td> 水供給<td>都市</td><td></td><td>水冷コンデンサー</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>ケンブリッジソフト</td><td></td><td>分子エディター muropeptide フラグメンテーション予測用</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td> 注釈<td>付きムロペプチド、存在量、同位体パターンなどのリストを表示します。</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Aglient</td><td></td><td>QTOF 装置の実行</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Aglient</td><td></td><td>バイオインフォマティクス鑑別分析</td></tr><tr><td>MassHunter パーソナル化合物データベースおよびライブラリマネージャー</td><td>Aglient</td><td></td><td>muropeptide m/z MS データベース</td></tr><tr><td>MassHunter ProFinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>再帰的特徴抽出</td></tr><tr><td>MassHunter 定性分析</td><td>Aglient</td><td></td><td>viewing、MSおよびMS/MSクロマトグラム、</td></tr><tr><td>プリズム</td><td>、グラフパッド</td><td>、グラフ作成</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>、Perseus</td><td>Max Plank Institute of Biochemistry</td><td></td>、<td>1Dアノテーション</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーA637</td><td></td></tr>ア<tr><td>ミラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP168-1DNase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>フィ</td><td>ッシャーEN0521</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MSチューニングミックス-HP0321</td>ア<td>ジレント</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイセス・グロビスポラス由来のムタノリシン ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガス(純度>99%)</td> <td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase EStreptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸塩(二塩基性)</td><td>フィ</td><td>ッシャーS373</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(一塩基性)</td><td>フィ</td><td>ッシャーS369</td><td></td></tr>染色<tr><td>-すべての</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ペプチドグリカンは、細菌の細胞壁の重要な成分であり、抗菌剤の一般的な細胞標的です。ペプチドグリカン構造の側面はすべての細菌でかなり保存されていますが、グラム陽性/陰性の間および種間でもかなりのばらつきがあります。さらに、成長段階および/または環境刺激に応答して細菌種内で起こり得るペプチドグリカンに対する多数の既知のバリエーション、修飾、または適応がある。これらの変異は、成長/分裂、抗生物質耐性、宿主防御回避など、多くの細胞機能に関与することが知られている非常に動的な構造を生成します。ペプチドグリカン内の変動を理解するには、全体的な構造をその構成部分(ムロペプチドとして知られる)に分解し、全体的な細胞組成を評価する必要があります。ペプチドグリコミクスは、高度な質量分析と強力なバイオインフォマティクスデータ分析を組み合わせて、ペプチドグリカンの組成を詳細に調べます。以下のプロトコルでは、細菌培養物からのペプチドグリカンの精製、液体クロマトグラフ質量分析計によるムロペプチド強度データの取得、およびバイオインフォマティクスを使用したペプチドグリカン組成の鑑別分析について説明します。

強力なピーク認識ソフトウェアと相まって、MS機械の検出感度の向上により、複雑なサンプルの物質組成を非常に詳細に分離、監視、分析する能力が向上しました。これらの技術的進歩を利用して、ペプチドグリカン組成に関する最近の研究では、古いHPLCベースの方法論11,25,26,27,28,29,30,31よりも自動LC-MS特徴抽出技術12,13,14,24が使用され始めています。</su...

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

ペプトグリコミクスは、高度な質量分析と強力なバイオインフォマティクスデータ解析を組み合わせて、ペプチドグリカンの組成を詳細に調べます。バイオインフォマティクスアルゴリズムを使用すると、データファイルの集合体全体で質量分析データの分析、抽出、比較を同時に行うことができ、作業負荷が軽減され、精度が向上します。ペプチドグリカンの多様な変異と修飾を理解することは、成長と分裂、宿主の免疫回避、抗菌薬耐性などの細胞プロセスを理解する上で重要な意味を持ちます。まず、サンプルの小さなサブセットを準備して分析し、プロトコルに慣れ、実験パラメータを評価するためのパイロットプロジェクトとして機能させることをお勧めします。質量分析データ解析ソフトウェアは、特徴や機能を説明する際に使用する定義が異なることが多いため、視覚的なデモンストレーションは、ユーザーがこのプロトコルをプラットフォーム間で適用するのに役立ちます。ペプチドグリカン糖抽出では、凍結細胞ペレットを元の培養容量の約1〜10で20ミリモルリン酸ナトリウムに摂氏4度で再懸濁してから、細胞懸濁液を滴下して20ミリモルリン酸ナトリウム中の8%SDSを沸騰させて最終的な1対1の容量にします。攪拌しながら30分から3時間穏やかに沸騰させ、膜が完全に解離するようにします。得られる混合物は、細胞の凝集や粘度が残っていない、完全に透明である必要があります。溶液が室温に冷却されたら、超遠心分離によって糖嚢を収集し、その後、洗浄バッファーが約0.001%のSDS濃度を持つまで、室温の20ミリモルリン酸ナトリウムを1回の洗浄ごとに約50ミリリットルで5〜7回洗浄します比色色素によって決定されるように。最後の洗浄後、5〜10ミリリットルの室温20ミリモルリン酸ナトリウムに糖嚢を再懸濁し、サンプルに1ミリリットルあたり50マイクログラムのアミラーゼ、DNase、およびRNaseを10ミリモル硫酸マグネシウムで補充し、摂氏37度で攪拌または章動しながら1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、摂氏37度でプロナーゼ1ミリリットルあたり100マイクログラムで反応を一晩消化します。超遠心分離の翌朝、スチーマーで25ミリリットルの2%SDSと20ミリモルリン酸ナトリウムでサンプルを1時間煮沸します。インキュベーションの終了時に、示されているように、サンプルを50ミリリットルの室温二重蒸留水で5〜7回洗浄します。SDS濃度が約0.001%に達したら、ペレットを十分な量の二重蒸留水に再懸濁して糖嚢懸濁液を取得し、容器を洗浄します。マイナス80°Cで一晩保存した後、凍結サンプルを凍結乾燥してから、糖を二重蒸留水濃度1ミリリットルあたり10ミリグラムのペプチドグリカンに希釈します。LC-MS 分析を行うには、装置ソフトウェアで新しいプロジェクトを開始し、適切な LC-MS QTOF データファイルを目的の実験条件に割り当てます。データ解析ウィザードのバッチ再帰的特徴抽出を実行し、LC-MS 条件および装置のパラメーターに一致するようにデータ解析フィルターを設定して、個々の muropeptide を表すグループを正確に同定し、質量電荷比ピークを検証します。フィーチャー抽出の最後に結果を確認します。多数のフィーチャがグループ内で整列しなかった場合は、必要に応じて再帰フィルタリング パラメーターを調整して、検出ウィンドウを広げたり制限したりします。次に、データを複合交換ファイルとしてエクスポートします。差分スペクトル特徴解析を行うには、システムソフトウェアで新しいプロジェクトを開始し、データのインポート手順に従います。データ分析中に、差分分析の有意性と倍率変化を選択し、すべてのデータ ファイルにわたるベースライン データを強度の中央値に設定します。分析が完了したら、結果のグラフ分析と統計分析を調べて、テストした実験条件間で有意な存在量の変化を示すムロペプチドを特定します。プロジェクト ナビゲーターで、さまざまな解析を右クリックし、エクスポート オプションを選択して、フィーチャの詳細を tsv ファイルとして保存します。関連するすべてのデータを取得するために、複数の分析を保存してください。鑑別解析ソフトウェア内の[Results Interpretation]で、[ID browser]を選択し、予想される muropeptide 構造のライブラリを追加し、特徴抽出で示されているのと同様のパラメーターを選択して、同定された各特徴に対して予測される muropeptide アノテーションを生成します。予測された muropeptide アノテーションを手動で確認するには、タンデム質量分析クロマトグラムの質量電荷比のピークを、既知の muropeptide 構造の可能性のあるすべてのフラグメンテーションの予測質量電荷比と比較します。分子エディターを使用して、質量フラグメンテーションツールで予測されたムロペプチド構造を描画し、各結合が個別または組み合わせて切断された場合の質量分析フラグメントの質量電荷比を示し、ムロペプチド構造の可能なすべてのフラグメンテーションをタンデム質量分析クロマトグラムと比較します。muropeptide アノテーションを確認するには、タンデム質量分析クロマトグラムで、質量電荷比のアライメントウィンドウが非常に小さい状態で、複数のフラグメントの質量電荷比のピークを見つける必要があります。muropeptide修飾の全体的な変化を評価するには、統計的に有意な高倍変化muropeptideのtsvファイルを編集して、各muropeptide修飾に1つの列を含めます。このカラムにアノテーションされた各 muropeptide の指定を入力し、修正した tsv ファイルを Perseus にアップロードします。annotate rowsの下で、categorically annotate rowsをクリックし、各実験パラメータにデータファイルを追加します。次に、テスト中に、2つのサンプルテストをクリックしてスチューデントのTテストを実行し、1Dをクリックして1Dアノテーションを実行します。質量分析装置の検出感度の向上と高性能のピーク認識ソフトウェアの組み合わせにより、複雑なサンプルの物質組成を非常に詳細に分離、監視、分析する能力が向上しました。質量分析データから抽出した各 mass-to-charge ピークを特定の muropeptide と関連付けるには、既知および予測される muropeptide 構造のデータベースと相互参照することで容易になります。抽出された各特徴のフラグメンテーションタンデム質量分析クロマトグラムは、データベースを使用して提案されたムロペプチドのフラグメンテーションプロファイルと比較できます。ボルケーノプロットは、試験条件間で統計的に有意な存在量の変化が大きいことを示すムロペプチドを強調するために使用できます。同じ修飾を持つ複数のムロペプチドを一緒に調べると、1つの実験条件への傾向を調べ、グループ全体の有意性を評価できます。この方法でムロペプチドの修飾を追跡することで、実験パラメータの影響を受ける特定の酵素活性を特定できます。さらに、この傾向からの外れ値は、特定の特異性または生物学的機能を持つ酵素活性を明らかにする可能性があります。この手順では、ポリマーの生化学的変化と生物学的変異を調べることで、in vivoでPGに作用する酵素活性についての洞察を提供します。PG組成を詳細に調べることで、多くの重要な生理学的プロセスに影響を与える複雑な細胞構造の理解に役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。...

ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。...

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

ユビキタスなセカンドメッセンジャーc-di-GMPは、多くの細菌の成長と行動を制御します。私たちは、ほぼすべての細菌種におけるc-di-GMP結合タンパク質を生化学的に同定し、特性評価するための新しいCapture Compound Mass...

捕獲化合物質量分析 - 小説のc-ジ-GMPエフェクタータンパク質を同定するための強力なツール

血漿中のプロテオミクスとグライコミクスの精製、およびLC-MS/MS定量を組み合わせたハイスループットプロトコルが開発されました。N-結合型グリコシル化モチーフの脱アミド化解析は、脱グリコシル化部位に特異的でした。糖鎖ヒドラジドタグ法による標識では、フィルターを用いたN型糖鎖分離と個別性標準化を組み合わせることで、N型糖鎖の正確な定量が達成されました。...

定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

質量分析ベースのphyloproteomics（MSPP）は、 カンピロバクター・ジェジュニ SSPのコレクションを入力するために使用された。doylei多座配列タイピング（MLST）と比較して、歪みレベルで分離します。...

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

プロトコルは質量分析法によるオリゴ...

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides...

細菌のリポタンパク質と質量分析法による構造決定のための N 末端 Lipopeptides 準備の充実

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome...

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

サッカロミセス・セレビシエの主要な細胞脂質を同定し定量するために、タンデム質量分析と相まって液体クロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。酵母細胞内の主要な脂質クラスの定量的評価のための記載された方法は、汎用性、堅牢、および感受性である。...

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

オープン検索は、これまで知られていなかった糖鎖組成で装飾された糖ペプチドの同定を可能にする。この記事では、 アシネトバクター・バウマンニを...

アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

学ぶペプチドグリカンの半定量分析。液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスを用いて、細菌の細胞壁構成を詳細に解析する方法です。抗菌薬耐性や細胞分裂の理解に貢献します。

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

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