生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法
2020年11月12日
本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。
原形質膜の側方組織の現在の見方は不完全なままです。このため、スポット変動蛍光相関分光法などの新しい革新的な技術を実装することが重要です。これは、優れた時間と空間分解能を特徴とする非常に強力な手法です。
さらに、非侵襲的であり、生理学的条件下で細胞膜を研究することを可能にします。実験を行う前に、毎日、すべての虹彩絞りを開き、パワーメーターを使用して、最初の虹彩を全開にしてレーザー出力を測定します。ハーフウェイプレートを回して、最大電力を見つけます。
レーザー出力が通常より低い場合は、虹彩を使用して位置合わせを確認し、必要に応じてL1とM1を交互に動かします。次に、実験ノートの電力値をメモします。検出経路を確認するには、水、カバースリップ、および2ナノモルローダミン6G溶液の液滴を対物レンズに置きます。
次に、相関器ソフトウェアを起動し、データを記録します。自己相関関数は、ノイズ量が少なく、廃棄物サイズが小さく、分子あたりのカウントレートが1秒あたり高いことを示す必要があります。スポットサイズを較正するには、細胞培養コード化カバースリップを水浸対物レンズに置き、200マイクロリットルの2ナノモルローダミン6G溶液をカバースリップに加えます。
488ナノメートルのレーザービーム出力を300マイクロワットに調整し、ソフトウェアでsvFCS照明検出顕微鏡ポートを選択します。APDをオンにし、信号が下がるまで虹彩を開いて最小の廃棄物サイズを取得するか、またはより大きな廃棄物サイズのために虹彩を閉じます。約10、20秒の自己相関機能を記録して、統計の再現性を向上させ、APDをオフにします。
適切なデータ解析プログラムで、分子凝集体による変動の大きいランを確認して破棄し、保持された自己相関関数の平均を3d拡散モデルでフィットし、フィッティングパラメータから平均拡散時間を抽出し、データをTXTファイルとして保存します。svFCS分析では、488ナノメートルのビームを2〜4マイクロワットの間で駆動し、サンプルを摂氏37度で10分間平衡化します。svFCS照明検出顕微鏡ポートとAPDを選択します。
次に、選択したセルのXYスキャンとZスキャンを実行します。細胞の上部にある原形質膜を選択して、最大蛍光強度で共焦点スポットを特定し、データ取得を開始します。相関器ソフトウェアで、20 回 5 秒の実行を 1 回記録します。
最後の実行後、APD をオフにし、示されているように予期しない実行を破棄します。平均自己相関関数を2種の2D拡散モデルでフィットし、フィットパラメータを以前に保存したTXTファイルに保存します。目的の細胞がすべて記録されたら、200〜400ナノメートルの間で変化する少なくとも4つの廃棄物サイズを分析して、単一の拡散法則を確立します。
次に、MATLAB で、少なくとも 4 つの廃棄物サイズの実験に対応するすべての TXT ファイルを含むフォルダーを選択し、拡散時間と正方形の廃棄物をプロットします。この図では、Cos7細胞で発現するThy1-GFPの拡散法則を観察することができます。拡散法則は正の時間ゼロ値を持ち、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造内に閉じ込められていることを示しています。
この解析では、Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理により、拡散法則の時間ゼロ値が7.36±1.34ミリ秒にシフトしました。Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインに関連していることを確認しました。総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少は、コレステロールオキシダーゼ治療時に観察されました。
この酵素は、原形質膜の外側のリーフレットでアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するため、これらのデータは、観察されたコレステロールの減少が原形質膜にのみ関連し、脂質ラフトナノドメインの不安定化を引き起こすことを示唆しています。この手順を試みる際に最も重要なことは、svFCSシステムの適切なキャリブレーションと分析のための細胞の準備です。svFCSは、細胞膜の組織化を研究するための優れたツールです。
しかし、細胞内分子の拡散の解析にも使用できます。この技術は、がん細胞などの生細胞に対する潜在的な薬物の影響を判断するために、生物医学にうまく実装できます。
概要
本記事では、生細胞の細胞膜における分子拡散を測定するためのスポット変動蛍光相関分光法（svFCS）顕微鏡の構築プロトコルを紹介します。この手法は、非侵襲的でありながら、優れた時間分解能と空間分解能を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- プラズマ膜の側方組織化については、まだ完全には解明されていません。
- より深い知見を得るためには、svFCSのような革新的な技術が必要です。
- svFCSを用いることで、生理学的条件下での細胞膜の研究が可能になります。
- 正確な結果を得るためには、適切なキャリブレーションと細胞調製が不可欠です。
研究目的
- svFCS顕微鏡法のプロトコルを開発すること。
- 細胞膜における分子拡散を測定すること。
- 膜組織におけるコレステロールの影響を分析すること。
使用した手法
- ローダミン6G溶液を用いたsvFCSシステムの校正。
- 選択した細胞のXYおよびZスキャンによるデータ収集。
- MATLABを用いた拡散則の解析。
- コレステロール酸化酵素処理前後における拡散パラメータの比較。
主な結果
- Thy1-GFPの拡散はナノドメイン構造内に限定されている。
- コレステロール酸化酵素処理により、拡散則の時間ゼロ値がシフトする。
- 総コレステロール含有量の減少が観察された。
- 本研究は、コレステロールがリピドラフトの安定性に影響を与えることを示唆している。
結論
- svFCSは細胞膜の構成を研究するのに有効です。
- この手法は細胞内分子の拡散を解析することも可能です。
- 得られた知見は、生細胞に対する薬剤の効果を理解する上で重要な意味を持ちます。
よくある質問
産業界への適用性
スポット変動蛍光相関分光法（svFCS）は、生理学的条件下での細胞膜における分子拡散の高解像度解析を可能にし、膜の組織化やリピドラフトのダイナミクスに関する重要な知見を提供します。この機能は、膜結合タンパク質の生物物理学的背景を明らかにすることでターゲットバリデーションをサポートし、初期創薬におけるメカニズム的なリスク低減に寄与します。本手法の非侵襲的な性質と生存細胞への適合性は、前臨床スクリーニングやトランスレーショナルバイオマーカー研究における有用性を高めています。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索とターゲットバリデーション
- 科学的価値：ナノドメイン構造内におけるThy1-GFPなどの膜タンパク質の拡散挙動を定量化することで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：コレステロール依存的な閉じ込めを明らかにし、リピッドラフト結合の機能的検証を可能にします。
- 予測的価値：膜局在が脂質環境の摂動に敏感な標的を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：生理学的条件下でベースラインの拡散法則を確立することにより、化合物スクリーニングに向けたバリデーション済みの生物学的システムを準備します。
- 定量的出力：さまざまなビームウエストサイズにおいて再現性のある拡散時間の測定値を生成し、アッセイの標準化をサポートします。
- スクリーニングへの適用性：化合物によって誘発される拡散パラメータの変化を検出し、膜組織の変動やターゲットへの結合を示唆します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：脂質調節異常を伴う病理に関連する、細胞膜ラフトナノドメインの崩壊をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：環境摂動（例：コレステロール調節）がターゲットの挙動をどのように変化させるかを実証することで、初期探索での観察結果を前臨床検証へと結びつけます。
- リスク調整後の意思決定：膜摂動に対するターゲットの回復力に基づいた、go/no-go基準の判断材料となるメカニズムのリードアウトを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
svFCSは、ターゲットの仮説検証からリード化合物の同定、そして前臨床バリデーションに至る創薬の連続的なプロセスに適合し、生化学的および表現型アッセイを補完する生物物理学的な特性解析レイヤーを提供します。
- 発見生物学：拡散係数を測定し、拘束された分子集団と可動性のある分子集団を識別することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：rhodamine 6Gを用いた標準的なキャリブレーションと検出経路の完全性の検証により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析：自己相関関数のMATLAB解析を通じて定量的な拡散法則を提供し、異なる条件下での分子挙動の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：膜組織の変化を機能的転帰に結びつけ、拡散の変動が表現型反応と相関する場合にバイオマーカーの整合性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数のターゲットおよび細胞株にわたる膜タンパク質ダイナミクスを研究するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：形質膜におけるナノスケールの閉じ込めと拡散の不均一性を解明することで、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：標準化されたレーザー出力校正、検出パスの確認、および反復的な自己相関関数の平均化を通じて、再現性を確保する。
- 戦略的価値：生体に近い膜環境におけるターゲットの安定性を定量化することで、予期せぬ生物物理学的な問題による後期の脱落を減らし、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：適切な局在化と機能におけるリピッドラフトの完全性への依存度に基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の注意点
- 蛍光顕微鏡法、レーザー安全管理、および相関分光データ解析の専門知識が必要です。
- APD、コリレーターソフトウェア、および精密なレーザー出力制御（svFCS測定用に 2–4 µW）を備えたカスタマイズ済みの蛍光顕微鏡が必要です。
- 校正プロトコル（例：rhodamine 6G のスポットサイズの検証）およびデータ解析パイプライン（例：2D拡散モデルの MATLAB フィッティング）のチーム間での標準化が求められます。
- コレステロール酸化酵素以外のさまざまな膜タンパク質、細胞型、および摂動剤への適応に関する検討が含まれます。
- 分子凝集を回避し、37°C での平衡化中に生理学的妥当性を確保するための慎重な試料調製が必要であるという制約があります。
