Name: 重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ 重合・脱重合サイクルを用いたチューブリン精製法。培養細胞やマウス脳から翻訳後修飾を制御した組み込み活性を持つチューブリンを少量の手作業時間で効率的に調製し、微小管動態の研究に応用する。

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この研究は、ANR-10-IDEX-0001-0001-02、LabExセルンスケールANR-11-LBX-0038、コンバージェンス研究所Q-life Q-life QR-17-CONV-0005によって支えられました。CJはキュリー研究所によってサポートされています, フランス国立研究庁(ANR)は、ANR-12-BSV2-0007およびANR-17-CE13-0021、国立がん研究所(INCA)補助金2014-PL BIO-11-ICR-1を授与し、フォンダシオンはラ・レシェルシュ・メディカル(FRM)助成金DEQ20170366666666666666666666666年MMMはフォンダシオン・ヴァインクレ・アルツハイマー助成金FR-16055p、およびフランスのアルツハイマー付与AAP SM 2019 n°2023によって支えられている。JASは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第675737の下で欧州連合のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによって支援され、FRM助成金FDT201904008210。SB は FRM グラント FDT201805005465 によってサポートされました。
私たちは、ジャンケ研究所、特にJ.スープロン、G.ラキシック(MICALIS、アグロパリテック)とA.ゴートロー(エコールポリテクニック)のすべてのメンバーに、プロトコルの確立中に助けてくれてありがとう。私たちは、マウスの繁殖とケアの助けのためにキュリー研究所の動物施設に感謝したいと思います。
J.フランケルとM.ネルソンによって開発された抗体12G10は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行から取得され、アイオワ大学によって維持されました。

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<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Uchimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flipped+ion+pair+at+the+dynein-microtubule+interface+is+critical+for+dynein+motility+and+ATPase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).</li>
<li>Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structured+core+of+human+beta+tubulin+confers+isotype-specific+polymerization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties.</a> Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).</li>
<li>Vemu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+single-isoform+recombinant+neuronal+Human+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).</li>
<li>Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-tubulin+isotypes+can+regulate+microtubule+protofilament+number+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability.</a> Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).</li>
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<li>Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tubulin+tyrosination+and+CLIP-170+phosphorylation+regulate+the+initiation+of+dynein-driven+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons.</a> Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).</li>
<li>Guedes-Dias, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+responds+to+local+microtubule+dynamics+to+target+synaptic+cargo+delivery+to+the+presynapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse.</a> Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+dynamic+protein+interactions+involving+human+microtubules+using+solid-state+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 18(2020).</li>
<li>Even, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAT1-enriched+vesicles+promote+microtubule+acetylation+via+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport.</a> Science Advances. 5 (12), 2705(2019).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
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<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylase+enzymes+are+members+of+the+TTL+domain+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family.</a> Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).</li>
<li>Newton, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+slow+dynamic+instability+of+HeLa+cell+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).</li>
<li>Belvindrah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+alpha-tubulin+Tuba1a+leads+to+straighter+microtubules+and+perturbs+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration.</a> Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).</li>
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<li>Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal-specific+TUBB3+is+not+required+for+normal+neuronal+function+but+is+essential+for+timely+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration.</a> Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).</li>
<li>Morley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylated+tubulin+is+essential+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice.</a> Elife. 5, (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する方法は、細胞株および単一マウス脳から中量で高品質で組み立て能力の高いチューブリンを迅速に生成するプラットフォームを提供する。これは、長年の分野で使用される牛の脳からの尿細管浄化の金標準プロトコルに基づいています16,17.このアプローチの特に利点は、HeLa S3細胞の懸濁培養物の使用であり、一度確立されると、実践的な時間をほとんど必要とせずに大量の細胞を生み出す。これは、プロトコルは、任意の細胞生物学の研究室で比較的簡単に実行することができます, 他のチューブリン精製方法18,19,32,37特定の機器や専門知識を必要とし、したがって、タンパク質の浄化の強力な背景を持つ研究所によって主に使用されています.接着性細胞株から小量のチューブリンを製造する場合...

微小管は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。彼らは細胞に形状を与え、染色体分離のための大動脈および有糸性紡錘を構築し、細胞内輸送のトラックとして機能する。これらの多様な機能を実行するために、微小管はさまざまな方法で自分自身を整理します。この分野で興味深い質問の1つは、構造的および進化的に保存された微小管が、この多くの組織や機能に適応することを可能にする分子メカニズムを理解することです。潜在的なメカニズムの1つは、「管状コード1、2、3」と呼ばれる概念によって定義される微小管の多様化である。この管状には、αおよびβ-チューブリン遺伝子産物(チューブリンアイソタイプ)を微小管およびチューブリンの翻訳後修飾(PTM)に差動する2つの主要成分が含まれる。
1970年代以降、インビトロ再構成実験は、進化する光顕微鏡技術と組み合わせることで、微小管の特性に関する重要な発見への道を開いてきた:動的不安定性4とトレッドミリング5、およびその他のメカニズムおよび機能6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。これまでに行われたインビトロ実験のほとんどすべては、重合および脱重合16、17の繰り返しサイクルを用いて脳組織から精製されたチューブリンに基づいている。脳組織からの精製は、高品質のチューブリンを大量に得る利点(通常はグラム量)を与えるが、脳組織から精製されたチューブリンが異なるチューブリンアイソタイプの混合物であり、多くのチューブリンPTMで濃縮されるという1つの重要な欠点がある。この異種性は、微小管の特性および機能の制御における特定の管状PTMまたはアイソタイプの役割を表解することを不可能にする。したがって、管内管制御PTMと均質なアイソタイプ組成物を有するアセンブリ管管ビンの製造は、管状コードの分子機構に対処するために不可欠である。
近年、酵母Stu2pの微小チューブ結合TOG(腫瘍過剰発現遺伝子)ドメインを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるチューブリンの精製法が開発された。この方法では、細胞または組織の粗いライセート中のチューブリンは、マトリックス固定化TOGドメインに結合するカラムを通過し、非常に小さなサンプルであっても、与えられたチューブリンプール全体の分析を可能にする。近年、組換え尿細管を精製する待望のアプローチも記載されている。これは、バキュロウイルス系に基づいており、αおよびβ-チューブリン遺伝子を含むバイシストロニックベクターが昆虫細胞19に発現する。しかし、この方法は非常に煩雑で時間がかかるため、尿細管変異20およびチューブリンアイソタイプ21、22、23 in vitroの影響を研究するためにほとんど使用される。
現在のプロトコルでは、細胞株またはマウス脳組織24から異なるレベルの修飾を有するチューブリンを生成する青写真として、確立され広く使用されている重合脱重合アプローチを用いる方法を説明する。この手順では、チューブリンは可溶性(4°Cのチューブリンダイマー)と重合形態(グアノシン5'-三リン酸[GTP]の存在下で30°Cで微小管)との間で循環する。各形態は遠心分離の連続したステップによって分離される:管状のダイマーは、冷間(4°C)の回転後に上清に残り、微小管は30°Cでペレット化される。 さらに、1つの重合工程は、高ピペラジン-N,N-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)濃度で行われ、微小管から微小管関連タンパク質を除去し、したがって、最終的に精製されたチューブリンから行う。懸濁または付着培養物として増殖したHeLa S3細胞から精製されたチューブリンは、ほとんど全く全くチューブリンPTMを含まないものであり、最近のインビトロ再構成実験25、26、27、28で使用されている。さらに、単一マウス脳からチューブリンを精製する方法を適応させ、チューブリンアイソタイプおよびPTMの変化を伴う多数のマウスモデルに使用することができる。
プロトコルでは、まず、原料物質(細胞質量または脳組織)の生成、その分解(図1A)、次いでチューブリン重合および脱重合の連続したステップを記述して、チューブリンを精製する(図1B)。精製されたチューブリンの純度(図2A,B)と量(図3A,B)を評価するプロセスについてさらに説明します。この方法は、チューブリン精製前の細胞内で修飾酵素を過剰発現させることにより、選択したPTMを濃縮したチューブリンを製造するように適合させることができる(図4B)。あるいは、チューブリン修飾酵素は、精製プロセス中にチューブリンに添加することができる。最後に、対応するチューブリン修飾酵素に欠乏しているマウスの脳から特定のアイソタイプまたはPTMを欠いた管状またはPTMを欠いて、精製することができる(図4B)29。
ここで説明する方法には、(i)比較的短時間で十分に大量のチューブリンを生産でき、(ii)特定のチューブリンアイソタイプ組成物またはPTMのいずれかで高品質で純粋なチューブリンを生成するという2つの主な利点があります。この原稿の関連ビデオでは、この手順に関連する重要な手順のいくつかを強調しています。

<table><tbody><tr><td>1&nbsp;M MgCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L細胞培養容器</td><td>Techne F7610&nbsp;</td><td></td><td>スピナーカルチャーに使用されます。空のスピナーボトルをかき混ぜないでください。スピナーボトルが細胞培養インキュベーター内にある場合は、インキュベーターで培地の平衡化を促進するために、スピナーボトルの側弁を常にわずかに開いたままにしてください。の雰囲気。使用後は、ボトルの壁に残っているセルが乾燥しないように、スピナーボトルにすぐに水道水を入れてください。脱イオン水でボトルを洗い、アプリ200mlの脱イオン水とオートクレーブを加えます。無菌細胞培養フードの下で水を取り除き、ボトルをフードの下で数時間完全に乾かします。スピナーボトルの洗浄に洗剤を使用しないでください。</td></tr><tr><td>1.5mlおよび2mlチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14ml丸底チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直径15cmの滅菌培養皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mlスクリューキャップチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-メルカプトエタノールは有毒であり、ボンネットの下で使用する必要があります。</td></tr><tr><td>4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフッ化物&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#A8456</tr> アクリル<tr><td>アミド40%&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>5、10、20 mlシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml、10 ml、25 ml 滅菌ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml スクリューキャップチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Sigma</td> <td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗α-チューブリン抗体、12G10&nbsp;</td><td>J. Frankel と M. Nelson によって開発され、Developmental Studies Hybridoma Bank から入手され、NIC の後援の下で開発され、アイオワ</td><td></td>大学によって維持されています <td>希釈: 1/500</td></tr><tr><td>抗グルタミル化チューブリン抗体、GT335&nbsp;</td><td>アディポジェン&nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td>希釈<td>倍率:アプロチニン20,000分の1</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#A1153</tr><tr><td>天びん(0.1 &ndash; 10 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベックマン1-lポリプロピレンボトル&nbsp;</td><td></td><td></td><td>スピナー培養物の収集用</td></tr><tr><td>ベックマン アバンティ J-26 XP 遠心分離機</td><td></td><td></td><td>スピナー培養物の収集用</td></tr><tr><td>生物学的攪拌機&nbsp;</td><td>テクネ MCS-104L&nbsp;</td><td></td><td>細胞培養インキュベーター(スピナー培養用)に設置、Hela S3およびHEK 293細胞用に25 rpm</td></tr>で<tr><td>Bis N,N'-Methylene-Bis-アクリルアミド&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>ブレンダー イカ ウルトラトラックス&reg;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>脳組織の溶解には、5mmプローブを使用し、マシンを出力6または7に設定します。氷上で脳組織を2〜3回15秒間ブレンドします。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A7906</tr><tr><td>ブロモフェノールブルー&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>#1.08122</td><td></td></tr><tr><td>カルボキシペプチダーゼA(CPA)</td><td>Sigma</td> <td>#C9268</td><td>濃度:1.7&nbsp;U/&micro;l</td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーターは37°Cに設定。C、5%CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>&nbsp;シグマ&nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSOは、他の化合物の細胞透過性および皮膚透過性を高めることができます。接触を避け、皮膚と目の保護具を使用してください。</td></tr><tr><td>DMEMミディアム&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>DTT、DL-ジチオスレイトール&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#D9779</tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td> <td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#E3889</tr><tr><td>エタノール絶対&nbsp;</td><td>フィッシャーケミカル&nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#F7524 フランス製圧力セルプレス&nbsp;</td><td>サーモエレクトロンコーポレーション</td><td>&nbsp;#FA-078A</td><td>、#FA-032セル、大量の細胞を溶解します。中程度の比率で設定し、ゲージ圧は1,000 psi(ディスラプションチャンバー内の3,000 psiに相当)です。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>&nbsp;VWRケミカルズ&nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td> <td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#G8877</tr><tr><td>ヒーティングブロック&nbsp;</td><td>スチュアート&nbsp;</td><td></td><td></td>#SBH130D</tr><tr><td>Hela細胞&nbsp;</td><td></td><td>ATCC&reg;CCL-2&トレード;</td><td></td></tr><tr><td>Hela S3細胞&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg;CCL-2.2&トレード;</td><td></td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>VWR</td><td>#20252.290</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td></td><td></td><td>細胞トランスフェクションを検証する場合は蛍光で</td></tr><tr><td>イソプロパノール&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>ポリプラス&nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000ローター&nbsp;</td><td></td><td></td><td>スピナーカルチャーKOH</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>の収集に。<td>シグマ&nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOHは腐食性があり、火傷の原因となりますので、目や皮膚の保護具を使用してください。</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>50mlチューブ用実験室用遠心分離機</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン&nbsp;</td><td>シグマ</td> <td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropestles</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>マウス脳組織&nbsp;</td><td></td><td></td><td>この研究のための動物の世話と使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の推奨事項に従って行われました。実験手順は、キュリー研究所の倫理委員会によって特に承認されました CEEA-IC #118 (認可番号04395.03 国家当局によって与えられた) 国際ガイドラインに準拠して</td></tr>。<tr><td>針18G X 1 &frac12;&rdquo;(1.2 X 38</td>ミリメートル<td>テルモ</td> <td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>ニードル20G×1 &frac12;&rdquo;(0.9 X 38ミリメートル</td><td>テルモ</td> <td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>針21G×4 &frac34;&rdquo;(0.8×120ミリメートル</td><td>B.ブラウン</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td></td><td></td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>#P7626</td><td>PMSF粉末は危険です。PMSF溶液を調製する際には、皮膚と目の保護具を使用してください。</td></tr><tr><td>パイプ&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#P6757</tr><tr><td>ピペットボーイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローターベ</td><td>ックマン70.1Ti;TLA-100.3;TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE電気泳動装置&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td></td><td></td>#1658001FC</tr><tr><td>SDS、ドデシル硫酸ナトリウム&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#442444H</td><td>レンメリ緩衝液の準備用&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS、ドデシル硫酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>#L5750</td><td>「TUB」 SDS-PAGEゲル</td></tr><tr><td>ソニケーター&nbsp;</td><td>Branson</td><td>#101-148-070</td><td>接着培養物として増殖した細胞の溶解に使用。直径6.5mmのプローブを使用し、ソニケーターを「「出力制御」1、"デューティサイクル」10%と時間は使用する細胞の種類によって異なります。</td></tr><tr><td>1.5 mlチューブ用卓上遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED、N、N、N&prime;、N&prime;-テトラメチルエチレンジアミン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#9281</td><td></td></tr><tr><td>トリコスタチンA(TSA)</td><td>Sigma</td> <td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>#T9284</tr><tr><td>トリズマベース(トリス)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#T1503 トリプシン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>超遠心ローター&nbsp;</td><td></td><td>TLA-55、TLA-100.3、70.1 Tiローターは</td><td>4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC&nbsp;</td></tr><tr><td>超遠心チューブ&nbsp;</td><td>ベックマン</td><td>#357448&nbsp;</td><td>TLA-55ローターと併用する場合</td></tr><tr><td>超遠心チューブ&nbsp;</td><td>TLA-100.3ローター</td>超遠心チューブで使用するための<td>Beckman</td><td>#349622</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ベックマン</td><td>#355631&nbsp;</td><td>70.1 Tiローターと併用</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Optima L80-XP(または同等品)およびOptima MAX-XP(または同等品)</td><td>を4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC&nbsp;</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローターまたはチューブホルダー</td><td></td><td></td>を装備したウォーターバス <td>30°Cに設定。C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

微小管細胞骨格の研究の重要な側面の1つは、インビトロ再構成実験における微小管挙動の研究である。これらは、ダイナミクスなどの微小管の本質的な特性と、微小管関連タンパク質(MAPs)との相互作用を分析することを可能にする。「チューブリンコード」は、微小管の特性および機能の調節因子として、異なるチューブのアイソタイプおよび様々な翻訳後修飾(PTM)を指し示す新しい概念である。チューブリンコードの分子機構を調べるには、特定のアイソタイプとPTMを用いた精製チューブリンを用いたインビトロ再構成実験を行うことが重要です。
現在までに、これはインビトロ実験で広く使用されている脳管状突管として技術的に困難であり、多くのPTMを抱え、定義されたアイソタイプ組成を有する。そこで、重合と非重合サイクルの古典的アプローチを用いて、異なる供給源から、異なるアイソタイプ組成および制御PTMを用いてチューブリンを精製するこのプロトコルを開発しました。アフィニティ精製に基づく既存の方法と比較して、このアプローチは、純粋で重合能力のある管状尿管を生成し、重合または脱重合に耐性のあるチューブリンが連続した精製工程中に廃棄されるようにする。
懸濁液または付着培養物として、そして単一マウスの脳から成長した細胞株からのチューブリンの精製について述べた。この方法は、まず、懸濁および付着性の両方の設定における細胞塊の生成、リシス工程、続いて重合脱重合サイクルによるチューブリン精製の連続段階について説明する。我々の方法は、チューブリンコードが微小管の固有特性および関連タンパク質との微小管相互作用に及ぼす影響に対処する実験に使用できるチューブリンを生み出す。

この方法の主な目的は、精製された成分を使用して繰り返しインビトロ実験を行うのに十分な量の高品質でアセンブリに有能なチューブリンを製造することです。この管状から組み立てられた微小管は、動的または安定した微小管を用いた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡技術に基づく再構成アッセイに用いることができ、微小管ダイナミクス、MAPsまたは分子モータとの相互作用、およびモータ25による力発生を試験する実験において。それらはまた、微小管MAP共ペレットアッセイおよび固体NMR分光法28に使用することができる。
精製プロセス全体を通して尿細管の濃縮および純度は、クーマッシー染色SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル、好ましくは「TUB」SDS-PAGEゲルを用いて監視することができ、αおよびβチューブリンの分離を可能にする、古典的なゲル32の単一バンドとして共に移行する。異なるステップで採取されたライセート(最後の脱重合を除き、プロトコルを参照)...

このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

この方法により、定義された翻訳後修飾を付与した純粋なアセンブリコンピテントチューブリンを、in-vitro実験の全セットを実行するのに十分な量で生成することができます。チューブリンの重合と解重合のサイクルに基づくこのプロトコールは、どの細胞生物学研究室でも簡単に実行できます。これにより、ほとんど手間をかけずに大量のチューブリンを生成することができます。懸濁培養からチューブリンを精製するには、チューブリン調製の9日前に、目的の細胞タイプを復活させて増幅し、6つのコンフルエント15センチメートルディッシュを取得します。チューブリン調製の8日前に、細胞培養キャビネットの下の各皿に1リットルの予熱した培地を各スピナーボトルに追加し、スピナーを細胞培養インキュベーター内の攪拌テーブルに置きます。ラテラルスピナーキャップを少し開いたままにして、培地がインキュベーターの雰囲気と平衡化できるようにします。翌日、コンフルエントディッシュの細胞を使用してスピナーボトルに接種します。スピナーボトルをインキュベーターに1週間戻し、側方弁を少し開いた状態で保管します。細胞を回収するには、スピナーボトルから培養物を1リットルの遠心分離ボトルに移し、遠心分離によって細胞を回収します。各ペレットを10ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、再懸濁した細胞を50ミリリットルのチューブにプールして摂氏4度で遠心分離します。10ミリリットルの細胞ペレットの場合、ペレットに10ミリリットルの溶解緩衝液を添加し、チューブを数回反転させて細胞を再懸濁します。接着細胞培養物からチューブリンを精製するには、チューブリン調製の日に目的の細胞タイプを復活させて増幅し、15 cmのコンフルエントディッシュを10枚取得します。接着細胞を回収するには、一度に3つのディッシュを処理し、培養ディッシュを傾けて培地を取り除き、2人目の人が7ミリリットルのPBS-EDTAで細胞を優しく洗浄します。洗浄後、2人目は1皿あたり5ミリリットルのPBS-EDTAで細胞を処理してから、3人目にセルリフターを使用して細胞を皿の一方の端に優しく押し込ませる必要があります。細胞が分離したら、3つの皿すべての細胞を氷上の50ミリリットルのチューブにプールし、各プレートをさらに2ミリリットルのPBS-EDTAですすぎ、残りの細胞を収集します。遠心分離により細胞を回収した後、上清を捨てて細胞ペレットの体積を決定します。溶解バッファーを添加し、細胞を再懸濁し、14ミリリットルの丸底チューブに移します。細胞を約45パルス超音波処理します。マウスの脳溶解には、成体マウスから採取した1つの脳に500マイクロリットルのライセンスバッファーを加え、ティッシュブレンダーを使用して組織を溶解します。ライセートをその容量の1/100で等量の2X Laemmli bufferにした後、溶液を5分間煮沸します。定量までマイナス20°Cで保存してください。この方法で、チューブリン調製の各ステップでサンプルを採取します。ライセートを清澄化するには、サンプルを遠心分離し、長い針を使用して透明な上清を新しいチューブに慎重に移し、上部の浮遊層を避けます。ライセートの清澄化後、上清中の浮遊物質を除去することが不可欠であり、そうしないとチューブリン精製の効率に悪影響を与える可能性があります。清澄化されたライセートからチューブリンを重合するには、上清1の全容量を、1/200の容量の0.2モルGTPと半分の容量の温かいグリセロールと、適切なサイズのチューブで混合します。混合物を静かにピペットで動かし、気泡が入らないように注意してください。チューブをパラフィルムで密封し、摂氏30度の水浴に20分間入れます。遠心分離後、上清を新しいチューブに移します。ペレット2に存在する微小管を解重合するには、ペレットを氷上に5分間氷冷したBRB 80に再懸濁します。まずP1000ピペットでサンプルをピペットで、次にP200ピペットで、氷上で5分ごとに20分間ピペットします。サンプルが均一になったら、遠心分離機にかけ、得られた上清を新しいチューブに移します。チューブリンから微小管関連タンパク質を除去するには、上清3の全容積を、等量の予熱された1モルパイプS、同量の予熱されたグリセロール、および1/100容積の0.2モルGTPと混合します。遠心分離する前に、混合物を摂氏30度で20分間インキュベートします。微小管関連タンパク質含有上清4を新しいチューブに移し、ペレットには重合した微小管が含まれています。3回目の重合と解重合を行った後、SDSページ分析により回収されたチューブリンの量を定量化できます。精製プロセスの成功は、Coomassie染色SDSページで確認できます。精製されたチューブリンの収率が予想よりも低いのは、第2、第4、第6のペレット画分におけるチューブリンの量が少なく、第2、第4、および第6の上清画分におけるチューブリンの量が多いことからも明らかなように、チューブリンの重合が非効率的であるためである可能性があります。精製されたチューブリンを定量するために、サンプルを既知の量のウシ血清アルブミンの隣に分析できます。その後、タンパク質バンドの定量的デンシトメトリーにより、精製されたチューブリンの量を計算することができます。チューブリンの修飾状態は、サンプルの免疫ブロット分析によって確認することができます。当社のプロトコールでは、制御された翻訳後修飾によるチューブリンの単離が可能です。このチューブリンを使用すると、チューブリン修飾が微小管特性に与える影響、および微小管関連タンパク質との相互作用への影響を決定できるin vitro再構成実験をセットアップできます。

purification-tubulin-with-controlled-posttranslational-modifications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。...

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

このプロトコルの目的は、DNA折り紙ナノ構造上の分子モーターのアンサンブルを形成し、全内部反射蛍光顕微鏡を使用してアンサンブル運動性を観察することです。...

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。...

温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。...

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

本稿では、細管障害のモデルで微小管を負荷した希突起膠細胞を、シンプルで革新的な第2高調波発生顕微鏡アプローチで検出するためのプロトコルを紹介します。...

中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro...

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

この記事では、植物ベースの微小管架橋剤であるMAP65およびPEGをクラウディング剤として使用して、タクトイドの形状の微小管アセンブリを形成するためのプロトコルを提示する。...

微小管タクトイドの自己組織化

ここで紹介するのは、微小管およびキネシンモーターから活性ネマティクスを調製する方法であり、タンパク質の調製および構築、ならびに活性ネマチック閉じ込めのためのウェルの使用を含む。...

微小管ベースのアクティブネマティクスの形成、閉じ込め、観察

このプロトコールは、小規模の装置に最適化されたブタの脳からのチューブリンの高収率単離技術について説明しています。単離手順は、共沈降アッセイと透過型電子顕微鏡を使用して in vitro...

ブタ脳組織からのチューブリン収量の最適化

ここでは、特定の微小管修飾酵素を欠くか含む可能性のある哺乳類細胞から内因性チューブリンを抽出し、特定の修飾のために富んだ微小管を得るためのプロトコルについて説明します。次に、抽出した微小管を精製した微小管結合タンパク質で修飾して、クライオ電子顕微鏡用のグリッドを準備する方法について説明します。...

クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

学ぶ 重合・脱重合サイクルを用いたチューブリン精製法。培養細胞やマウス脳から翻訳後修飾を制御した組み込み活性を持つチューブリンを少量の手作業時間で効率的に調製し、微小管動態の研究に応用する。

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

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