Name: 生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶスポット変異蛍光相関分光法（svFCS）による生細胞原形質膜の分子拡散測定法。コレステロールが脂質ラフトナノドメイン構造に与える影響を解析し、細胞膜組織の理解に役立つ非侵襲的技術です。

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SB、SM、DMは、CNRS、インサーム、エクス・マルセイユ大学からの機関資金と、フランス国立研究庁(ANR-17-CE15-0032-01およびANR-18-CE15-0021-02)およびフランスの「Investissement d'Avenir」(ANR-10-INBS-04 France-BioImaging、ANR-11-LABX-054 labex INFORM)からのプログラム助成金によって支援されました。KWは、バイオテクノロジーとナノテクノロジーの分野における学際的な環境博士課程研究のプログラムである「BioTechNan」を認識しています。EBは、プロジェクト番号2016/21/D/NZ1/00285に基づくポーランド国立科学センター(NCN)、ならびにフランス政府および在ポーランドフランス大使館の財政的支援を認める。MŁは、ポーランド開発省(CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19)および国立研究開発センター(Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17)からの財政的支援を認めています。TT は、プロジェクト番号 2016/21/B/NZ3/00343 に基づくポーランド国立科学センター (NCN) およびヴロツワフ バイオテクノロジー センター (KNOW) からの財政的支援を認めています。

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著者らには開示するものは何もありません。

ここでは、標準的な蛍光顕微鏡へのsvFCSモジュールの実装、FCS拡散法則解析のおかげで生細胞中の原形質膜組織のダイナミクスを解読するための強力な実験的アプローチについて説明しました。概念的には、svFCSは、照明領域23のサイズを変化させながら時間領域における蛍光の相関測定という単純な原理に基づいている。この戦略は、顕微鏡測定からナノスコピック情報を推論するのに役立っており、定常状態25および生理学的プロセス30、31、32、33における原形質膜組織に寄与する主な物理化学的要素を解読するのに役立つ。全体として、これらのsvFCS分析は、様々な細胞型における脂質依存性ナノドメインの存在と、異なるシグナル伝達事象の同調におけるそれらの直接的な意味合いを明確に実証している。
このフレームワーク内では、光子収差を最適化し、光収差を最小限に抑えるためにsvFCSセットアップを構築する際に考慮する必要がある光学的側面がいくつかあります。したがって、svFCS測定を行う際にチューブレンズを取り外すことができる顕微鏡を使用することをお勧めします。さらに、単一の虹彩がsvFCSセットアップにおいて重要な役割を果たします:それは対物レンズの後方開口部でのビームサイズを変えるので、効果的なウエストサイズ(すなわち、有効励起量)を直接変化させます。ビーム直径は、最小のウエストサイズ34を得るために、客観的な背中の瞳孔に収まるべきである。このオプションは、ウエストサイズの調整に役立ち、光子バジェットの最適化を保証し、実装が簡単です。最後に、光路に沿って最小限の数の光学部品が使用されます。系が複雑でないほど、失われる光子は少なくなります。これらのオプションはすべて、svFCS 実験の堅牢性を大幅に向上させます。
プロトコル自体に関しては、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。最も重要なのは、svFCS測定を成功させるために不可欠な光路の適切なアライメントです(プロトコル、セクション2)。これは、300μWのレーザー照明下で約200kHzの2nM Rh6G溶液からの蛍光シグナルを分析することによって確認するのは簡単です。すべての虹彩を開く必要があり、ACFは重要な振幅(通常はG0〜1.5〜2.0)を持つ必要があります。もう1つの重要な点は、細胞とsvFCS分析のためのそれらの準備に関するものです(プロトコル、セクション4〜8)。それらの密度は、観察される単離された細胞が分析に利用できるように適合させなければならない。非接着細胞は、ポリ-L-リジン溶液を用いてチャンバー付きカバーガラス上に固定化されなければならない。細胞標識からの蛍光シグナルは強すぎてはならず、または適合が困難な非常に平坦なACFをもたらし、適合パラメータは重要な誤差を伴う。さらに、細胞内の非均質な標識および蛍光凝集体は、svFCS測定を解釈することを非常に困難にする。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理は細胞生存率に影響し、svFCS分析は治療後1時間を超えてはならない。また、上部原形質膜からの蛍光変動は支持体に付着していないため記録した方がよく、支持体との物理的相互作用による分子の拡散を妨げるおそれがない。
svFCS技術には、検出量を調整するためのモダリティの多様性により、さまざまなアプローチで使用するのに十分な進歩があり、生細胞におけるさまざまな生物学的プロセスを研究することが可能になりました。励起体積のサイズを調整する代替手段は、可変ビームエキスパンダ35を使用することである。また、z方向36に沿って原形質膜の切片からの蛍光シグナルを記録することにより照明領域の大きさを単純に変調することも可能である。これは、拡散則37,38を導出するための理論的枠組みが開発された標準的な共焦点顕微鏡上で行うことができる。
svFCS法は、原形質膜の不均質な側方組織の特性評価に必要な時空間分解能を提供するが、幾何学的閉じ込めモードは相互に排他的ではない。一方向または他の方向へのt0の偏差は、排他的に、支配的な閉じ込めモード25を明らかにする。さらに、本svFCS法の別の重要な限界は、古典的な光回折限界(〜200nm)から生じる。これは、細胞原形質膜内の分子を閉じ込めるドメインよりも疑いなく大きい。したがって、閉じ込めの分析は、拡散の法則から外挿されたt0値から推測される。
この欠点は、代替方法を実装することによって克服されています。当初、ナノアパーチャで穿孔された金属膜を使用して、非常に小さな膜領域(すなわち、75〜250nmの間で変化する半径の単一ナノメートルアパーチャの光学回折限界以下)を照らす可能性を提供しました39。単離ドメイン組織の理論的拡散法則から予測された遷移レジームがこのように報告され、ナノメートル膜の不均一性の特徴的なサイズの精緻化と脂質依存性ナノドメインが占める表面積の定量的推定を可能にした39。あるいは、近接場走査型光学顕微鏡40または平面光ナノアンテナ41を用いたナノメートル照明も開発されている。最近では、誘導放出枯渇(STED)とFCSを組み合わせることで、非常に高い空間分解能で拡散法則を文書化するための強力で敏感なツールが提供されました。このSTED-FCSは、短期間に起こるナノスケールの分子拡散特性へのアクセスを提供し、原形質膜における脂質プローブの動的組織化の研究を可能にする42,43。しかし、STEDプロセスにおける蛍光の不完全な抑制は、FCSにおける自己相関曲線の解析に課題を投げかけている。
この困難を克服するために新しいフィッティングモデルが開発され、拡散時間および平均分子数測定値44の精度が向上した。最後に、原形質膜での分子拡散が遅い場合、svFCS原理は、画像相関分光法45によって記録されたデータに適用することができる。最近、原子間力顕微鏡(AFM)とイメージング全反射FCS(ITIR-FCS)を組み合わせることで、ナノドメイン46の密度が高いため、原形質膜、特にパーコレーション閾値に近い膜構成で分子拡散を妨げるメカニズムの性質の微細化に寄与することが実証されている。
結論として、svFCSによる拡散法則の確立は、動的集団脂質と膜タンパク質の会合によって生じる局所的な不均一性を推測するための実験的証拠を提供してきた。Wohlandと同僚46が述べているように、「FCS拡散法則分析は、動的情報から解像度限界以下の構造的および組織的特徴を推測するための貴重なツールであり続ける」。それでも、原形質膜で起こる分子事象のダイナミクスをよりよく理解できるように、拡散法則の解釈を洗練させる新しいモデルを開発する必要があります。

原形質膜組織の複雑さ 細胞膜組織化の現在の理解は、いくつかの態様1を考慮に入れなければならない。第一に、複合脂質組成は、細胞タイプ間だけでなく、単一の細胞(膜小器官/原形質膜)内でも変化する。その上、関連するまたは内因性の膜タンパク質は、ほとんどが動的多量体複合体で組織化され、大きなドメインが膜の外側に伸びており、膜貫通ドメイン単独の領域よりも有意に広い領域を占める。さらに、膜関連タンパク質は、タンパク質機能を調節する役割を果たす特異的な脂質結合または脂質相互作用能力を示す。これらは、脂質2の局所組成およびアクセシビリティに直接依存する。
最後に、膜タンパク質の固有の不斉構造および脂質の分布のために、2つの膜小葉の間にかなりのレベルの非対称性が観察される。実際、合成と加水分解の間の脂質代謝バランスは、小葉間の脂質フリップフロップと組み合わされて、そのような不斉分布を生成する。二重層を横切る任意の輸送は、極性頭部群を膜の疎水性内部を通って移動させるのに必要な自由エネルギーによって制約されるので、通常は選択的トランスポーターによって支援される。細胞型ごとに、非対称性はしっかりと維持される傾向がある。全体として、これらの因子は、原形質膜の横方向の不均一性または区画化に寄与する3,4。
我々は、10分の1から数百ナノメートルおよびマイクロ秒から秒のスケールで動的横方向の不均一性に寄与する二重層内および二重層全体にわたる固有の分子拡散を考慮に入れることによって、原形質膜のこの表現を豊かにする。例えば、脂質依存性膜ナノドメイン(コレステロールとして定義されるいわゆる脂質いかだ、およびスフィンゴ脂質に富むシグナル伝達プラットフォーム)は、原形質膜の区画化に寄与する5,6。しかしながら、膜組織の現在の見解は、脂質ラフトのみに限定されない。膜ナノドメインは、組成、起源、および機能においてより複雑で不均一である。それでも、原形質膜におけるそれらの存在は緊密に配位されなければならず、タンパク質と脂質との間の動的相互作用は、膜ナノドメインの空間分布および化学修飾において重要であるようである1,3,7,8。
svFCSの原理と原形質膜の組織をプローブするためのその応用 膜ドメインの解析は、主に生物物理学的手法によって多くの進歩を遂げているが、原形質膜の局所組織を決定する決定要因は、適切な空間的および時間的分解能で洗練される必要がある。個々の分子の追跡に基づく決定要因は、優れた空間精度を提供し、異なる運動モード9,10,11,12の特性評価を可能にするが、古典的な低いカメラフレームレートでは時間分解能が限られており、かなりの数の軌道を記録するためにより多くの実験的努力を必要とする。あるいは、膜成分の拡散係数は、フォトブリーチング後の蛍光回収(FRAP)13または蛍光相関分光法(FCS)14によって評価することができる。後者は、主にその高感度および選択性、顕微鏡的検出体積、低侵襲性、および広いダイナミックレンジのために、より注目を集めている15。
FCSの概念的基礎は、約50年前にMagdeと同僚によって導入されました16,17.これは、蛍光発光のゆらぎを高い時間分解能(μsからsまで)で記録することに基づいています18。その現代版では、生細胞における測定は、関心領域内(例えば、原形質膜)内に位置する小さな共焦点励起体積(〜0.3フェムトリットル)によって行われる。観察体積に出入りする蛍光分子の拡散によって発生する蛍光シグナルは、非常に高い時間分解能(すなわち、検出器上の各光子の到達時間)で収集される。次に、信号を計算して自己相関関数(ACF)を生成し、そこから分子が焦点体積内にとどまる平均時間td(拡散時間)が抽出され、観察体積中に存在する平均粒子数(N)とともに、ACFの振幅に反比例する。この最後のパラメータは、観察体積内の分子濃度に関する有用な情報である可能性があります。
それ以来、バイオフォトニクスの機器が急速に発展し、生命系で起こる動的現象の記述を可能にするため、ますます多くのFCSモダリティが実装されています。それでも、分子種は拡散係数値のより重なり合う分布を経験するであろうが、これは通常、分子が時間19において非線形の関係で拡散する異常な拡散特性によって反映され、この異常な部分拡散の生物学的意味を特定することは困難である。過去には、この困難は、FRAPによる分子拡散を1つの領域からではなく、さまざまなサイズの領域から記録し、それによって追加の空間情報を提供することによっていくらか克服されてきました。これにより、例えば、膜マイクロドメイン20、21、22の概念化が可能となった。
この戦略のFCS測定への変換(すなわち、いわゆるスポット変動蛍光相関分光法(svFCS))は、観察の焦点体積のサイズを変化させることによって確立され、蛍光の変動を異なる空間スケールで記録することを可能にする23。したがって、svFCSアプローチは、研究された分子の分子拡散モードおよび膜分配のタイプ(単離されたドメイン対連続ドメイン24)の同定および決定を可能にする間接的な空間情報を提供する。この場合23,25の検出ビーム半径サイズに対応するウエスト(ω)値によって定義される様々な空間スケールの関数として拡散時間tdをプロットすることによって、所与の生理学的条件における所与の分子の拡散法則を特徴付けることができる。したがって、svFCSは、時間領域26における単一粒子追跡への完全な類似体である。ブラウン拡散制約の下では、拡散時間tdとウエストωとの間に厳密に線形の関係が期待されるべきである(図1)23,25。このスキームからの拡散法則の逸脱の起源は、細胞骨格メッシュワーク、分子クラウディング、ナノドメインにおける動的分割、またはこれらと他の効果の任意の組み合わせ(図1)などの非排他的な理由に起因する可能性があり、実験的にテストする必要があります25。
ここでは、ゼロから構築されたカスタムメイドのsvFCS光学系を日常的に使用するために必要なすべての制御チェックポイントを提供し、その実験的アプローチに関する以前のプロトコルレビュー27,28を補完します。また、概念実証として、脂質ラフトナノドメインに局在することが知られている原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質であるThy1-GFPのsvFCS拡散法則(DL)の確立のためのセットアップの較正、細胞の準備、データ取得、および解析に関するガイドラインを提供します29。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理による脂質ラフトナノドメインの部分的な不安定化がThy1-GFPの拡散特性にどのように影響するかを実証する。さらに、svFCS セットアップをゼロから構築する方法の詳細については、補足資料を参照してください。

<table><tbody><tr><td>SM1ねじ式リテーニングリング用</td><td>アリグメントツール</td>スパナレンチ <td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>アバランチフォトダイオードおよび単一光子計数モジュール(SPCM)</td><td>単一光子計数モジュール、アバランチフォトダイオード</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 & Omega; プラグ対50 &Omega; プラグリード 2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>同軸ケーブル415シンチコネクタ、RG-316、50、オメガ;コネクタ付き、1.22 m、RoHS2</td><td>RSコンポーネント</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>ティー50&オメガ;RFアダプターBNCプラグからBNCソケット0&rarr;1GHz</td><td>RSコンポーネント</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 m、8ソケットタイプE &ndash;フレンチエクステンションリード、230 V</td><td>RSコンポーネント</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td>マ<td>スコット、6 Wプラグイン電源 5 V dc 、 1.2 A 、1出力スイッチモード電源、タイプC</td><td>RSコンポーネント</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 リファレンスオシレータ電源ケーブル RFアダプタ</td><td>RSコンポーネント</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>蛍光フィルタリング</td><td>535/70 ETバンドパス、AOI 0&deg;彩度直径25 mm</td><td>AHF</td><td>フィルターF47-539</td></tr><tr><td></td><td>レーザービームスプリッターzt488 RDC、AOI 45&deg;クロマ 25.5 x 36 x 1</td><td>mm AHF フィルター</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC ロングパスフィルター、AOI 0&deg;彩度直径 25</td><td>AHF フィルター</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>ハードウェア相関器</td><td>80 MHz デジタル相関器</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>レーザー</td><td>レーザー LASOS LDM-XT ファイバー結合、488 nm、65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>レーザー安全</td><td>高性能ブラックマスキングテープ、1 インチ x 180 フィート (25 mm x 55 m) ロール</td><td>ソーラブ</td>ス <td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>レンズティッシュ、小冊子あたり25枚、小冊子5</td>枚 <td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>レーザー安全メガネ、ライトオレンジレンズ、可視光透過率48%</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス アクシオーバー 200M 電動倒立蛍光顕微鏡 ファインフォーカシングと粗いフォーカシング、リフレクタータレット回転、対物レンズノーズピース回転、カメラポートの切り替え、内部ライトシャッター</td><td>カールツァイス</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-アポクロマート 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>アダプター W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>ミドルリング W0.8 - W0.8 H "5"</td> <td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>光路</td><td>D25.4mm ミラー、保護シルバー</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm、F = 60.0.mm、可視アクロマー</td>トThorlabsAC254-060-A <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm、F = 35.0.mm、可視アクロマー</td>トThorlabsAC254-035-A <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>25 & マイクロ;m ピンホール</td>マウント <td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm マウント ゼロ、オーダー 1/2 波長板 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm 偏光ビームスプリッター キューブ 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>回転ステージ 56 mm x 26 mm ネジ式 ID</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm キネマティックプラットフォームマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>調整可能なプリズムクランプ</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>ビームブロック - アクティブエリア 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>アイリスダイヤフラム 1 mm 〜 25 mm 絞り</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>左利き用キネマティックシリンドリカルレンズマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>1 インチ光学ホルダー、M4 タップ</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1インチ スタッカブル レンズ チューブ</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>スタッカブル レンズ マウント 1インチ 光学使用可能な深さ &frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>1インチ光学使用可能深度用スタッカブルレンズマウント 2インチ</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>小型光学レール 600mm、メートル</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>小型光学レール 75mm、メートル</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>小型光学レール 150mm、メートル</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>レールキャリア、ざぐり穴 1 インチ x 1 インチ</td> <td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>レールキャリア、垂直ダブテール</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>高精度平行レンズ マウント 1 インチ</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12; " (12mm) ダブテール平行移動ステージ</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>レールクランプ</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>メートルXYZトランスレーションステージ(PT102を含む)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>ブラックゴム引き生地</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>ボールドライバーキット/ 6ツール</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>アダプター、外部M6 x 1.0スレッドおよび外部M4 x 0.7スレッド付き</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>取り付けベース、25 mm x 58 mm x 10 mm、5パック</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm光学用レンズマウント</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APCアダプター</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>キネマティックミラーマウント 1インチ光学</td>用 <td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>シリコンパワーヘッド、400-1100nm、50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mmポストホルダー、スプリング式六角ロック蝶ネジ、 L = 50 mm、5パック</td><td>Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>ポストホルダー、バネ付き六角ロック式つまみネジ、L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 50 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴、5 パック</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 75 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴、5 パック</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>USB電源およびエネルギーメーターインターフェース</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 30 mm ステンレス製光学ポスト、M4スタッド、 M6タップ穴</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 20 mm ステンレス製光学ポスト、M4 スタッド、 M6 タップ穴</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 mm 長い構造レール (検出ボックス)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>長さ350mmの構造レール(検出ボックス)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>クイックコーナーキューブ(25mmレール用</td>) <td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>直角ブラケット(25mmレール用</td>) <td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>黒のポスターボード 20インチ x 30インチ(508mm x 762mm)、厚さ1/16インチ(1.6mm)、厚さ</td>5枚 <td>Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>ヒンジ(25mmレールエンクロージャ用)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr>25mm<td></td><td>レールエンクロージャ用リッドストップ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 キャップスクリューキット</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 キャップスクリューキットおよびハードウェアキット</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>テーブルクランプ、L字型、5パック</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 リング作動式アイリスダイヤフラム (&Oslash;0.8 - &オスラッシュ;12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash;1 "SM1マウントすりガラスアライメントディスク、w/&Oslash;1 mm 穴</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>ハニカム光学テーブルトップ、Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>光学テーブルサポート、Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>サンプルナノポジショニング</td><td>精密 XYZ ナノポジショニング</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>デジタルマルチチャンネルピエゾ株式会社、3チャンネル、-30〜130 V サブDコネクタ、静電容量センサー、</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>温度チャンバー</td><td>ツァイス200M倒立顕微鏡インキュベーターシステムMATT BLK</td><td>デジタルピクセル</td><td></td></tr><tr><td></td><td>デュアルチャネルマイクロプロセッサ温度コントローラー</td>デジタル<td>ピクセル</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>2つの振動フリーヒーターモジュール</td><td>デジタルピクセル</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100温度センサー</td><td>デジタルピクセル</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>Biological試薬および材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養およびトランスフェクション</td><td>Cos7細胞</td><td>ATCC&reg;</td><td>CRL-1651&貿易;</td></tr><tr><td></td><td>8-well Lab-Tek</td>チャンバー <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>PBS buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Transfection Reagent</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>コレステロール含有量測定</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Phosphatase Inhibitorカクテル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI ナノクオンツ ワーキングソリューション</td><td>ロス</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax ディスカバー マイクロプレートリーダー</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS 測定</td><td>HBSS バッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>ヘペスバッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>コレステロールオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>ローダミン 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

原形質膜組織に関連するものを含む生細胞における動的な生物学的プロセスは、それぞれナノメートルからマイクロメートルおよびマイクロ秒から分の範囲の様々な空間的および時間的スケールで起こる。このような広範囲の生物学的プロセスは、従来の顕微鏡検査アプローチに挑戦する。ここでは、カスタマイズされた古典的な蛍光顕微鏡を使用してスポット変動蛍光相関分光法(svFCS)測定を実施する手順を詳述します。このプロトコルには、svFCSセットアップの特定の性能チェックと、生理学的条件下での生細胞の原形質膜上のsvFCSによる分子拡散測定のガイドラインが含まれています。さらに、コレステロールオキシダーゼ処理によって原形質膜ラフトナノドメインを破壊する手順を提供し、原形質膜の側方組織におけるこれらの変化がsvFCS分析によってどのように明らかにされるかを実証します。結論として、この蛍光ベースの方法は、適切な空間的および時間的分解能を有する原形質膜の側方組織に関する前例のない詳細を提供することができる。

我々は、Cos-7細胞で発現したThy1-GFPについてDLを生成した(図4、黒四角)。拡散法則は正のt0値(19.47ミリ秒±2ミリ秒)を有し、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造に閉じ込められていることを示す。Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理は、DL t0値を7.36±1.34ミリ秒にシフトさせた(図4、灰色の四角)。この観察は、Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインと関連していることを確認する。これら2つの拡散法則は、t0およびDeff値に関して、上述の統計的検定(ステップ9.1.3を参照)によれば異なることが示されている。さらに、我々は、COaseで処理された細胞に対する非処理Cos-7細胞における総細胞コレステロールの濃度を評価した。COase処理では、総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少が観察されます(図5)。この酵素は原形質膜の外側の小葉でアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するので、観察されたコレステロールの減少は原形質膜にのみ関連しており、脂質ラフトナノドメインの不安定化をもたらすと仮定する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> 図1:異なる形態の膜組織についてスポット変動FCSによって確立されたシミュレートされた蛍光相関分光法(FCS)拡散法則。 (上パネル)膜組織の模式的表現 - (A)自由拡散、(B)メッシュワークバリア、および(C)トラップ/ドメイン閉じ込め - 単一の分子(赤)の軌道を描画します。青い丸は腰ωの膜とレーザー光の交点を示す。(下パネル)FCS拡散法則は、拡散時間tdを半径ω2の2乗の関数としてプロットすることによって表される。拡散則投影(緑色の破線)は、自由拡散の場合に(A)原点(t0=0)において時間軸をインターセプトする。(B)メッシュワーク障壁がある場合の負軸(t0&lt;0)に、またはトラップおよびドメイン(脂質ラフト)がある場合の(C)正軸(t0&gt;0)に。D はブラウン運動の横方向拡散係数です。Deff、有効拡散係数;Dマイクロ、メッシュワークトラップ内の微視的な拡散係数;Dinは、ドメイン内部の拡散係数;Doutは、ドメイン外の拡散係数;L、正方形ドメインの側面のサイズ。rD は円形ドメインの半径です。この数字は、彼とマルゲ6から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> 図2:svFCSハードウェア制御の概略図 コンピュータは、シリアル(顕微鏡、外部シャッター)、USB(XYZ圧電ステージ、相関器)、PCI(アクイジションボード)のさまざまな通信プロトコルを介してすべてのデバイスを制御します。DAQ:データ集録ボード、APD:アバランシェフォトダイオード、SPCM:シングルフォトンカウンティングモジュール、DO:デジタル出力。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> 図3:svFCSセットアップの励起光路と発光光路の模式図 svFCSセットアップには、(1)ファイバ488nmレーザの出力がコリメートされ、(2)1/2波長板と偏光ビームスプリッタの組み合わせが光パワーを設定する、(3)チューブレンズフリー電動顕微鏡を通過した後にサンプルに集束されたレーザビーム、および(4)蛍光が単一のフォトンカウンティングモジュールに結合されたアバランシェフォトダイオードにコンフォカル状の検出経路を介して検出される、 これはハードウェア相関器に信号を配信します。シンプルさは、システムに感度、堅牢性、使いやすさを与えます( 補足資料で広くコメントされています)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> 図4:Cos-7で表されるThy1-GFPの拡散解析から生成されたsvFCS拡散法則。 処理なし(NT、黒四角)およびコレステロールオキシダーゼ処理後のCos-7細胞(COase、灰色の円)のsvFCS拡散法則。グラフの挿入は、提示された2つのsvFCS拡散法則の間の有意差の統計的検定を表す(Mailfert et al.28による)。テスト値(T)は、両方の拡散法則が異なる場合、3.8に設定されたしきい値を超える必要があります。高いほど、拡散法則の差は大きくなります。T の値は色分けされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> 図5:Cos-7細胞における総コレステロール含有量の比較。 Cos-7細胞を無処理(NT)または1U/mLのコレステロールオキシダーゼ(COase)で1時間処理した。データは、3 連の 1 つの実験の例を表しています。両側の不対応の t検定を使用して、統計的差を評価しました(α=0.05)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
材料の表: svFCS のセットアップに必要な光学素子のリスト。
補足資料: このドキュメントでは、svFCS セットアップをゼロから構築する方法について説明します。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

原形質膜の側方組織の現在の見方は不完全なままです。このため、スポット変動蛍光相関分光法などの新しい革新的な技術を実装することが重要です。これは、優れた時間と空間分解能を特徴とする非常に強力な手法です。さらに、非侵襲的であり、生理学的条件下で細胞膜を研究することを可能にします。実験を行う前に、毎日、すべての虹彩絞りを開き、パワーメーターを使用して、最初の虹彩を全開にしてレーザー出力を測定します。ハーフウェイプレートを回して、最大電力を見つけます。レーザー出力が通常より低い場合は、虹彩を使用して位置合わせを確認し、必要に応じてL1とM1を交互に動かします。次に、実験ノートの電力値をメモします。検出経路を確認するには、水、カバースリップ、および2ナノモルローダミン6G溶液の液滴を対物レンズに置きます。次に、相関器ソフトウェアを起動し、データを記録します。自己相関関数は、ノイズ量が少なく、廃棄物サイズが小さく、分子あたりのカウントレートが1秒あたり高いことを示す必要があります。スポットサイズを較正するには、細胞培養コード化カバースリップを水浸対物レンズに置き、200マイクロリットルの2ナノモルローダミン6G溶液をカバースリップに加えます。488ナノメートルのレーザービーム出力を300マイクロワットに調整し、ソフトウェアでsvFCS照明検出顕微鏡ポートを選択します。APDをオンにし、信号が下がるまで虹彩を開いて最小の廃棄物サイズを取得するか、またはより大きな廃棄物サイズのために虹彩を閉じます。約10、20秒の自己相関機能を記録して、統計の再現性を向上させ、APDをオフにします。適切なデータ解析プログラムで、分子凝集体による変動の大きいランを確認して破棄し、保持された自己相関関数の平均を3d拡散モデルでフィットし、フィッティングパラメータから平均拡散時間を抽出し、データをTXTファイルとして保存します。svFCS分析では、488ナノメートルのビームを2〜4マイクロワットの間で駆動し、サンプルを摂氏37度で10分間平衡化します。svFCS照明検出顕微鏡ポートとAPDを選択します。次に、選択したセルのXYスキャンとZスキャンを実行します。細胞の上部にある原形質膜を選択して、最大蛍光強度で共焦点スポットを特定し、データ取得を開始します。相関器ソフトウェアで、20 回 5 秒の実行を 1 回記録します。最後の実行後、APD をオフにし、示されているように予期しない実行を破棄します。平均自己相関関数を2種の2D拡散モデルでフィットし、フィットパラメータを以前に保存したTXTファイルに保存します。目的の細胞がすべて記録されたら、200〜400ナノメートルの間で変化する少なくとも4つの廃棄物サイズを分析して、単一の拡散法則を確立します。次に、MATLAB で、少なくとも 4 つの廃棄物サイズの実験に対応するすべての TXT ファイルを含むフォルダーを選択し、拡散時間と正方形の廃棄物をプロットします。この図では、Cos7細胞で発現するThy1-GFPの拡散法則を観察することができます。拡散法則は正の時間ゼロ値を持ち、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造内に閉じ込められていることを示しています。この解析では、Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理により、拡散法則の時間ゼロ値が7.36±1.34ミリ秒にシフトしました。Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインに関連していることを確認しました。総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少は、コレステロールオキシダーゼ治療時に観察されました。この酵素は、原形質膜の外側のリーフレットでアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するため、これらのデータは、観察されたコレステロールの減少が原形質膜にのみ関連し、脂質ラフトナノドメインの不安定化を引き起こすことを示唆しています。この手順を試みる際に最も重要なことは、svFCSシステムの適切なキャリブレーションと分析のための細胞の準備です。svFCSは、細胞膜の組織化を研究するための優れたツールです。しかし、細胞内分子の拡散の解析にも使用できます。この技術は、がん細胞などの生細胞に対する潜在的な薬物の影響を判断するために、生物医学にうまく実装できます。

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生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

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