生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

原形質膜の側方組織の現在の見方は不完全なままです。このため、スポット変動蛍光相関分光法などの新しい革新的な技術を実装することが重要です。これは、優れた時間と空間分解能を特徴とする非常に強力な手法です。

さらに、非侵襲的であり、生理学的条件下で細胞膜を研究することを可能にします。実験を行う前に、毎日、すべての虹彩絞りを開き、パワーメーターを使用して、最初の虹彩を全開にしてレーザー出力を測定します。ハーフウェイプレートを回して、最大電力を見つけます。

レーザー出力が通常より低い場合は、虹彩を使用して位置合わせを確認し、必要に応じてL1とM1を交互に動かします。次に、実験ノートの電力値をメモします。検出経路を確認するには、水、カバースリップ、および2ナノモルローダミン6G溶液の液滴を対物レンズに置きます。

次に、相関器ソフトウェアを起動し、データを記録します。自己相関関数は、ノイズ量が少なく、廃棄物サイズが小さく、分子あたりのカウントレートが1秒あたり高いことを示す必要があります。スポットサイズを較正するには、細胞培養コード化カバースリップを水浸対物レンズに置き、200マイクロリットルの2ナノモルローダミン6G溶液をカバースリップに加えます。

488ナノメートルのレーザービーム出力を300マイクロワットに調整し、ソフトウェアでsvFCS照明検出顕微鏡ポートを選択します。APDをオンにし、信号が下がるまで虹彩を開いて最小の廃棄物サイズを取得するか、またはより大きな廃棄物サイズのために虹彩を閉じます。約10、20秒の自己相関機能を記録して、統計の再現性を向上させ、APDをオフにします。

適切なデータ解析プログラムで、分子凝集体による変動の大きいランを確認して破棄し、保持された自己相関関数の平均を3d拡散モデルでフィットし、フィッティングパラメータから平均拡散時間を抽出し、データをTXTファイルとして保存します。svFCS分析では、488ナノメートルのビームを2〜4マイクロワットの間で駆動し、サンプルを摂氏37度で10分間平衡化します。svFCS照明検出顕微鏡ポートとAPDを選択します。

次に、選択したセルのXYスキャンとZスキャンを実行します。細胞の上部にある原形質膜を選択して、最大蛍光強度で共焦点スポットを特定し、データ取得を開始します。相関器ソフトウェアで、20 回 5 秒の実行を 1 回記録します。

最後の実行後、APD をオフにし、示されているように予期しない実行を破棄します。平均自己相関関数を2種の2D拡散モデルでフィットし、フィットパラメータを以前に保存したTXTファイルに保存します。目的の細胞がすべて記録されたら、200〜400ナノメートルの間で変化する少なくとも4つの廃棄物サイズを分析して、単一の拡散法則を確立します。

次に、MATLAB で、少なくとも 4 つの廃棄物サイズの実験に対応するすべての TXT ファイルを含むフォルダーを選択し、拡散時間と正方形の廃棄物をプロットします。この図では、Cos7細胞で発現するThy1-GFPの拡散法則を観察することができます。拡散法則は正の時間ゼロ値を持ち、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造内に閉じ込められていることを示しています。

この解析では、Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理により、拡散法則の時間ゼロ値が7.36±1.34ミリ秒にシフトしました。Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインに関連していることを確認しました。総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少は、コレステロールオキシダーゼ治療時に観察されました。

この酵素は、原形質膜の外側のリーフレットでアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するため、これらのデータは、観察されたコレステロールの減少が原形質膜にのみ関連し、脂質ラフトナノドメインの不安定化を引き起こすことを示唆しています。この手順を試みる際に最も重要なことは、svFCSシステムの適切なキャリブレーションと分析のための細胞の準備です。svFCSは、細胞膜の組織化を研究するための優れたツールです。

しかし、細胞内分子の拡散の解析にも使用できます。この技術は、がん細胞などの生細胞に対する潜在的な薬物の影響を判断するために、生物医学にうまく実装できます。