マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善
October 25th, 2021
初代肝細胞は、 インビトロで肝臓応答および代謝を研究するための貴重なツールである。市販の試薬を利用して、マウス初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコールが開発された。
マウス初代肝細胞は肝臓研究において重要である。特に糖代謝、および肝薬物検査のために。時間的には、分離プロセスには時間がかかり、エネルギーにはコストがかかる可能性があります。
このプロトコルは、マウス初代肝細胞を単離するための効率的な方法を提供することができる。時間と労力にやさしいです。市販されているすべての地域で非常に少数のステップを必要とします。
まず、ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップした二重蒸留水を毎分4mLの速度で5分間ポンプで汲み上げ始めます。その後、ポンピングチューブを水からウォームアップ灌流培地に変更します。水と灌流培地との間の気泡を監視する。
システムを通る灌流媒体の流れを追跡するのに役立ちます。次に麻酔をかけ8週齢のC57黒色6Jメスマウスの腹部を70%エタノールで消毒する。そしてはさみを使って腹部を切り開き、肝臓、門脈、下大静脈を露出させます。
その後、ペリスタルティックポンプを停止します。ポンピングチューブに水ではなく灌流媒体が含まれていることを確認した後。下大静脈に24ゲージのカテーテルを挿入します。
ポンプの電源を入れ直し、門脈を切断します。灌流培地がポンプで送られている間、液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。約3〜5分間、または洗い流された液体が透明になるまでポンプで汲み上げ続けます。
次にポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼディスパーゼ培地に変更する。そして、液体が肝臓の隅々まで届くように、毎分門脈を押します。25mLのコラゲナーゼディスパーゼ培地がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。
次に、胆嚢なしで肝臓全体を単離する。これを氷上のシャーレに入れた30mLの洗浄培地に入れた。鉗子を使用して肝臓を細かく引き裂き、初代肝細胞を溶液中に放出する。
この段階で、洗浄培地は、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片を含む白濁した溶液に変わる。この白濁した溶液を 70 ミクロンのセル ストレーナーでろ過し、氷上の 50 mL チューブ内のコールあたり 1 倍の 1 倍の HBSS 20 mL に入れます。チューブを20回反転させて溶液を混合する。
次に溶液を遠心分離する。次いで、組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを30mLの冷洗浄媒体で洗浄した。
遠心分離で細胞をもう一度ペレット化する。上清を除去し、ペレットを25mLの培養液に再懸濁した。細胞を数え、所望の培養プレートにそれらをプレート化する。
実験計画による。プレーティング後、単離された初代肝細胞は1時間で強固に付着し、12時間後に完全に増殖した。単離された肝細胞において、トランスサイレチン、CD95、ASGR1、およびASGR2などの肝細胞マーカーのmRNAレベルは、肝臓全体と比較して有意に増加した。
対照的に、免疫細胞、星状細胞、および内皮細胞の存在は低かった。CD45の急激な減少によって証明されるように、コラーゲン1型α1、および内皮細胞2キナーゼ2mRNAレベル。このプロトコルが他の肝細胞からの干渉を大幅に低減できることを示唆する。
めっき後、ASGR1およびASGR2レベルは時間とともに減少したが、12時間の時点まで肝臓全体に匹敵するままである。特にASGR1の場合。膜結合CD81の発現レベルは、最大48時間一貫していた。
対照的に、toll様受容体4発現は一般に増加し、48時間後にインビボレベルよりも高くなった。インスリン感受性アッセイは、インスリンがセリン473における両方のAKTのリン酸化を有意に促進することを実証した。フォークヘッドボックス01をセリン256にて、肝細胞とする。
インスリンに対する初代肝細胞の感受性を示す。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質レベルは、グルカゴン処理後に有意に増加した。グルコース産生経路が活性化されたことを示唆する。
この活性化は、グルコース産生の増加によってさらに確認された。そして、フォルスコリン+ IBMXのような他のグルコース産生刺激剤と.このプロトコルは、マウス初代肝細胞を用いた研究のための時間とエネルギーの両方を節約することができる。
このプロトコールに従って、仮説的なグルコース代謝および医薬バイオマーカーアッセイなどの関連実験を行うことができる。
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概要
この研究は、肝機能と代謝の研究に不可欠なマウスの初代肝細胞を単離するための労働時間と労力を効率的にするプロトコルを提示します。この方法は、非実質細胞からの干渉を最小限に抑え、収率を高めるために市販の試薬を利用しています。
主要な研究構成要素
研究領域
- 肝代謝
- グルコース代謝
- 薬物試験
背景
- マウスの初代肝細胞は肝生物学の研究に不可欠です。
- 従来の単離方法は時間がかかり、労働集約的です。
- 単離時間を短縮することで、より効率的な生物学的実験が可能になります。
使用した方法
- 蠕動ポンプとコラーゲナーゼ・ディスペイズ培地を使用した単離プロトコル。
- マウスモデル: C57BL/6J 雌マウス。
- 細胞培養と遺伝子発現測定の技術。
主要な結果
- 全肝臓と比較して肝細胞マーカーのmRNAレベルが上昇しました。
- 単離後の免疫細胞と内皮細胞の存在が減少しました。
- インスリン感受性と活性化されたグルコース産生経路を示しました。
結論
- このプロトコルは初代肝細胞の単離効率を大幅に向上させます。
- 肝研究におけるグルコース代謝と薬物反応の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary hepatocytes is critical for liver metabolism and drug testing studies, where time and labor constraints impact throughput in discovery workflows. This protocol reduces isolation time to ~35 minutes while maintaining hepatocyte yield and purity, supporting rapid hypothesis testing in preclinical models. The method enables scalable preparation of disease-relevant systems for mechanistic de-risking in target validation and lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides purified hepatocytes for interrogating therapeutic hypotheses in glucose metabolism and hepatic drug response pathways.
- Operational Value: Reduces time and labor burden, enabling higher throughput in target validation assays.
- Predictive Value: Yields hepatocytes with demonstrated insulin sensitivity and gluconeogenesis activation, supporting mechanistic de-risking of liver targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hepatocytes with low non-parenchymal cell interference, improving assay specificity for compound screening.
- Operational Value: Uses commercially available reagents and standardized steps, enhancing reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems suitable for high-content or phenotypic screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems for preclinical validation of liver-targeted compounds.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates hepatocytes with validated glucose production and insulin response, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Maintains hepatocyte marker expression (ASGR1, ASGR2, CD81) for up to 12 hours, enabling biomarker-assay compatibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, providing a reliable source of primary hepatocytes for liver metabolism assays.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of hepatic pathways by delivering hepatocytes with confirmed marker expression and functional responses.
- Screening: Produces hepatocytes suitable for compound evaluation due to reduced stromal cell contamination and consistent insulin sensitivity.
- Analytics: Supports quantitative readouts such as glucose production, phosphorylation assays, and mRNA expression of hepatocyte markers.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by providing hepatocytes that maintain key metabolic functions for up to 48 hours.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that standardizes hepatocyte preparation across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver metabolism studies through reduced cellular interference and functional validation.
- Operational Value: Streamlines workflow with minimal steps and commercially available reagents, improving lab efficiency.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by reducing isolation time from hours to ~35 minutes, increasing assay frequency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of liver targets by providing reliable preclinical models for mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and perfusion techniques.
- Depends on access to a peristaltic pump and sterile tissue culture environment.
- Necessitates standardized reagent preparation (perfusion medium, collagenase dispase, wash and culture media).
- Involves adaptation considerations for different mouse strains or ages beyond the C57BL/6J female model used.
- Limited by the need for immediate use of isolated hepatocytes to maintain functional integrity, as marker expression declines after 12 hours.
