Name: マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学ぶマウス初代肝細胞単離の効率的なプロトコル。C57BL/6J雌マウスを用いたペリスタルティックポンプとコラゲナーゼ・ディスペース培地による灌流法で、時間と労力を削減しつつ高収率を実現します。肝機能と糖代謝研究に有用です。

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この研究は、国立衛生研究所(Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)の支援を受けた。

すべての手順は、ジョンズホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス(8週齢)を本試験に使用した。
1. 準備:
<ol><li>ウィリアムのE培地(GlutaMAXサプリメント)を10%FBSおよび1%抗生物質 - 抗真菌溶液と混合して培養培地を作ります。</li>
	<li>25 mL のコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地(例えば、肝臓消化培地)を0.45 μmのシリンジフィルターを通してろ過し、粒子破片を除去する。</li>
	<li>50mLの二重蒸留H2O(ddH2O)、35mLの灌流培地(例えば、肝臓灌流培地)(または、このプロトコールを初めて使用した時点で50mL)、および濾過したコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地25mLを45°Cの水浴中で30分間温める。</li>
	<li>滅菌組織培養フード内で、2 mL の 10x HBSS と 18 mL のパーコールを 50 mL チューブに混ぜて 20 mL の 1x Percoll-HBSS を作り、氷上または 4 °C に保ちます。 注:1x Percoll-HBSSは、少なくとも6ヶ月間4°Cに保つことができます。</li>
	<li>滅菌組織培養フード内で、30mLの洗浄培地(例えば、肝細胞洗浄培地)を清潔なペトリ皿に注ぎ、氷上に保管する。</li>
	<li>ポンプ管を45°Cの水浴の水に浸す。結果は、室温が25°Cの場合に最も信頼性があります。</li>
	<li>225 μLのケタミンHCL、93.75 μLのキシラジン、および1x PBSの1681 μLを混合して、2 mLの1x麻酔薬を調製する。</li>
	<li>承認された方法を使用して1匹のマウスを麻酔する。ここで、マウスに150μLの1x麻酔薬を腹腔内注射した。つま先のつまみに対する反応などの反射神経の喪失の検査を行い、完全な麻酔を確実にします。</li>
	<li>マウスの背中を4本の手足で解剖パッドに固定し、防水テープを固定するか、または施設の動物愛護および使用委員会(または同等のもの)によって承認されたその他の方法を使用します。</li>
	<li>殺菌された鉗子とはさみを解剖のために準備する。汚染の可能性を避けるため、滅菌フード内ですべての手順を実行します。</li>
</ol>2. 手順:
<ol><li>ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップしたddH2Oを4mL/minの速度で5分間ポンピングを開始します。ポンプチューブを水からウォームアップした灌流培地に変更します。</li>
	<li>麻酔をかけたマウスの腹部を70%EtOHで消毒し、はさみで切り開いて肝臓、門脈、下大静脈(IVC)を露出させます。</li>
	<li>ペリスタルティックポンプを停止します。24 G カテーテル (例: クローズド IV カテーテル、24 G、0.75 IN) を IVC に挿入します。ポンピングを開始し、門脈を切断します。</li>
	<li>洗い流された液体が透明になるまで(約3〜5分)ポンピングを続けます。液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。IVCに気泡が入らないように注意してください。 注:このステップは、肝臓からできるだけ多くの血液を洗い流すことです。</li>
	<li>ポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼ-ディスパーゼ培地に変更する。ステップ 2.6 の実行中に、コラゲナーゼ - ディスパーゼ培地の 25 mL がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。</li>
	<li>液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。 注:この段階では、血液の完全な損失はマウスにとって致命的です。マウスの死は、実験後の心拍の欠如によって確認することができる。施設のポリシーに従って死体を処分してください。</li>
	<li>胆嚢なしで肝臓全体を氷上のペトリ皿の30mL洗浄培地に隔離する。</li>
	<li>鉗子でそれを細かく引き裂き、原発性肝細胞を溶液中に放出する。このステップは、洗浄培地を、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片でいっぱいの濁った溶液に変えるであろう。</li>
	<li>ステップ 2.8 で白濁した溶液を 70 μm のセルストレーナーを通して、氷上の 50 mL チューブ内の 20 mL 1x Percoll-HBSS にろ過します。チューブを20回反転させて混合する。</li>
	<li>300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。</li>
	<li>組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを冷たい30mLの洗浄媒体で洗浄する。</li>
	<li>50 x g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を除去し、ペレットを組織培養フード内の25mLの培養液(または適切な他の容量)に再懸濁する。</li>
	<li>細胞数をカウントし、実験計画に従って所望の培養プレート上に細胞をプレートする。 注:8週齢のマウス1匹から適切に単離された初代肝細胞は、通常、4枚の6ウェルプレートまたは4枚の12ウェルプレートに播種するのに十分である。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

様々な初代肝細胞単離プロトコルが開発されている。また、さまざまなニーズに基づいて最適化および適応されています(表1)。単離プロトコルは、一般に、灌流(酵素消化を含む)および精製の2つの部分からなる。
灌流は、インビボ2、20、21、22、23で肝臓全体に対して、または解剖された肝葉24を用いて行うことができる。解剖された葉の灌流は、技術的容易さのために一般に左葉および中葉に限定されていた。理論的には、インビボ灌流は、すべての葉を有する肝臓全体の使用のために、より多くの初代肝細胞を生じるはずである。灌流中に肝臓を所定の位置に保つことは、イ...

肝臓は、食物消化、血液循環、解毒などの多数の生命維持機能において重要な役割を果たしているため、脊椎動物の体内で最も重要な器官の1つとして機能します。 体外培養における マウス初代肝細胞の使用は、炭水化物代謝および肝癌の研究においてますます人気が高まっている。したがって、マウス原発性肝細胞を先天的な生理機能を維持したまま単離するための簡便な方法を開発することが重要である。糖代謝のハブとして機能するため、肝臓はグルコース産生および貯蔵の中心でもある1。 インビトロでの 初代肝細胞を用いた実験は、ほとんどのグルコース代謝研究にとって必須である。したがって、長年にわたり、様々な研究グループがマウス原発性肝細胞単離のためのプロトコルを開発してきた。
マウス肝細胞単離の一般的な手順は、まずリン酸緩衝生理食塩水(PBS)やハンクス平衡塩溶液(HBSS)などの等月間性液体で肝臓の血液を洗い流し、次にコラゲナーゼ含有溶液を使用して肝細胞を解離させることである。これらのプロトコルは一般的な手順を共有しますが、異なるニーズに基づいて試薬と手順が異なります。しかし、必要な試薬の準備や単離工程の実行には時間がかかります。現在のプロトコルの開発では、効率を優先事項として設定し、すべての試薬をすぐに使用でき、市場から入手でき、できるだけ少ないステップで設定しました。このプロトコールの全体的な目標は、単離された初代肝細胞の純度および生存率を危険にさらすことなく、マウスから初代肝細胞を単離するための迅速かつ労働効率の高い方法を提供することである。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>コーティング不要</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>コーティング不要</td></tr><tr><td>抗AKT</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x), 安定化</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>抗 FOXO1</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>抗 p-AKT (S473)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>抗 PEPCK</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>抗 p-FOXO1 (S256)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー、70&マイクロ;m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>クローズドIVカテーテル、24ゲージ 0.75 IN</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、グルコース、グルタミン、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChromグルコースアッセイキット</td><td>BioAssay Systems</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG二次抗体</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG二次抗体</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash Medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Cell Signaling</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lilly</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCL (100 mg/mL)</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>組織培養フード内で50 mLチューブにそれぞれ25 mLに分注し、-20°Cに保ちます。C冷凍庫</td></tr><tr><td>肝臓灌流 ミディアム</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>ペン 連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>4 mL/分でポンピング可能</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーブランド</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td>は、50 mLチューブを4°Cで遠心分離できます。C</td></tr><tr><td>ナトリウム L-乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、PVDF 0.45 &micro;m 直径 30mm</td><td>CELLTREAT</td><td>229745</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、0.5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、60 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution、0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>水バスタンク</td><td>コーニング</td><td>CLS6783</td><td>または、最大45°Cまで加熱できる任意のウォーターバスタンク。C</td></tr><tr><td>ウィリアムs E Medium (GlutaMAX Supplement)</td><td>Gibco</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>キシロジン (100 mg/mL)</td><td>Vetone Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

初代肝細胞は、 インビトロ での肝臓研究、特に糖代謝研究において広く使用されている。基本技術は、時間、労力、コスト、原発性肝細胞の使用などのさまざまなニーズに基づいて適応されており、その結果、さまざまな初代肝細胞分離プロトコルが実現しています。しかしながら、初代肝細胞単離における多数のステップおよび時間のかかる試薬調製は、効率にとって大きな欠点である。それぞれの長所と短所について異なるプロトコルを比較した後、それぞれの利点が組み合わされ、迅速かつ効率的な初代肝細胞単離プロトコルが処方された。 わずか35分以内に、このプロトコルは、他のプロトコルと同じくらい、またはそれ以上ではないにしても、健康な初代肝細胞を産出する可能性があります。さらに、単離された初代肝細胞を用いて実施された糖代謝実験は、 in vitro 肝代謝研究におけるこのプロトコールの有用性を検証した。また、将来の研究者がニーズに基づいてこのプロトコルをさらに最適化できるように、この研究の各ステップの重要性と目的を広範囲にレビューおよび分析しました。

効率を試験するために、本原発性肝細胞単離プロトコールを8週齢の雌性C57BL/6マウスに対して実施した。単離された初代肝細胞の付着および純度を試験した。初代肝細胞単離は、肝薬物効果および糖代謝、医薬バイオマーカー活性2、インスリン感受性、およびグルコース産生などの肝臓生理機能に関する多種多様な実験に使用される。したがって、このプロトコールで単離された初代肝細胞の活性を、以下の実験において試験した。
本プロトコールにおける初代肝細胞付着にはコーティングは必要とされなかった 単離した初代肝細胞を、6ウェルプレート上に5 x105細胞/ウェルで播種した。1時間後、しっかりとした付着が観察され、初代肝細胞は播種後12時間で完全に膨張した(図3)。このことは、めっきの12時間後、細胞が実験に利用される準備ができていることを示した。肝臓内のマウス肝細胞の核形態に基づいて、単核球肝細胞は境界で濃縮されたが、末端分化のシグネチャー...

初代肝細胞は、 インビトロで肝臓応答および代謝を研究するための貴重なツールである。市販の試薬を利用して、マウス初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコールが開発された。

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

マウス初代肝細胞は肝臓研究において重要である。特に糖代謝、および肝薬物検査のために。時間的には、分離プロセスには時間がかかり、エネルギーにはコストがかかる可能性があります。このプロトコルは、マウス初代肝細胞を単離するための効率的な方法を提供することができる。時間と労力にやさしいです。市販されているすべての地域で非常に少数のステップを必要とします。まず、ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップした二重蒸留水を毎分4mLの速度で5分間ポンプで汲み上げ始めます。その後、ポンピングチューブを水からウォームアップ灌流培地に変更します。水と灌流培地との間の気泡を監視する。システムを通る灌流媒体の流れを追跡するのに役立ちます。次に麻酔をかけ8週齢のC57黒色6Jメスマウスの腹部を70%エタノールで消毒する。そしてはさみを使って腹部を切り開き、肝臓、門脈、下大静脈を露出させます。その後、ペリスタルティックポンプを停止します。ポンピングチューブに水ではなく灌流媒体が含まれていることを確認した後。下大静脈に24ゲージのカテーテルを挿入します。ポンプの電源を入れ直し、門脈を切断します。灌流培地がポンプで送られている間、液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。約3〜5分間、または洗い流された液体が透明になるまでポンプで汲み上げ続けます。次にポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼディスパーゼ培地に変更する。そして、液体が肝臓の隅々まで届くように、毎分門脈を押します。25mLのコラゲナーゼディスパーゼ培地がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。次に、胆嚢なしで肝臓全体を単離する。これを氷上のシャーレに入れた30mLの洗浄培地に入れた。鉗子を使用して肝臓を細かく引き裂き、初代肝細胞を溶液中に放出する。この段階で、洗浄培地は、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片を含む白濁した溶液に変わる。この白濁した溶液を 70 ミクロンのセル ストレーナーでろ過し、氷上の 50 mL チューブ内のコールあたり 1 倍の 1 倍の HBSS 20 mL に入れます。チューブを20回反転させて溶液を混合する。次に溶液を遠心分離する。次いで、組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを30mLの冷洗浄媒体で洗浄した。遠心分離で細胞をもう一度ペレット化する。上清を除去し、ペレットを25mLの培養液に再懸濁した。細胞を数え、所望の培養プレートにそれらをプレート化する。実験計画による。プレーティング後、単離された初代肝細胞は1時間で強固に付着し、12時間後に完全に増殖した。単離された肝細胞において、トランスサイレチン、CD95、ASGR1、およびASGR2などの肝細胞マーカーのmRNAレベルは、肝臓全体と比較して有意に増加した。対照的に、免疫細胞、星状細胞、および内皮細胞の存在は低かった。CD45の急激な減少によって証明されるように、コラーゲン1型α1、および内皮細胞2キナーゼ2mRNAレベル。このプロトコルが他の肝細胞からの干渉を大幅に低減できることを示唆する。めっき後、ASGR1およびASGR2レベルは時間とともに減少したが、12時間の時点まで肝臓全体に匹敵するままである。特にASGR1の場合。膜結合CD81の発現レベルは、最大48時間一貫していた。対照的に、toll様受容体4発現は一般に増加し、48時間後にインビボレベルよりも高くなった。インスリン感受性アッセイは、インスリンがセリン473における両方のAKTのリン酸化を有意に促進することを実証した。フォークヘッドボックス01をセリン256にて、肝細胞とする。インスリンに対する初代肝細胞の感受性を示す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質レベルは、グルカゴン処理後に有意に増加した。グルコース産生経路が活性化されたことを示唆する。この活性化は、グルコース産生の増加によってさらに確認された。そして、フォルスコリン+ IBMXのような他のグルコース産生刺激剤と.このプロトコルは、マウス初代肝細胞を用いた研究のための時間とエネルギーの両方を節約することができる。このプロトコールに従って、仮説的なグルコース代謝および医薬バイオマーカーアッセイなどの関連実験を行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。...

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV...

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

ここでは、健康で機能的なプライマリ...

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。...

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

このプロトコルは、特別な静脈内カテーテル、標準化された滅菌使い捨てチューブ、リアルタイムモニタリングによって補完される温度制御、および単離された初代ラット肝細胞の生存率、収量、および機能性の一貫性を改善するための2段階コラゲナーゼ灌流手順のための警報システムの使用を詳述する。...

多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、...

単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

このプロトコルは、初代マウス肝細胞を肝臓から単離し、CRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質およびmRNAとしてエレクトロポレーションして、肝臓の遺伝性代謝疾患に関連する治療標的遺伝子を破壊する技術について記載している。記載された方法は、エレクトロポレーション後に高い生存率および高レベルの遺伝子改変をもたらす。...

新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達

脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。...

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶマウス初代肝細胞単離の効率的なプロトコル。C57BL/6J雌マウスを用いたペリスタルティックポンプとコラゲナーゼ・ディスペース培地による灌流法で、時間と労力を削減しつつ高収率を実現します。肝機能と糖代謝研究に有用です。

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

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