Name: 下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶマウス精細管のトランスイルミネーション支援解離法。特定段階の上皮周期を識別し、免疫染色解析で精子形成過程を詳細に研究する。生殖生物学の重要ツールとなる。

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この作品は、フィンランドアカデミー[315948、314387からN.K.への]からの助成金によって支えられ、;シグリッド・ジュセリウス財団[N.K.、J.T.へ]。エミール・アールトネン財団[J.-A.M.、T.L.へ]。トゥルク分子医学博士課程[S.C.-M.、O.O.O.]。

実験用マウスおよびすべての動物実験の維持は、トゥルク大学の実験動物のケアと使用に関する関連するガイドラインと規則に従って行われました。
1. 微小解剖のための半細管の調製
<ol><li>CO2窒息、子宮頸部脱臼を経て、成人男性マウス(生後8週≥、精巣は80~120mg)をCO2 窒息で犠牲にします。 注:マウスは性的に成熟し、できれば少なくとも8週は生まれでなければなりません。若年マウスのトランスイルミネーションパターンは、半日本上皮の波がまだ完全に確立されていないため成人とは異なり、そして精子形成の第1波のタイミングは21,22と異なる。<4週齢の雄マウスにおける長期精子の欠如は、トランスイルミネーション支援微小解剖への使用を妨げる。正常な精子形成を有するすべてのマウス株を使用することができる。</li>
	<li>腹側腹部に70%エタノールを吹き付けます。無菌はさみを使用して腹部腔を開き、V字型の開口部を作ります。</li>
	<li>滅菌鉗子で精巣上脂肪パッドを引っ張り、精巣を見つけ、はさみを使って解剖し、PBSを含む無菌100mmペトリ皿の上に置きます。 注:無菌性を維持するために、すべてのラボウェアと外科用ツールが無菌であることを確認してください。</li>
	<li>細かい先端のはさみを使用して、テニの膜を覆う厚い繊維状シートである チュニカ・アルブギネアでスリットを切断して精巣を脱カプセル化する。その後、鉗子のペアを使用して開いたチュニカを引き裂きます。鉗子で押して管を強制的に外に出し、チュニカを捨てます。 注意:チュニカを捨てる間、 動脈精巣 がチュニカと一緒に取り除かれるのは、いくつかの下流のアプリケーションにとって有益かもしれません。半細管を損傷しないようにします。</li>
	<li>新しいペトリ皿に半細管を移動し、ペトリ皿の底をカバーするのに十分な無菌PBSを注ぎます。次に、細管をそっと引き離しますが、細管を損傷しないようにします。 注: 機械的なストレスが多すぎると、トランスイルミネーション パターンに影響を与え、組織とその細胞アーキテクチャの実行可能性に影響を与えます。また、この管は、ステージング(3B)なしでこの時点から全実装免疫染色のために処理することもできる。SALL4、c-KITおよびDNMT3A18,23のような分化した精子で発現されるタンパク質に対する抗体を含めることによって、遡及的にステージを定義するだけで十分である場合がある。精子の密度は比較的信頼性の高いステージ指標である(図2)。</li>
</ol>2. トランスイルミネーション支援マイクロディシス
<ol><li>ペトリ皿をステージにテーピングして解剖顕微鏡の下にしっかりと置きます。 注:ペトリ皿をよくテープで留めて、収集した段階的な半細管セグメントの混合を引き起こす可能性のある動きを防ぐことが重要です。</li>
	<li>焦点下の半細管の光吸収パターンを明らかにするために、サンプルが下から照らされ、光がサンプルを通過することを確認してください。 すなわち、それはトランスライトされます。 注:吸収/散乱光の量は、細長い精子の凝縮のレベルに対して相対的であり、半細管内のそれらの束縛:より凝縮され、より多くの光が吸収され、 すなわち、より暗く見える。</li>
	<li>図2、図5A、図S1で説明した異なる段階の光吸収パターンを、細管の束を細切りで慎重に移動させることで、よく知ることができます。 注:段階は常に論理的な順序で互いに従い、半会体上皮の波を形成します。しかし、精子波の方向が時々逆転し、再び戻ってくる(モジュレーション4、9とも呼ばれる)、時には手順を複雑にすることを知ることが重要です。また、各段階の長さは、細管のmm数という点で、かなり異なる。</li>
	<li>注意深くフックチップで鉗子を使用して目的の管管を持ち上げ、マイクロディションハサミを使用して適切な長さのセグメントを切断します( 補足ビデオ1を参照)。鉗子の先端のフックは管管を持ち上げて持ち上げることを容易にし、それを絞るのを避けるのを助ける。 注: 切り取るセグメントの長さは、ダウンストリーム のアプリケーションによって異なります。タンパク質またはRNA解析用の特定の段階のプールされた細管片のコレクション12、13(II-V、VII-VIIIおよびIX-XI、図5B)の長さは、典型的には2〜5mmです。標準的なフェノール-クロロホルム抽出が使用される場合、約200ngのRNAは1mmの尿細管から導出され得る。ステージされたチューブセグメントの全体マウント染色の場合、セグメントの長さは>5 mmでなければなりません。スカッシュの準備の場合、セグメントの中央のセルが長すぎると終了できなくなる可能性があるため、セグメントの長さが 1 ~ 2 mm を超えないようにしてください。小管長の正確な測定のためにペトリ皿の下にmmスケールを使用してください。</li>
</ol>3. 異なる製剤の免疫染色
<ol><li>スカッシュ調製:ステージ検証および免疫染色 注:ステージ特異的な細管片は、フェーズコントラスト顕微鏡とその後の免疫染色によって生きている細胞の形態学的分析を行うためにカバーガラスと顕微鏡スライド上で押しつぶすことができます。トランスイルミネーション支援マイクロディセクショネ法に慣れた段階を検証するには、このアプローチを使用することをお勧めします。<ol>
<li>ピペットを使用して10 μLの体積でセグメントを収集し、顕微鏡スライドに移動します。</li>
		<li>カバーガラス(20mm x 20mm)を慎重にチューブに置いて、細管を押しつぶします。その結果、細胞は細管から流れ出て、生細胞単層を形成する。カバーガラスの端にフィルターペーパーを置き、細胞の広がりを容易にします。細胞を押しつぶしすぎて生き続けないようにしてください。</li>
		<li>顕微鏡下で広がる細胞を監視しなさい。40x目的で位相差顕微鏡を用いて、存在する細胞の種類を調べることによってステージ認識を検証する(図2、図S2)。</li>
		<li>細胞が広がって細管の両端から丸い単層を形成したら、滑り台を鉗子で保持しながら液体窒素を含む容器に浸します。10 sのために水没し続けてください。または、凍結のためのドライアイスプレートの上にスライドを置きます。</li>
		<li>カバーガラスをメスでひっくり返して取り外します。</li>
		<li>遅れることなく、固定を進め、2〜5分間90%エタノールの容器にスライドを素早く入れます。 注:スカッシュの準備が90%エタノールに置く前に解凍しないことを確認してください。他の固定剤は、アセトンなどの10分間使用することもできる。</li>
		<li>空気乾燥し、室温(RT)(いくつかの日まで)または-80 °C(長期)で保存します。</li>
		<li>免疫染色の場合、RTで10分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)でサンプルを後固定します。</li>
		<li>PBSでリンスし、0.1%トリトンX-100でPBSで5分間透過させます。</li>
		<li>PBSですすいで、各スカッシュサンプルの周りにグリースリングを描きます。</li>
		<li>50~100 μLの10%BSA(牛血清アルブミン)をPBSの0.1%Tween(PBST)に加え、RTで30分間サンプルをブロックします。</li>
		<li>BSA溶液を取り出し、一次抗体をPBSTで10%のBSAで希釈し、RTで1時間インキュベートします。</li>
		<li>PBSTで5分間3倍洗います。</li>
		<li>PBSTで10%BSAに希釈した二次抗体を用いてインキュベートする。 注:アクロソームを染色するために、サンプルは、特定の一次および二次抗体の代わりに、10%のPBSTで10%BSAのローダミン標識ピーナッツ凝集剤抗体(PNA、1:1:1000)でインキュベートすることができます(図S3)。</li>
		<li>PBSTで5分間3倍洗い、PBSで洗い流し、DAPIを含むマウント剤でマウントします。</li>
	</ol></li>
	<li>半細管の全実装免疫染色 注: 以下のプロトコルは、(ステップ 2.4 から)管状セグメントの全体マウント染色について説明します。研究者がステージングなしで全体マウント染色を実行したい場合(ステップ1.5から)、3.2.1と3.2.7のメモに注意してください。<ol>
<li>ピペットを使用して、氷冷PBSの細管セグメント(ステップ2.4から)を15 mL円錐形チューブに移し、氷の上で堆積させます。 注:1.5.から未段のチューブを使用する場合は、数回傾いた皿にピペットを上下に戻すことによって、ペトリ皿の中の管状を分離します。カットチップ付きの1mLピペットを使用してください。このステップは、組織の構造を開くことを意図しています。ただし、チューブを損傷する可能性があるため、あまり多くのピペットを避けてください。尿細管の沈降には数十秒かかります。小管状の断片、間質細胞および細胞の破片は上清にとどまる。</li>
		<li>ピペットまたは吸引器を使用して上清(SN)を慎重に除去します。氷冷PBSの10 mLを追加し、反転によって混合します。</li>
		<li>堆積物を許可し、前と同様にSNを削除します。</li>
		<li>5 mLの4%PFAを加え、+4 °Cの回転テーブル(20~30 rpm)で5時間固定します。 注: 固定時間は、関心のあるタンパク質とその細胞内局在性に依存します。核および細胞質タンパク質の場合、2時間固定は典型的には十分であるが、GFRα1(GDNFファミリー受容体α1;GDNFファミリー受容体α1のような膜マーカー; 図 6A,B) は、最大 6 時間の長い固定の恩恵を受けます。</li>
		<li>堆積物を可能にし、以前のようにSN(PFA)を取り除き、PBSの10 mLを加えてチューブを反転させることによって短時間すすいだ。</li>
		<li>堆積物を可能にし、以前のようにSNを取り除き、+4°Cの回転テーブルでそれぞれ少なくとも10分間PBS洗浄工程を3回繰り返し、+4°Cで染色または保存を進めます。 注:作業条件が無菌で清潔であれば、サンプルを保管して少なくとも数週間使用することができます。また、2%のストック溶液から0.02%(w/v)の最終濃度にアジドナトリウムを加え、+4°Cで保存する前に細管を保存するのに役立ちます。</li>
		<li>1 mL ピペットを使用して、10 ~ 20 個の固定チューブセグメントを 2 mL ラウンドボトム チューブに移動します。堆積物を許可し、SNを削除します。 注:上演されていない長い管状を使用している場合は、細管をペトリ皿に注ぎ、マイクロディスセクションはさみと鉗子カットセグメントを使用して約5〜20mmです。染色手順の間に長すぎるセグメントが絡み合うのに対して、短すぎるとセグメントが失われやすくなります。</li>
		<li>PBS(PBSX)で2%BSA +10%FBS(胎児ウシ血清)を0.3%トリトンX-100に1mL加えます。RTで回転テーブル(20~30 rpm)で少なくとも1時間ブロックします。</li>
		<li>1 mLのPBSXでリンスし、ピペット処理によりSNを除去し、PBSXで1%BSAに希釈した一次抗体250μLを加えます(1:100-1:2000希釈)。RTで2時間、または回転テーブル上の+4 °Cで一晩(20〜30 rpm)インキュベートします。</li>
		<li>上記のように1mLのPBSXで細管をピペットして抗体溶液を除去します。回転テーブル(20~30 rpm)の上で、PBSXで1時間3回洗浄します。 注:この最初の洗浄の後、サンプルは必要に応じて+4 °Cで一晩放置することができます。</li>
		<li>SNを取り除き、PBSXで1%BSAで希釈した250μLの二次抗体を添加します(通常、蛍光標識抗体の希釈量は1:500)。ホイルで覆い、回転テーブル(20~30 rpm)をRTで1時間インキュベートします。</li>
		<li>3.2.10 を繰り返します。</li>
		<li>最後にSNを取り外し、細管を顕微鏡スライドに注ぎます。ゲルローディングチップを使用して、細管をリニアストリップにそっと分離して配置します。余分なバッファーを排出し、取り付け媒体とカバースリップを追加します。 注意:細管を配置しながら乾燥しないでください。DAPIを用いた核の逆染色は、ほとんどの場合必要ありません。カバースリップの端をマニキュアでシールし、サンプルの乾燥や劣化を防ぎます。スライドはイメージングの前に+4 °Cで1〜2週間保存することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

上記で述べたトランスイルミネーション支援マイクロディクショクション法は、精子形成の研究のためのステージ指向のアプローチを可能にする。精子形成は高度に同期化されたプロセスであり、分化コミットメント(段階VII-VIII)、分裂(VII-VIII)の発症、突然変異分裂(XII)、精子伸び(VIII)および精子(V8)の発症など、精子異分化中のすべての重要なステップは、段階依存的な方法で調節され、実行される。ステージ指向の分析は、精子形成の特定のステップに制限され、したがって半日本体上皮周期の定義された段階でのみ発見されるこれらの特定の事象を研究するための強力なツールを提供する。この方法を習得するには、いくつかの練習が必要であり、良質の解剖顕微鏡と適切な照明条件の使用が成功の鍵です。この方法を日常のツールキットの一部として実施することは、精子形成中の分子事象のより正確な解剖を可能にすることによって、男性の生殖機能に関する研究の影響および生物学的関連性を大幅に改善する能力を有する。
我々が研究してきたすべてのWTマウス株は、同様のトランスイルミネーションパターンを示し、半日形成上皮周期の段階で保存された細胞会合を示す。生殖細胞の精子形成分化はWTマウスと大きく異ならないという条件では、我々が研究したすべてのノックアウトマウスモデルにも同じことが当てはまります。また、半日本円上皮周期7の段階の縦方向の区分配置を示す他の種にも適用することができる。ただし、非セグメント段階(ヒトなど)を持つ種は使用できません。トランスイルミネーションパターンを定義する際に、細長い精子のクロマチン縮合の本質的な役割を考えると、このプロセスのいかなる誤った調節も必然的にこの方法の実装に影響を及ぼすことが明らかである。若年マウスおよび若年成人(5-6週間)では、トランスイルミネーションパターンはまだ完全に確立されていないため、8週以上経過したマウスのみを使用する必要があります。また、細管を圧迫して引っ張ることは、半上皮内の細胞アーキテクチャを歪めるため、必然的にトランスイルミネーションパターンに影響を与えることに留意することも重要です。
分離された半細管セグメントはまた、虚生を含む精子形成結合プロセスの ex vivo 観察および操作を可能にする培養することができる。組織の生存率を確保し、RNAおよびタンパク質の分解を防ぐために、サンプルを採取し、マウスを犠牲にしてから2時間以内に処理する必要があります。半細管の エキビボ 培養では、犠牲から培養の発症までの時間は1時間を超えてはならない。尿細管断片の完全性は、通常、適切に収穫されれば 、インビトロで 72時間まで維持することができる。
半日膜上皮周期の段階は、スカッシュ製剤16の位相対比顕微鏡を用いて検証し、さらに正確に定義することができる。顕微鏡検査は、細胞の生きた上で行われ、分析に追加の次元を提供し、精子形成28、29、30の特定段階における細胞小器官または細胞の動きを観察することを可能にする。位相対照顕微鏡は、その後の免疫染色のための正確なステージングを提供し、ステージ特異的な変化を含む精子形成中のタンパク質発現および局在性ダイナミクスの非常に詳細な分析を可能にする。
細胞はスカッシュ製剤の上皮コンテキストから放出されるが、尿細管セグメントの全実装免疫染色は、その生理学的環境における精子形成細胞の研究を可能にする。したがって、全実装製剤は、断面での免疫染色よりも、半細管アーキテクチャとその細胞間接触のより良い視覚化を提供し得る。重要なことに、免疫染色前の管状セグメントのトランスイルミネーション支援ステージングは、特定のセグメントの特定の段階に関する情報を含めることによって、アプローチをさらに強力にします。全型染色は、細管周囲筋膜細胞、骨周管マクロファージ、精子などの半細管周囲の細胞の研究に特に有用であるが、滑術細胞および心肥後性胚芽細胞に関する研究に関する新しい洞察を開く可能性がある。

男性生殖細胞の二量体精子から成熟したハプロイド精子腫への分化、すなわち、精子形成は、性的成熟した個体1の精巣における半細管の上皮において行われる複雑なプロセスである。A1精子の有糸状子は、最初に5回分裂して分化をコミットした個体群を拡大し、最終的にハプロイド精子を生じさせる精子細胞としてメイオシスに入る。円形精子の分化、すなわち、精子形成は、核圧縮および壊死体およびフラゲラムのような精子特異的構造の構築を含む細胞形態の複雑な変化を伴う。マウスでは、精子形成の全過程は、完了するまでに35日を要します2,3.
任意のロケールで、半種上皮は、分化生殖細胞の最大5コホートに生殖細胞幹細胞/前駆細胞および体細胞セルトリ細胞1を宿す。分化性生殖細胞は同心円状の層を形成し、その組成は予測可能であり、開発の所定の段階でハプロイド細胞は常に特定のタイプの精子細胞および精子4,5と関連する。したがって、管状の任意の断面は、一定の組成の生殖細胞のコホートをホストする。これらの特定の細胞会合は、半日本体上皮の段階として定義される。ステージ当たりの段階は、滞っているチェックポイントのような状態を提示しないが、同期1、2、6で胚芽細胞コホートの分化が進行するにつれて継続的に発達する。マウスでは、半細管の縦軸に沿ってセグメント状に配置された12段階(I-XII)2があり、セミニファーの上皮、または精子発生性波7、8、9の波を形成する論理的な順序で互いに従う(図1)。精子形成の完了には4サイクルかかり、任意の半細管断面内の分化性生殖細胞の階層層またはコホートは、一時的に互いに離れた半円性周期である。サイクルの長さは種に依存し、マウスでは各サイクルは8.6日10を要する。
この段階は、組織学的精巣の断面5(図1および図2)上の半上皮の細胞組成および組織に基づいて同定することができる。しかし、組織学的分析は手間がかかり、時間がかかり、固定と染色を必要とし、したがって、生きた組織に適用することはできません。重要なことに、ステージングは、異なる段階のサイクルによって示される明確な光吸収/散乱パターンを利用することによって、解剖顕微鏡下で生体組織に対しても行うことができる(図2)。各段階が光を吸収し、散乱する能力は、任意の所定のステージがホストする後期のポストマイオティック精子のクロマチン縮合のレベルとこれらの細胞の梱包をバンドル7,11に対して相対的である。精子分化、すなわち、精子形成は、さらに、円形精子の8ステップ(ステップ1〜8)および8ステップの分化(ステップ9〜16)分化を含む16の発達段階に分けられる(ステップ9〜16)分化する(図1)。ステップ 9-11 伸長精液(ステージ IX-XI)は、低レベルのクロマチン縮合のみを表示し、低量の光が吸収される。クロマチン縮合はステップ11の精子(ステージXI)から始まり、ステップ15-16伸長性の精子(ステージIV-VIII)は完全に凝縮したクロマチンを含み、したがって最大の光吸収を示す(図3)。クロマチンは、精子の頭部にしっかりと詰め込まれるには凝縮する必要があります。光吸収パターンに寄与するその他の要因は、上皮内の精液を伸長させる場所(基底対円端)および伸長性精液の束縛(II-Vの段階で発音される)11(図3)。束は、細管の真ん中のスポットとして、解剖顕微鏡の下でエッジ上のストライプとして見られ、クロマチンをより凝縮すると、スポット/ストライプ11が暗くなる。
この記事では、半日本体上皮周期の特定段階を表す半細管セグメントの分離のためのトランスイルミネーション支援マイクロ解離法の使用について説明する。一旦単離されると、段階的な細管セグメントは、生化学的RNAおよびタンパク質分析12、13、14、15、フローサイトメトリー16、エクスビボチューブ培養17および免疫染色を含む様々な下流分析を受けることができる。また、生細胞形態学的解析とその後の免疫染色のために、ステージされた細管セグメントの押しつぶされた単層を調製するための詳細な下流プロトコル、ならびに管状セグメントの全実装免疫染色を提供する。図 4で説明する一言で説明したワークフロー。
トランスイルミネーション支援マイクロディション法は、ステージの同期された細胞組成のおかげで分化の特定のステップで生殖細胞を正確に同定し、単離することを可能にする。重要なことに、それはまた、生きた組織上の精子形成中のステージ依存性事象の研究を可能にする。精子形成のためのスケーラブルなインビトロモデルの欠如を考えると、この方法はまた、ステージ特異的な尿細管セグメントex vivo12、17に対する標的短期発達および毒物学的研究を可能にするユニークな利点を有する。ここでマウスの方法を説明する一方で、同じ手順は、ラット4、7、15、19、20などの半上層の半上皮の縦方向およびセグメント配置を有する任意の哺乳類種に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス20x20 mm</td><td>メンゼルGl&auml;ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 円錐管 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>牛胎児血清 (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>グリースペン (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>パラフォルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ (100-mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止封入剤</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>rhodamine-labeld Peanut 凝集素 (PNA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

精子形成は、最終的に身体の最も明確な細胞タイプの1つである精子を生み出すユニークな分化プロセスである。生殖細胞の分化は、4〜5世代の生殖細胞を同時に宿主とする細胞質セルトリ細胞の細胞質ポケットで同時に行われ、それらの発達を調整し、同期させる。したがって、断面内の生殖細胞型の組成は一定であり、これらの細胞の関連は半日本体上皮周期の段階(I-XII)としても知られている。重要なことに、ステージは、トランスイルミネーションによって明らかにされた差動光吸収/散乱特性に基づいて無傷の半細管から同定することができ、また、ステージが管状に沿って順番に続き続くという事実も示す。本稿では、マウス半離上皮周期の特定段階を表す半細管セグメントの分離のためのトランスイルミネーション支援マイクロ解離法について説明する。半細管の光吸収パターンは、まず解剖顕微鏡で検査され、次に特定の段階を表す管状のセグメントを切断し、下流の用途に使用します。ここでは、ステージ特異的スカッシュ製剤および無傷の細管セグメントに対する免疫染色プロトコルについて説明する。この方法により、研究者は精子形成の特定の段階で起こる生物学的事象に焦点を当てることができ、精子形成および基礎分子メカニズムの発達、毒物学、および細胞学的研究のためのユニークなツールを提供する。

本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

この方法は、ステージ特異的な精細管セグメントの同定と解剖を容易にし、精子形成における非常に特異的なステップの研究を可能にします。精髄上皮サイクルのステージは、新鮮な非固定尿細管で認識できるため、ダウンストリーム分析には目的のステージのみを選択できます。それは、それらの透過照明パターンに基づいてステージを認識することを学ぶためにいくつかの練習が必要ですが、このプロトコルはあなたの成功を確実にするはずです。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるOpeyemi Olotuです。まず、少なくとも8週齢の成体オスマウスを仰臥位に置き、腹側腹部を70%エタノールで消毒します。滅菌ハサミを使用して腹部の骨盤領域にV字型の切開を行い、滅菌鉗子を使用して精巣上体脂肪パッドを引っ張って精巣を見つけます。ハサミを使用して精巣を解剖し、PBSを入れた滅菌済みの100mmシャーレに組織を入れて採取します。先端の細いハサミを使用して、精巣をカプセル化する厚い繊維シートであるアルブギネアのチュニカにスリットを切り、鉗子を使用してチュニカを引き裂いて開き、尿細管を押し出します。カプセル化解除された精細管を新しいシャーレに入れ、ディッシュの底を覆うのに十分な滅菌PBSを追加します。次に、鉗子を使用して、組織に損傷を与えることなく尿細管をそっと引き離します。尿細管を解剖するには、皿を解剖顕微鏡ステージにテープで固定し、トランスイルミネーションをオンにします。細い鉗子を使用して細管の束を慎重に動かし、さまざまな段階の光吸収パターンと散乱パターンに精通します。次に、先端が引っ掛かった鉗子を使用して目的の尿細管を持ち上げ、マイクロダイセクションハサミを使用して適切な長さのセグメントを切断します。ステージ特異的な尿細管セグメントを切断した後、ピペットを使用して10マイクロリットルのPBSで目的のセグメントを収集し、そのセグメントを顕微鏡スライド上に置きます。20 x 20 mmのカバーガラスを細胞をあまり押しつぶさないように細管に慎重に押し付け、スライドを位相差顕微鏡のステージに置きます。カバーガラスの端に濾紙を置き、細胞が単層に広がるのを容易にし、40倍対物レンズを使用して細胞のステージを確認します。細胞が尿細管の両端から丸い単層を形成したら、スライドを液体窒素の容器に10秒間浸します。メスを使用してカバーガラスを細胞からはじき返し、すぐにスライドを90%エタノールに2〜5分間置きます。その後、スライドを風乾し、室温で最大数日間保管します。精細管のホールマウント免疫染色には、ピペットを使用して、目的のセグメントを氷上の氷冷PBSの15ミリリットルの円錐形チューブに移します。セグメントを沈殿させた後、PBSを慎重に取り除きます。10ミリリットルの新鮮な氷冷PBSを加え、反転して混ぜます。示されているように、尿細管が数分間落ち着くのを待ってから、上清を再度取り除きます。上清をすべて取り除いたら、尿細管を5ミリリットルのパラホルムアルデヒドに5時間固定し、摂氏4度で毎分20〜30回転します。インキュベーションの終わりに、細管を数分間沈殿させてから、サンプルを新鮮なPBSで摂氏4度の3回、回転しながら10分間洗浄します。最後の洗浄後、1ミリリットルのピペットを使用して、10〜20個の固定細管セグメントを2ミリリットルの丸底チューブに移します。セグメントが落ち着いたら、上清をPBSX中の2%BSAと10%FBSの1ミリリットルと交換し、室温で1時間、毎分20〜30回転でインキュベートします。ブロッキングインキュベーションの終了時に、サンプルを1ミリリットルのPBSXで洗浄します。尿細管を250マイクロリットルの一次抗体で標識する前に、PBSX中の1%BSAで室温、毎分20〜30回転で2時間希釈します。インキュベーションの終了時に、示されているようにPBSXで細管を3回洗浄してから、室温で毎分20〜30回転で光から保護された250マイクロリットルの適切な二次抗体でサンプルを標識します。インキュベーションの終了時に、尿細管を3回洗浄してから、少量の上清中の顕微鏡スライドに尿細管をデカントします。次に、ゲルローディングチップを使用して細管を線状に整列させ、余分なバッファーを排出します。次に、1〜2滴の封入剤を加えてから、スライドをカバーガラスで取り付けます。トランスイルミネーション下では、ステージ7〜8は、上皮の頂端表面に整列した完全に凝縮した伸長精子細胞が多数含まれているため、均一に暗く見えます。精子形成中に成熟した精子が内腔に放出された後、尿細管は、上皮内に凝縮した伸長精子細胞がないため、ステージ9〜10で非常に薄く見えます。この淡いゾーンの後には弱いスポットゾーンが続き、そのむらのある外観は、凝縮したクロマチンが束になった伸長する精子細胞の組織化に由来します。これらのバンドルは、後続のストロングスポットゾーンで非常に目立つようになります。精子細胞束は、基底層の近くに位置するセルトリ細胞核に向かって移動し、これは、透過照射時にステージ2〜5の尿細管の縞模様の外観として反映されます。束はステージ6で最終的に分散し、凝縮した細長い精子細胞は、ステージ8で上皮から放出される内腔の近くに移動します。尿細管セグメントの正確なステージは、スカッシュ調製物の位相コントラスト顕微鏡によって正確に検証できます。ステージドスカッシュ調製物の免疫染色は、精液上皮における目的タンパク質の発現および局在の研究に使用することができます。精細管ホールマウント染色は、通常、精細管上皮の基底膜と接触している細胞タイプを尿細管側または間質側で研究するために使用されます。この方法は、血液精巣関門や減数分裂後の生殖細胞など、上皮のより深い位置にある細胞や構造の研究にも使用できます。免疫染色に加えて、ステージ卵管セグメントは、生化学的RNAおよびタンパク質アッセイ、フローサイトメトリー、ex vivo卵管培養など、他の多くのダウンストリーム分析に使用できます。この方法では精子形成の非常に詳細な分析が可能になるため、精子の生産と男性の生殖能力に必要なすべての重要なプロセスを研究するための有用なツールを提供します。

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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