Name: 腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶ マウス腸上皮ビリの3Dオルガノイド培養法。擦り取り法で間葉組織を保持し、脱分化細胞のオルガノイド形成能を解析します。腸再生と幹細胞生物学の理解に応用可能です。

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本書は、NIH国立がん研究所の賞番号K22 CA218462-03によって支援されました。R-Spondin1を発現するHEK293-T細胞は、マイケル・P・ヴェルジ博士からの寛大な贈り物でした。

子宮頸部脱臼によるタモキシフェンと安楽死の使用を含むすべてのマウス実験は、スティーブンスechnology研究所の制度的動物ケアおよび使用委員会の承認を得た。
1. マウス
メモ: Smad4f/fの生成;キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ヴィリン・クレERT2 マウスは、以前に説明されている3.8~12週齢の成体雌マウスを使用した。
<ol><li>Smad4KO:βカテニンGOF突然変異をSmad4f/fに誘導する。キャットンブ・ロクス(ex3)/+;4日間連続してトウモロコシ油中のタモキシフェンの腹腔内注射を伴うヴィリン・クレERT2.</li>
	<li>最初のタモキシフェン注射の10日後にマウスを屠殺する子宮頸部脱臼。</li>
	<li>腹部に70%エタノールを吹き付けて、マウスの毛皮が腹腔内に入るのを防ぎます。</li>
	<li>腹腔を解剖はさみで開いて腸を露出させる。はさみと鉗子の助けを借りて腸を分離します。 注:腸上皮におけるβカテニンの機能変異 (Smad4KO;βカテニンGOF)の 利益と共にSmad4の付随的損失は、Smad4f / fを注入することによって達成された。キャットンブ・ロクス(ex3)/+;ビリン・クレERT2 マウスは、トウモロコシ油中の0.05 gタモキシフェン/kg体重で4日間連続して毎日マウスを使用しています。これらのマウスは、最初のタモキシフェン注射の10日後に収穫され、脱分化ビリ中の幹細胞関連マーカーを発現する細胞の存在を確実にする。</li>
</ol>2. 十二指腸の分離と準備
<ol><li>十二指腸の近位半分を解剖する。</li>
	<li>10 mL のシリンジで 5 mL の氷冷 PBS で十二指腸を洗い流し、発光の内容をクリアします。</li>
	<li>斜めのはさみで縦方向に十二指腸を開き、十二指腸の内腔がオペレータに向いている氷の上に15cmのペトリプレートの上に平らに十二指腸を置きます。</li>
</ol>3. スクレイピングによるヴィリの分離
<ol><li>削り始める前に、6ウェル組織培養プレートのウェルの1つに70 μmメッシュストレーナーを入れなさい。すべてのウェルを4 mLの1x PBSで満たし、6ウェル組織培養プレートを氷の上に置きます(図1)。</li>
	<li>2つの顕微鏡的なガラススライドを使用して次のように絨毛を削る:1つは十二指腸を下に保持し、もう1つは擦り傷する(図1B1)。<ol>
<li>十二指腸の明るい側を表面的に2回掻き取り、粘液を取り除く。このステップは粘液層を取り除くが、絨毛を除去しないように圧力をかける。</li>
		<li>もう一度十二指腸を削り取り、3..1と同じ圧力を加えて2回、その間に絨毛がスライド上に集まるのが見える(図1B2)。これは、納骨堂がつながれずに絨毛を生み出すために最適な圧力(オペレータによって経験的に決定されなければならない)です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBSを含む1 mL転送ピペットを使用して、ステップ3.2.2からスライド上で収集された絨毛を、6ウェル皿に入れた70 μmメッシュストレーナーに移します。この絨毛は、このように、すべての擦り傷の後に収集される(図1B2)。</li>
	<li>70 μmのストレーナー(ステップ3.3から)で採取した絨毛を、冷たいPBS(~4 mL/well)を含む6ウェル皿に一連のウェルを通して(絨毛付き)を通して移して洗います。これは、緩い納骨堂を取り除くためです。</li>
	<li>p1000パイプを使用して、70 μmストレーナーから氷上の新しい15 mLチューブにPBS(~3 mL)の絨毛懸濁液を移します。</li>
	<li>0.1%BSAコーティングされた鈍い端のp200ピペット先端を使用して、絨毛懸濁液の50 μL体積をガラススライドに吸引します。4倍率の50μL液滴の絨毛数をカウントし、PBS懸濁液中の絨毛の濃度を決定します。例えば、50 μLの懸濁液に10絨毛が調べれば、絨毛濃度は0.2絨毛/μLです。これはまた、つながれた納骨堂の不在を確認する時です。</li>
	<li>BME-R1マトリックスの0.5絨毛/μLの濃度でプレートに必要な絨毛懸濁液の体積を計算します。余分な100 μLを追加して、ピペッティングエラーと、絨毛の純度を確保するために必要な顕微鏡検査に必要な体積を考慮します。 注意:最初の2つの擦り傷で使用される圧力は、粘液を取り除くが絨毛は除去せず、その後の擦れで使用され、その間にvilliが解放される。絨毛放出が最初に観察された後、ツー・フロスクレーピングの数を2に制限する。この措置は、納骨堂がつながれた絨毛の放出を回避する。テザード状の納骨堂の存在を確実にするためには、絨毛を顕微鏡的に評価することが不可欠である。</li>
</ol>4. BME-R1マトリックス上の絨毛のめっき
<ol><li>0.1%BSAコーティングp200鈍エンドピペットチップを使用して、BME-R1マトリックスの12.5 μLでウェルあたり〜6絨毛の密度でプレートするために必要な絨毛の体積(ステップ3.6から)マイクロ遠心チューブに移します。この時点でBSAコーティングされた鈍い端の先端の使用は、尖った先端のために大きすぎる絨毛が、先端の側面にくっつくのからブロックされたり失われたりすることなく吸引されることを保証する。</li>
	<li>冷蔵遠心分離機(4°C)で200xgで2分間ビリをスピンダウンし、上清を取り除きます。</li>
	<li>ステップ 4.2 を繰り返して残留 PBS を除去し、層流フードの下で次のステップに進みます。</li>
	<li>氷の上に解凍した冷たいBME-R1の必要な量で、絨毛ペレットを穏やかに再懸濁します。</li>
	<li>p20ピペットを使用して、BME-R1マトリックスの絨毛のプレート12.5 μL/ウェルを、前温めの96ウェルU-底板で3Dで行います。</li>
	<li>BME-R1マトリックスを固化できるように、37°Cの組織培養インキュベーターでプレートを15分間インキュベートします。</li>
	<li>125 μL/well の事前温められた ENR (上皮成長因子/ノギン/R-spondin1) メディア: 高度な DMEM F-12 メディア, 1xペニシリンを補う:ストレプトマイシン、10 mM HEPES、グルタマックス、50 ng/mL EGF、100 ng/mLノギン、HeK293-T細胞からの5%のコンディション培地R-Spondin1、1x N2、1x B27、1 mM N-aylcetse、0.mg5</li>
	<li>5%CO2で37°Cに維持された組織培養インキュベーターにめっき絨毛をインキュベートし、1日おきに培地を交換する。</li>
	<li>絨毛由来オルガノイドが予想される最も早い時点は2日後であるため、2日前にオルガノイドが現れる井戸は捨てる。 注:絨毛の半分または半分以上の長さを持つ絨毛は、1つのビラスとしてカウントされます。クリ由来オルガノイドとは異なり、絨毛由来のオルガノイドは、めっき後24時間以内には期待されません。オルガノイドを起用する絨毛は、オルガノイドの形成前に暗くなり、縮小しているように見える。したがって、メッキの1日以内に発生するオルガノイドを有する井戸は、もっともらしい暗号汚染に由来する妥当性を避けるために廃棄されるべきである。条件付きメディアの作成に使用される方法は、要求に応じて利用できます。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
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<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する不分化ビリ上皮の自己再生能力を確認できる。正常な腸上皮は、陰窩内に幹細胞が存在するため3Dで培養した場合、陰窩からオルガノイドを生じさせることができるが、絨毛コンパートメントからは生じることができない。したがって、3D培養で培養したデファノイド絨毛上皮からオルガノイド形成は、細胞運命逆転から幹細胞形成を確認する。突然変異および/または損傷に起因する腸上皮における細胞運命逆転に関する報告は、2、3、9、10、11、12を増加している。したがって、この方法は、不分化した絨毛上皮が生体内の幹細胞マーカーを発現する類似のシナリオ...

腸内の納骨堂は絨毛ではなく、マトリゲルまたはBME-R1マトリックスで培養するとオルガノイドを形成する。これらのオルガノイドは自己組織化構造であり、生体内の腸上皮に存在する種々の分化系統、前駆細胞、および幹細胞の存在に起因してしばしば「ミニ腸」と呼ばれる。クリプトからオルガノイドを形成する可能性は、幹細胞1の存在に起因する。一方、腸内絨毛は分化した細胞のみで構成されており、オルガノイドを形成することはできません。しかし、突然変異2または絨毛上皮の脱分化を可能にする条件は、絨毛2、3の幹細胞を引き起こし得る。この絨毛上皮の幹形成をもたらすこの運命変化は、3Dマトリックスで脱分性性のヴィルス上皮をめっきし、絨毛上皮における脱ノボ茎の指標としてそのオルガノイド形成電位を決定することによって確認することができる。したがって、この手順の重要な側面は、暗号汚染の欠如を確実にすることです。
Smad4KO:β-カテニンGOF 条件突然変異は、絨毛における増殖および幹細胞マーカーの発現によって特徴づけられる腸上皮における脱分化を引き起こす、 そして最終的に異所性陰窩と呼ばれる絨毛の陰窩様構造の形成 これらの分化された絨毛は、異所性の陰窩(in vivo)における幹細胞マーカーの発現と、オルガノイドwhを形成する変異絨毛の能力によって決定されたエンメッキマトリゲル3.以下に挙げた手順は、Smad4KOにおける腸上皮の変性性を確認するために用いられる方法論を詳述する:β-カテニンGOF 変異マウス。絨毛を単離するためのこの方法論の主な特徴は、EDTAキレート法4とは対照的に、腸管腔の掻き取りの使用であった。EDTAキレート法とは異なり、掻き取りによる絨毛分離は、基礎となる間質の大部分を保持し、つながれた納骨堂なしで絨毛を生み出すために擦り傷の圧力を調整することを可能にする。削りの圧力はオペレータに主観的であるため、納骨堂なしで絨毛を生み出す最適な圧力は、オペレータによって経験的に決定されなければならない。この手順の重要な側面は、BME-R1マトリックスでめっき前後の絨毛の顕微鏡検査による暗号汚染の欠如を確実にすることです。
腸絨毛は、ガラススライドで腸内腔を削り取り、70μmのフィルターに入れ、PBSで洗浄して、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを取り除きます。この方法は、クリリが最も長い十二指腸の近位半分を収穫する絨毛を閉じ込め、b)絨毛を収穫するスクラップの数を最小限に抑え、c)6ウェル皿の中で一連のPBSを通して絨毛を含むフィルターを洗浄し、d)顕微鏡検査前およびRMEマトリックスの後にクリプト汚染の欠如を確認する。EDTAキレートではなく擦り傷によるVilli単離は、必要に応じて、絨毛上皮からのオルガノイド開始のためのニッチ信号5、6、7、8を提供し得る根底の間質の完全な損失を防ぐ。

<table><tbody><tr><td>高度なDMEM F-12メディア</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-ジアミノベンジジン</td><td>Vector LabsSK-4105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底プレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABCキット</td><td>ベクターラボ</td><td>&nbsp;PK4001</td><td></td></tr><tr><td>角度付きはさみ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリー 組換えヒト EGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50倍)、マイナスビタミン A</td><td>ギブコ</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) プロテアーゼフリー パウダー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td></td><td></td>1030001</tr><tr><td>Cdx2 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>コーン油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 ミクロン セルストレーナー</td><td>ライフサイエンス</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 還元成長因子基底膜抽出物、R1</td><td>R&D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293-T cells expressing RSPO-1</td> マイケル・<td>ヴェルジ</td><td></td><td></td>博士からの贈り物</tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ フィルター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Micrscope ガラス スライド</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 ブラント チップ</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>プリモシン (50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Signal diluent</td><td>Cell Signaling</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3d培養

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

腸上皮由来のオルガノイドのクロノジェニック性は、その中に幹細胞が存在することに起因する。マウスの小腸上皮は、陰窩および絨毛に区分される:茎および増殖細胞は、陰窩に閉じ込められるのに対し、絨毛上皮は分化した細胞のみを含む。したがって、正常な腸内窩は、絨毛ではなく、3D培養でオルガノイドを生じさせることができる。ここで説明する手順は、茎につながる脱分化を受けているvillus上皮にのみ適用可能である。記載された方法は、Smad4-機能喪失:β-カテニン機能の利得(Smad4KO:β-カテニンGOF)条件変異マウスを使用する。この突然変異は、腸内絨毛を分解し、絨毛内に幹細胞を生成させる。脱分化を受けた腸絨毛は、ガラススライドを使用して腸から掻き取られ、70μmのストレーナーに入れられ、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを濾過してオルガノイド形成の可能性を決定するために数回洗浄される。得られたオルガノイドが、3Dマトリックスでめっきする前後の両方で、単一の絨毛の欠如を確実にするために、分離された絨毛を顕微鏡的に評価し、絨毛からのオルガノイド発達の時間経過を監視する2つの主な基準を使用した。絨毛からのオルガノイド開始は、めっき後2〜5日後に起こり、不規則な形で現れるのに対し、同じ腸上皮由来の陰窩由来のオルガノイドはめっきの16時間以内に明らかであり、球状に見える。しかし、この方法の制限は、オルガノイドが形成される数、およびビリからのオルガノイド開始に要する時間が、脱分化の程度によって異なるためである。したがって、変異の特異性または脱分性を引き起こす侮辱に応じて、ビリがそれらのオルガノイド形成電位をアッセイするために収穫できる最適な段階は、経験的に決定されなければならない。

手順の成功の決定要因は、暗号汚染を防ぐことです。ビリ(および汚染された納骨堂からではない)からのオルガノイドの開発は、4つの主要な基準を確認することによって保証される:1)BME-R1で絨毛をめっきする前後の顕微鏡検査によって収穫された絨毛の純度を確保する、2)すべてのメッキ絨毛を個別に視覚化できるように、十分に限られた数の絨毛をめっきするタイムコースの画像は、絨毛(図3)および4)からオルガノイドの発達を示し、絨毛から発育するオルガノイドの運動と形態学的外観を示す。絨毛から開始するオルガノイドは、最初は不規則な形で現れ、暗号由来のオルガノイド(EDTA/PBSキレート法1,4)を用いて隔離された暗号を分離して培養し、4倍の倍率で見られるまでに2~5日かけて、一晩で明確に定義された境界を持つ球状の構造として現れる(図2)。
絨毛のオルガノイド形成電...

この手順は、脱分化を受けているマウス腸管上皮からの絨毛の分離を記述し、そのオルガノイド形成電位を決定する。

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する脱分化ビリ上皮のオルガノイド形成能を確認できる。絨毛の収集は、オルガノイド開始に必要な場合にニッチ信号を提供し得る根底の間分関係の完全な損失を防ぐEDTAキレート法ではなく、擦り傷を介して行われる。この方法は、増殖および分化された区画が物理的に線引きされ、脱分化細胞が生体内で幹細胞マーカーを発現する上皮組織に適用可能である。このプロトコルのいくつかの要因は、絨毛を収穫するための最適な段階と、時間と練習を要する絨毛を削るための最適な圧力を含め、経験的に決定する必要があります。4日間連続してタモキシフェンとトウモロコシ油の腹腔内注射を行った変異マウスの機能変異のSmad4ノックアウトおよびβ-カテニンのゲインを誘導する。マウスを安楽死させた後、腹部に70%エタノールを吹き付けて、マウスの毛皮が腹腔に入るのを防ぎます。解剖はさみで腹腔を開いて腸を露出させ、はさみと鉗子を使って腸を単離する。十二指腸の近位半分を解剖し、その後、10ミリリットルの注射器で氷冷PBSの5ミリリットルで十二指腸を洗い流し、発光含有量をクリアする。斜めのはさみで縦方向に十二指腸を開き、十二指腸の内腔がオペレータに向いている氷の上に15センチメートルのペトリ皿の上に平らに十二指腸を置きます。削り始める前に、6ウェル組織培養プレートのウェルの1つに70マイクロメートルのメッシュストレーナーを置きます。すべての井戸を1X PBSの4ミリリットルで満たし、プレートを氷の上に置きます。2つの顕微鏡的なガラススライドを使用して絨毛を削り、1つは十二指腸を下に保持し、もう1つは擦り傷を付けます。十二指腸の明るい側を表面的に2回削り、絨毛を取り除かずに粘液を取り除き、十二指腸をさらに2回削り、納骨堂をテザリングすることなくスライド上の絨毛を収集する。PBSを含む1ミリリットルのトランスファーピペットを使用して、6ウェル皿の70マイクロメートルメッシュストレーナーに絨毛を移します。すべての擦り傷の後に絨毛を収集します。緩い納骨堂を取り除くために、1ウェルあたり4ミリリットルの氷冷PBSを含む6ウェル皿の一連の井戸を通してストレーナーを移すことによって、70マイクロメートルのストレーナーで収集した絨毛を洗います。P1000ピペットを使用して、70マイクロメートルストレーナーから氷上の新しい15ミリリットルチューブにPBSの約3ミリリットルで絨毛懸濁液を移します。0.1%BSAコーティングの鈍い終わりP200ピペットの先端を使用して、絨毛懸濁液の50マイクロリットルの体積をガラススライドに移します。4X倍率の50マイクロリットルの液滴中の絨毛の数を数えて、PBS懸濁液中の絨毛の濃度を決定し、つながれた納骨堂の欠如を確認する。絨毛をプレートするには、0.1%BSAコーティングP200鈍エンドピペットチップを使用して、BME-R1マトリックスの12.5マイクロリットルで6絨毛のメッキ密度のためにマイクロ遠心チューブに絨毛を移します。4°Cで200倍Gで2分間ビリをスピンダウンします。上清を取り除き、遠心分離を繰り返して残留PBSを除去します。ラミナールフローフードで、氷の上で解凍した冷たいBME-R1の必要量にそっと絨毛ペレットを再懸濁します。P20ピペットを使用して、BME-R1マトリックスの絨毛のプレート12.5マイクロリットルを摂氏37度に予め温めた96ウェルU底板のウェルあたり。BME-R1マトリックスを固化できるように、37°Cの組織培養インキュベーターで15分間プレートをインキュベートします。各井戸に、テキスト原稿に記載されているように補足される125マイクロリットルの温め前のENR培地を加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度の組織培養インキュベーターにめっき絨毛をインキュベートし、一日おきに培地を交換します。オルガノイドが2日前に現れる井戸を捨てる。同じマウス腸から脱分化された絨毛上皮と陰窩から出現するオルガノイドの外観に違いがある。暗号由来オルガノイドは、明確に定義された境界を持つ球状の構造として一晩現れる。絨毛から始まったオルガノイドの運動学的および形態学的外観を調べ、最初は不規則な形で見え、顕微鏡下で見られるまでに2〜5日かかる。2つの異なる絨毛からのオルガノイド開始が示されている。オルガノイド形成電位を有する絨毛は、おそらく基礎となる間質の保持のために、緻密に見える。ヴィラからのオルガノイド開始は、絨毛の1つから2日目に明らかです。他のヴィラにいる間、オルガノイドは4日目に現れます。絨毛を収穫し、得られたオルガノイドを成長させるときには、暗号汚染を避けるために適切な措置を講じる必要があります。同じ変異体の暗号と絨毛から出現するオルガノイドとの間に生まれる有機体の間のフェノイドの違いは、この手順に従って観察されたので、両者の分子差を探すためにさらなる実験を行うことができる。このプロトコルは、分化解除から生じる内在性の暗号と異所性の納骨堂から生じるオルガノイドの違いを研究するために使用することができ、したがって、脱分化の影響に対処することができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、小さな腸の陰窩からヒトの腸を、手術組織と生検の両方から採取した結腸の陰窩からコロノイドを確立する方法を説明しています。この方法論の記事では、ヒトエンテロイドとコロノイドの成長と維持を成功させるために不可欠な培養モダリティを紹介します。...

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

ここでは、文化人間 enteroid または colonoid 単分子膜細胞および生化学的レベルでホスト上皮細菌相互作用を研究するそのままバリア機能を持つプロトコルを提案する.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。...

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

ここでは、腸管固有の相互作用のモデリングを可能にする2つのプロトコルを提示する。オルガノイド由来の腸単層および空気液体界面(ALI)培養は、光とバソララルの両方からアクセス可能な十分に分化された上皮の生成を促進する一方で、極性逆腸器官は彼らの極性側を露出させ、高スループットアッセイに適している。...

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

ここでは、凍結保存された上皮陰窩からブタ腸管3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルを記載する。また、3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜を確立し、上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にする方法についても説明します。...

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

マウス小腸陰窩を単離し、陰窩から腸3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルについて説明します。さらに、上皮下細胞ニッチの非存在下で単一の腸幹細胞からオルガノイドを生成する方法について述べる。...

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。...

ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

学ぶ マウス腸上皮ビリの3Dオルガノイド培養法。擦り取り法で間葉組織を保持し、脱分化細胞のオルガノイド形成能を解析します。腸再生と幹細胞生物学の理解に応用可能です。

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

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