急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ
2021年2月21日
ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。
このプロトコルは、AML細胞の表面上のNKG2DLを検出する2つの異なる方法を示しています。この技術は、既知のNKG2DLおよび未知のNKG2DLをすべて検出するための、迅速で使いやすい染色法を提供します。この方法により、バルクAML細胞から白血病幹細胞を分離することができ、これらの細胞をさらに特徴付けることを可能にする。
ビオチンとNKG2D融合タンパク質チューブを室温で解凍します。NKG2D FC粉末を素早くスピンダウンし、500マイクロリットルのPBSを加え、粉末を再構成し、P-1000マイクロピペットを使用して十分に混合します。NKG2DL融合タンパク質100マイクロリットルをビオチンチューブに加えて、1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度を得て、溶液をP-100マイクロピペットと完全に混合します。
AML細胞を解凍するには、液体窒素貯蔵から原発AMLを含む凍結を取り除き、すぐに37°Cの水浴に入れます。チューブを水の中でゆっくりと前後に動かし、小さな氷の結晶だけが残るまでバイアルの内容物を解凍させます。解凍した細胞をチューブを含む培地にすぐに移し、1ミリリットルの培地を使用してバイアルをすすいします。
細胞を10分間Gの300倍に遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てる。10%FCSを含むRPMI培地を5ミリリットルで細胞を洗浄し、遠心分離を繰り返します。染色バッファーを用いて細胞ペレットを、1ミリリットル当たり7番目の細胞に0.5倍の最終濃度まで再懸濁する。
次に細胞懸濁液の100マイクロリットルを細胞培養96ウェルU-底板に移し、プレートを300倍Gで10分間遠心した。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。ビオチン化されたNKG2D融合タンパク質のマスターミックスを準備し、細胞が井戸当たり50マイクロリットルの最終体積で再懸濁され、最終的なNKG2D濃度は1ミリリットル当たり10マイクログラムになるようにします。
準備したマスターミックスを加え、200マイクロリットルのピペットで細胞ペレットを再中断します。インキュベートおよび遠心分離機は、テキスト原稿に記載されているようにプレートを培養する。細胞が50マイクロリットルの最終容積で再懸濁されるようにストレプトアビジンPEを使用してマスターミックスを準備します。
マスターミックスをセルに加え、300マイクロリットルのマルチチャンネルピペットでペレットを再中断します。プレートを遠心分離し、上清を捨て、300マイクロリットルのマルチチャンネルマイクロピペットを使用して、200マイクロリットルの染色バッファープラス7-AADで細胞ペレットを再懸濁させます。次にフローサイトメトリー装置を用いて細胞を解析する。
分析されたAMLサンプルはCD34とNKG2DLでは正であるが、負の亜集団も存在し、合計で4つの異なる集団がある。典型的な格言戦略は、FSCおよびSSCを介して細胞の主要な集団を選択することから始まります。ダウンストリーム解析では、ダブレットとデッド セルは除外されます。
ゲートは、正の細胞を正しく識別するためにFMOコントロールを使用して調整されます。CD34対NKG2DLに陽性の細胞の蛍光強度をここで強調しています。CD34に陽性であるAML細胞は、NKG2DLの表面発現が低く、NKG2DL発現がステムの欠如と関連していることを示す。
3つの一次AMLサンプルは、プールされた抗NKG2DL抗体染色に対して、融合タンパク質染色に対して19.8、49.8、および89.4%の陽性事象を実証しました。一方、単一のリガンド染色は、リガンドに基づいて変化する割合で92%までの陽性事象の範囲を示した。この方法を試みるとき、原細胞は壊れやすく、このステップの間に簡単に死ぬ可能性があるため、プライマリAML細胞を解凍する際に迅速であることが非常に重要です。
このプロトコルを実行した後、NKG2DLシグナルに基づく細胞の並べ替えを行い、さらに集団を調査することができます。
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概要
本プロトコルでは、ヒト原発性急性骨髄性白血病（AML）検体におけるNKG2Dリガンド（NKG2DLs）を検出するための2つの異なる染色法を紹介します。これらの手法を用いることで、バルクのAML細胞から白血病幹細胞を分離し、さらなる特性解析を行うことが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 腫瘍学
背景
- NKG2Dリガンドは、がんにおける免疫認識において重要です。
- 急性骨髄性白血病（AML）における細胞の特性評価には課題があります。
- 現在の方法では、白血病幹細胞を効果的に区別できない可能性があります。
- 新しい染色プロトコルにより、検出能力を向上させることができます。
研究目的
- NKG2DL検出のための効率的な染色プロトコルを開発すること。
- バルクのAML細胞から白血病幹細胞の分離を容易にすること。
- AMLサンプルの特性解析を向上させること。
使用した手法
- NKG2DLを認識するための融合タンパク質の利用。
- 複数の抗NKG2DL抗体の適用。
- ビオチンおよびNKG2D融合タンパク質の融解と再構成。
- 染色のために目的の濃度にするための溶液の混合。
主な結果
- いずれのプロトコルにおいても、既知および未知のNKG2DLを効果的に検出できます。
- バルクのAML細胞から白血病幹細胞を分離することが可能です。
- これらの手法はユーザーフレンドリーであり、迅速に実施できます。
- AML細胞の詳細な特性解析が可能になります。
結論
- 新しい染色プロトコルにより、NKG2DLの検出能が向上します。
- これらの手法は、AMLの生物学的理解に寄与します。
- これらの技術を基盤としたさらなる研究により、治療に関する知見が得られる可能性があります。
よくある質問
産業上の実用性
白血病幹細胞をバルクのAML集団から区別することは、ターゲットの検証および前臨床モデルの開発における極めて重要な課題であり続けています。幹細胞特性を持つNKG2DL陰性サブポピュレーションを単離できる能力は、治療仮説のメカニズム的なリスク低減を可能にし、早期創薬ワークフローにおける予測の信頼性を高めます。このアプローチは、より高い腫瘍形成能を持つ疾患関連システムを特定することで、ポートフォリオの優先順位付けに直接的な知見を提供します。
バイオファーマ R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：NKG2DLの細胞表面発現に基づいて白血病幹細胞を単離することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値：分化したAML細胞から幹細胞様サブポピュレーションを区別するための、迅速でユーザーフレンドリーな手法を提供する。
- 科学的価値：NKG2DL陰性分画における幹細胞特性の機能的検証を通じて、生物学的リスクの低減をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： リガンド特異的染色および汎リガンド染色アプローチ間でのNKG2DL発現を比較するための、定量的なフローサイトメトリー読み取り値を生成します。
- 運用的価値： ハイスループットスクリーニングの準備に適した、再現性のある標準化された染色プロトコルを提供します。
- 科学的価値： 下流の化合物スクリーニングおよびターゲットエンゲージメント研究に向けた、検証済み生物学的系の調製を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：NKG2DLの抑制をLSCにおける免疫回避機構に結びつけることで、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を促進する。
- 運用的価値：疾患惹起細胞の単離を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性をサポートする。
- 科学的価値：NKG2DLの状態を用いて腫瘍形成能が異なるAML亜集団を層別化することで、前臨床モデルにおける予測の信頼性を高める。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、メカニズムに基づき定義されたサブポピュレーションの単離を可能にすることで、ターゲットバリデーションからリード化合物の特定、そして前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 発見生物学：NKG2DL陰性のLSCをNKG2DL陽性のバルクAML細胞から分離することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：フローサイトメトリーベースのスクリーニングプラットフォームと互換性のある、標準化された定量的な表面検出により、アッセイの即時利用性を実現します。
- 分析：定量的な従属変数（陽性イベントの割合、蛍光強度）の測定を提供し、染色方法の比較やサブポピュレーションの頻度解析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連モデルにおける機能検証のためのLSC単離を可能にし、前臨床段階への継続性を繋ぎます。
- エンタープライズ再利用：AMLサンプル全般に適用可能で、同様の免疫逃避機構を持つ他の癌種にも適応可能な、幹細胞濃縮の再利用可能な能力を確立します。
運用および組織への影響
- 科学的価値：幹細胞濃縮における予測精度の向上、LSC同定におけるメカニズム的な曖昧さの軽減。
- 運用上の価値：複数のAML検体におけるNKG2DL検出の標準化、再現性、およびスケーラビリティの確保。
- 戦略的価値：ターゲットバリデーションにおけるGo/No-go判断の改善、早期のリスク低減による資本効率の向上、後期段階における生物学的リスクの軽減。
- ポートフォリオへの影響：LSC濃縮能および免疫回避表現型に基づく、リスク調整後のターゲット優先順位付け。
実施上の検討事項
- フローサイトメトリー、細胞染色、および一次AML検体ハンドリングの専門知識が必要です。
- フローサイトメーター、遠心分離機、ならびにビオチン、NKG2D融合タンパク質、ストレプトアビジンPE、7-AADを含む試薬へのアクセスが必要です。
- 一貫した結果を得るために、ゲーティング戦略、FMOコントロール、およびコンペンセーション設定のチーム間での標準化が必要です。
- NKG2DLの発現パターンには変動があるため、異なるモデルシステムに適用する際は適応に関する検討が必要です。
- 実用上の制限として、解凍時の一次AML細胞の脆弱性が挙げられ、生存率を維持するために迅速な処理が必要です。
