下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

この方法は、ステージ特異的な精細管セグメントの同定と解剖を容易にし、精子形成における非常に特異的なステップの研究を可能にします。精髄上皮サイクルのステージは、新鮮な非固定尿細管で認識できるため、ダウンストリーム分析には目的のステージのみを選択できます。それは、それらの透過照明パターンに基づいてステージを認識することを学ぶためにいくつかの練習が必要ですが、このプロトコルはあなたの成功を確実にするはずです。

その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるOpeyemi Olotuです。まず、少なくとも8週齢の成体オスマウスを仰臥位に置き、腹側腹部を70%エタノールで消毒します。滅菌ハサミを使用して腹部の骨盤領域にV字型の切開を行い、滅菌鉗子を使用して精巣上体脂肪パッドを引っ張って精巣を見つけます。

ハサミを使用して精巣を解剖し、PBSを入れた滅菌済みの100mmシャーレに組織を入れて採取します。先端の細いハサミを使用して、精巣をカプセル化する厚い繊維シートであるアルブギネアのチュニカにスリットを切り、鉗子を使用してチュニカを引き裂いて開き、尿細管を押し出します。カプセル化解除された精細管を新しいシャーレに入れ、ディッシュの底を覆うのに十分な滅菌PBSを追加します。

次に、鉗子を使用して、組織に損傷を与えることなく尿細管をそっと引き離します。尿細管を解剖するには、皿を解剖顕微鏡ステージにテープで固定し、トランスイルミネーションをオンにします。細い鉗子を使用して細管の束を慎重に動かし、さまざまな段階の光吸収パターンと散乱パターンに精通します。

次に、先端が引っ掛かった鉗子を使用して目的の尿細管を持ち上げ、マイクロダイセクションハサミを使用して適切な長さのセグメントを切断します。ステージ特異的な尿細管セグメントを切断した後、ピペットを使用して10マイクロリットルのPBSで目的のセグメントを収集し、そのセグメントを顕微鏡スライド上に置きます。20 x 20 mmのカバーガラスを細胞をあまり押しつぶさないように細管に慎重に押し付け、スライドを位相差顕微鏡のステージに置きます。

カバーガラスの端に濾紙を置き、細胞が単層に広がるのを容易にし、40倍対物レンズを使用して細胞のステージを確認します。細胞が尿細管の両端から丸い単層を形成したら、スライドを液体窒素の容器に10秒間浸します。メスを使用してカバーガラスを細胞からはじき返し、すぐにスライドを90%エタノールに2〜5分間置きます。

その後、スライドを風乾し、室温で最大数日間保管します。精細管のホールマウント免疫染色には、ピペットを使用して、目的のセグメントを氷上の氷冷PBSの15ミリリットルの円錐形チューブに移します。セグメントを沈殿させた後、PBSを慎重に取り除きます。

10ミリリットルの新鮮な氷冷PBSを加え、反転して混ぜます。示されているように、尿細管が数分間落ち着くのを待ってから、上清を再度取り除きます。上清をすべて取り除いたら、尿細管を5ミリリットルのパラホルムアルデヒドに5時間固定し、摂氏4度で毎分20〜30回転します。

インキュベーションの終わりに、細管を数分間沈殿させてから、サンプルを新鮮なPBSで摂氏4度の3回、回転しながら10分間洗浄します。最後の洗浄後、1ミリリットルのピペットを使用して、10〜20個の固定細管セグメントを2ミリリットルの丸底チューブに移します。セグメントが落ち着いたら、上清をPBSX中の2%BSAと10%FBSの1ミリリットルと交換し、室温で1時間、毎分20〜30回転でインキュベートします。

ブロッキングインキュベーションの終了時に、サンプルを1ミリリットルのPBSXで洗浄します。尿細管を250マイクロリットルの一次抗体で標識する前に、PBSX中の1%BSAで室温、毎分20〜30回転で2時間希釈します。インキュベーションの終了時に、示されているようにPBSXで細管を3回洗浄してから、室温で毎分20〜30回転で光から保護された250マイクロリットルの適切な二次抗体でサンプルを標識します。

インキュベーションの終了時に、尿細管を3回洗浄してから、少量の上清中の顕微鏡スライドに尿細管をデカントします。次に、ゲルローディングチップを使用して細管を線状に整列させ、余分なバッファーを排出します。次に、1〜2滴の封入剤を加えてから、スライドをカバーガラスで取り付けます。

トランスイルミネーション下では、ステージ7〜8は、上皮の頂端表面に整列した完全に凝縮した伸長精子細胞が多数含まれているため、均一に暗く見えます。精子形成中に成熟した精子が内腔に放出された後、尿細管は、上皮内に凝縮した伸長精子細胞がないため、ステージ9〜10で非常に薄く見えます。この淡いゾーンの後には弱いスポットゾーンが続き、そのむらのある外観は、凝縮したクロマチンが束になった伸長する精子細胞の組織化に由来します。

これらのバンドルは、後続のストロングスポットゾーンで非常に目立つようになります。精子細胞束は、基底層の近くに位置するセルトリ細胞核に向かって移動し、これは、透過照射時にステージ2〜5の尿細管の縞模様の外観として反映されます。束はステージ6で最終的に分散し、凝縮した細長い精子細胞は、ステージ8で上皮から放出される内腔の近くに移動します。

尿細管セグメントの正確なステージは、スカッシュ調製物の位相コントラスト顕微鏡によって正確に検証できます。ステージドスカッシュ調製物の免疫染色は、精液上皮における目的タンパク質の発現および局在の研究に使用することができます。精細管ホールマウント染色は、通常、精細管上皮の基底膜と接触している細胞タイプを尿細管側または間質側で研究するために使用されます。

この方法は、血液精巣関門や減数分裂後の生殖細胞など、上皮のより深い位置にある細胞や構造の研究にも使用できます。免疫染色に加えて、ステージ卵管セグメントは、生化学的RNAおよびタンパク質アッセイ、フローサイトメトリー、ex vivo卵管培養など、他の多くのダウンストリーム分析に使用できます。この方法では精子形成の非常に詳細な分析が可能になるため、精子の生産と男性の生殖能力に必要なすべての重要なプロセスを研究するための有用なツールを提供します。