コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

このプロトコルは、前臨床乳癌モデルにおける精度と効率の向上により、乳癌関連死の積極的かつ一般的な原因である肺転移を定量化する。元の技術と比較して、このプロトコルは研究者により速く、より一貫した結果を与える。使いやすいコンピュータ技術により、人数の誤りを軽減します。

この技術は、研究者が治療に成功した後に転移負担の減少を実証できるようにすることで、乳癌療法が肺転移に及ぼす影響を研究する前臨床研究に絶対に拡張することができる。まず、組織サンプル用の15ミリリットル円錐形チューブにラベルを付けます。その後、4種類のコラゲターゼ混合物の2.5ミリリットルとエラスターゼの30単位をチューブに加えます。

肺をきれいな1X HBSSウェルに移動し、鉗子で渦巻いて残りの血液を取り除き、空の3.5センチメートルの組織培養プレートに移します。はさみで肺をミンチし、HBSSの2.5ミリリットルでプレートをすすい、コラゲナーゼとエラスターゼカクテルで準備された15ミリリットルの円錐形チューブに肺片でHBSSを移します。ロッカーまたは回転ホイールで摂氏4度で75分間チューブをインキュベートします。

一方、1つのマウスに対して50ミリリットルの遠心管と1つの10センチメートルの組織培養プレートにラベルを付ける。希釈を行う場合は、希釈のための十分な組織培養プレートをラベル付けします。1X HBSSでチューブの体積を最大10ミリリットルにし、70マイクロメートルのセルストレーナーの上に内容物を50ミリリットルの円錐チューブに注ぎます。

1ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通してサンプルを軽く粉砕します。チューブを350倍Gで5分間遠心し、上清を捨て、10ミリリットルの1X HBSSでペレットを2回洗浄する。ペレットを60マイクロモル6-チオグアニン完全培養培地の10ミリリットルに再懸濁し、必要に応じて希釈スキームを使用して10センチメートルの細胞培養プレートにサンプルをプレートします。

プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%5%で5日間インキュベートします。適切な廃棄物容器にプレートから培養培地を注ぎます。細胞を固定するには、希釈されていないメタノールを5ミリリットルずつ各プレートに加え、室温で5分間インキュベートし、プレート全体を覆えるようにメタノールを旋回させます。

プレートから適切な廃棄物容器にメタノールを注ぎ、各プレートを5ミリリットルの蒸留水ですすぎます。1皿あたり0.03%メチレンブルーの5ミリリットルを加え、室温で5分間インキュベートし、メチレンブルー溶液を回転させ、プレート全体を覆います。適切な廃棄物容器にメチレンブルーを注ぎ、蒸留水を5ミリリットルで再び各プレートをすすいだ。

プレートを逆さまにし、余分な液体を取り除くためにペーパータオルにスロを入れます。蓋の上にプレートを置き、一晩空気を乾燥させます。転移性コロニーは青色になります。

プレートが乾燥したら、室温で無期限に保存することができます。ラベル付きの蓋をプレートから取り外し、サンプルの識別を明確にするように注意してください。きれいな、軽い表面にすべての染色された肺の版を並べます。

明るい領域にプレートのコレクションの写真を撮り、反射を最小限に抑えます。プレート内の反射は画像解析に影響を与え、避ける必要があります。撮影した写真に細心の注意を払い、いくつかの角度からいくつかの写真を撮ります。

プレートを撮影した後、背景に蓋や何かを除外するために画像をトリミングします。フィジー ImageJ で画像を開き、画像、調整、および色のしきい値をクリックして白黒に変更します。次に、しきい値の方法に既定を選択し、しきい値の色には白黒、色空間のラボを選択します。

暗い背景ボックスが選択されていないかどうかを確認します。イメージは白黒になります。黒は明るい背景を表し、白は青い転移性コロニーを表します。

円ツールを使用して、解析する領域を選択します。すべてのプレートに使用する円を 1 つ描き、各プレートが同じサイズの領域で確実に分析されるようにします。プレートのエッジに表示されるバックグラウンドノイズを最小限に抑えながら、プレート上の解析領域を最大化するサイズを選択します。

サイズは、描画時にツールバーに表示されます。選択した円を分析して、白い領域の割合を決定します。パーティクルをクリックして解析し、サイズとして 0 から無限大、円形の場合は 0 から 1、表示には何も選択しません。

要約ボックスをチェックし、大丈夫ヒット。中央に移動して、写真の次のプレートに円を移動し、解析を繰り返します。結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。

選択した領域の白い割合であるパーセント領域は、転移性の負担を表します。すべてのプレートとイメージを分析したら、各プレートの異なる画像間の面積の結果の割合を平均して、画像間の不一致を軽減します。フィジー ImageJ 分析は、手動カウントおよび病理組織学的分析と比較されました。

3人の別々の研究者が手動で転移性コロニーを数えた場合、結果はカウンター間で矛盾していた。フィジー ImageJ の結果は、3 つのイメージの各カウンター間で一貫していました。3つの画像と3つのカウンターの結果を各肺プレートに合わせた。

結果は、カウンター間で一貫した結果を提供し、画像間の変動を考慮するために、各プレートの平均化されました。ほとんどの転移性から最も少ない転移性のプレートにプレートをランク付けすると、手動カウントは最もコンフルエントプレートに同意しましたが、次のすべてのランクは矛盾していました。平均的なフィジー ImageJ の結果からのランクは、カウンター間ではるかに一貫していました。

画像内の反射を避けることの重要性を示すために、手の反射とその後のフィジーImageJ分析を持つ画像が、反射のない同じプレートの画像と共に示されています。汚れた背景表面からの暗い傷やプレート上の血液サンプル残渣もフィジーImageJ分析に悪影響を与える可能性があります。この血板は2つの転移コロニーしか持たなかったが、暗い残留物はフィジーImageJがそれを31.6%転移と考える原因となった。

このプロトコルを試みるときは、反射のために画像を注意深く調べ、画像の各プレートに同じサイズの円を使用し、少なくとも3つの別々の画像の間で各プレートの結果を平均することを忘れないでください。