液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

ペプトグリコミクスは、高度な質量分析と強力なバイオインフォマティクスデータ解析を組み合わせて、ペプチドグリカンの組成を詳細に調べます。バイオインフォマティクスアルゴリズムを使用すると、データファイルの集合体全体で質量分析データの分析、抽出、比較を同時に行うことができ、作業負荷が軽減され、精度が向上します。ペプチドグリカンの多様な変異と修飾を理解することは、成長と分裂、宿主の免疫回避、抗菌薬耐性などの細胞プロセスを理解する上で重要な意味を持ちます。

まず、サンプルの小さなサブセットを準備して分析し、プロトコルに慣れ、実験パラメータを評価するためのパイロットプロジェクトとして機能させることをお勧めします。質量分析データ解析ソフトウェアは、特徴や機能を説明する際に使用する定義が異なることが多いため、視覚的なデモンストレーションは、ユーザーがこのプロトコルをプラットフォーム間で適用するのに役立ちます。ペプチドグリカン糖抽出では、凍結細胞ペレットを元の培養容量の約1〜10で20ミリモルリン酸ナトリウムに摂氏4度で再懸濁してから、細胞懸濁液を滴下して20ミリモルリン酸ナトリウム中の8%SDSを沸騰させて最終的な1対1の容量にします。

攪拌しながら30分から3時間穏やかに沸騰させ、膜が完全に解離するようにします。得られる混合物は、細胞の凝集や粘度が残っていない、完全に透明である必要があります。溶液が室温に冷却されたら、超遠心分離によって糖嚢を収集し、その後、洗浄バッファーが約0.001%のSDS濃度を持つまで、室温の20ミリモルリン酸ナトリウムを1回の洗浄ごとに約50ミリリットルで5〜7回洗浄します比色色素によって決定されるように。

最後の洗浄後、5〜10ミリリットルの室温20ミリモルリン酸ナトリウムに糖嚢を再懸濁し、サンプルに1ミリリットルあたり50マイクログラムのアミラーゼ、DNase、およびRNaseを10ミリモル硫酸マグネシウムで補充し、摂氏37度で攪拌または章動しながら1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、摂氏37度でプロナーゼ1ミリリットルあたり100マイクログラムで反応を一晩消化します。超遠心分離の翌朝、スチーマーで25ミリリットルの2%SDSと20ミリモルリン酸ナトリウムでサンプルを1時間煮沸します。

インキュベーションの終了時に、示されているように、サンプルを50ミリリットルの室温二重蒸留水で5〜7回洗浄します。SDS濃度が約0.001%に達したら、ペレットを十分な量の二重蒸留水に再懸濁して糖嚢懸濁液を取得し、容器を洗浄します。マイナス80°Cで一晩保存した後、凍結サンプルを凍結乾燥してから、糖を二重蒸留水濃度1ミリリットルあたり10ミリグラムのペプチドグリカンに希釈します。

LC-MS 分析を行うには、装置ソフトウェアで新しいプロジェクトを開始し、適切な LC-MS QTOF データファイルを目的の実験条件に割り当てます。データ解析ウィザードのバッチ再帰的特徴抽出を実行し、LC-MS 条件および装置のパラメーターに一致するようにデータ解析フィルターを設定して、個々の muropeptide を表すグループを正確に同定し、質量電荷比ピークを検証します。フィーチャー抽出の最後に結果を確認します。

多数のフィーチャがグループ内で整列しなかった場合は、必要に応じて再帰フィルタリング パラメーターを調整して、検出ウィンドウを広げたり制限したりします。次に、データを複合交換ファイルとしてエクスポートします。差分スペクトル特徴解析を行うには、システムソフトウェアで新しいプロジェクトを開始し、データのインポート手順に従います。

データ分析中に、差分分析の有意性と倍率変化を選択し、すべてのデータ ファイルにわたるベースライン データを強度の中央値に設定します。分析が完了したら、結果のグラフ分析と統計分析を調べて、テストした実験条件間で有意な存在量の変化を示すムロペプチドを特定します。プロジェクト ナビゲーターで、さまざまな解析を右クリックし、エクスポート オプションを選択して、フィーチャの詳細を tsv ファイルとして保存します。

関連するすべてのデータを取得するために、複数の分析を保存してください。鑑別解析ソフトウェア内の[Results Interpretation]で、[ID browser]を選択し、予想される muropeptide 構造のライブラリを追加し、特徴抽出で示されているのと同様のパラメーターを選択して、同定された各特徴に対して予測される muropeptide アノテーションを生成します。予測された muropeptide アノテーションを手動で確認するには、タンデム質量分析クロマトグラムの質量電荷比のピークを、既知の muropeptide 構造の可能性のあるすべてのフラグメンテーションの予測質量電荷比と比較します。

分子エディターを使用して、質量フラグメンテーションツールで予測されたムロペプチド構造を描画し、各結合が個別または組み合わせて切断された場合の質量分析フラグメントの質量電荷比を示し、ムロペプチド構造の可能なすべてのフラグメンテーションをタンデム質量分析クロマトグラムと比較します。muropeptide アノテーションを確認するには、タンデム質量分析クロマトグラムで、質量電荷比のアライメントウィンドウが非常に小さい状態で、複数のフラグメントの質量電荷比のピークを見つける必要があります。muropeptide修飾の全体的な変化を評価するには、統計的に有意な高倍変化muropeptideのtsvファイルを編集して、各muropeptide修飾に1つの列を含めます。

このカラムにアノテーションされた各 muropeptide の指定を入力し、修正した tsv ファイルを Perseus にアップロードします。annotate rowsの下で、categorically annotate rowsをクリックし、各実験パラメータにデータファイルを追加します。次に、テスト中に、2つのサンプルテストをクリックしてスチューデントのTテストを実行し、1Dをクリックして1Dアノテーションを実行します。

質量分析装置の検出感度の向上と高性能のピーク認識ソフトウェアの組み合わせにより、複雑なサンプルの物質組成を非常に詳細に分離、監視、分析する能力が向上しました。質量分析データから抽出した各 mass-to-charge ピークを特定の muropeptide と関連付けるには、既知および予測される muropeptide 構造のデータベースと相互参照することで容易になります。抽出された各特徴のフラグメンテーションタンデム質量分析クロマトグラムは、データベースを使用して提案されたムロペプチドのフラグメンテーションプロファイルと比較できます。

ボルケーノプロットは、試験条件間で統計的に有意な存在量の変化が大きいことを示すムロペプチドを強調するために使用できます。同じ修飾を持つ複数のムロペプチドを一緒に調べると、1つの実験条件への傾向を調べ、グループ全体の有意性を評価できます。この方法でムロペプチドの修飾を追跡することで、実験パラメータの影響を受ける特定の酵素活性を特定できます。

さらに、この傾向からの外れ値は、特定の特異性または生物学的機能を持つ酵素活性を明らかにする可能性があります。この手順では、ポリマーの生化学的変化と生物学的変異を調べることで、in vivoでPGに作用する酵素活性についての洞察を提供します。PG組成を詳細に調べることで、多くの重要な生理学的プロセスに影響を与える複雑な細胞構造の理解に役立ちます。