重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

この方法により、定義された翻訳後修飾を付与した純粋なアセンブリコンピテントチューブリンを、in-vitro実験の全セットを実行するのに十分な量で生成することができます。チューブリンの重合と解重合のサイクルに基づくこのプロトコールは、どの細胞生物学研究室でも簡単に実行できます。これにより、ほとんど手間をかけずに大量のチューブリンを生成することができます。

懸濁培養からチューブリンを精製するには、チューブリン調製の9日前に、目的の細胞タイプを復活させて増幅し、6つのコンフルエント15センチメートルディッシュを取得します。チューブリン調製の8日前に、細胞培養キャビネットの下の各皿に1リットルの予熱した培地を各スピナーボトルに追加し、スピナーを細胞培養インキュベーター内の攪拌テーブルに置きます。ラテラルスピナーキャップを少し開いたままにして、培地がインキュベーターの雰囲気と平衡化できるようにします。

翌日、コンフルエントディッシュの細胞を使用してスピナーボトルに接種します。スピナーボトルをインキュベーターに1週間戻し、側方弁を少し開いた状態で保管します。細胞を回収するには、スピナーボトルから培養物を1リットルの遠心分離ボトルに移し、遠心分離によって細胞を回収します。

各ペレットを10ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、再懸濁した細胞を50ミリリットルのチューブにプールして摂氏4度で遠心分離します。10ミリリットルの細胞ペレットの場合、ペレットに10ミリリットルの溶解緩衝液を添加し、チューブを数回反転させて細胞を再懸濁します。接着細胞培養物からチューブリンを精製するには、チューブリン調製の日に目的の細胞タイプを復活させて増幅し、15 cmのコンフルエントディッシュを10枚取得します。

接着細胞を回収するには、一度に3つのディッシュを処理し、培養ディッシュを傾けて培地を取り除き、2人目の人が7ミリリットルのPBS-EDTAで細胞を優しく洗浄します。洗浄後、2人目は1皿あたり5ミリリットルのPBS-EDTAで細胞を処理してから、3人目にセルリフターを使用して細胞を皿の一方の端に優しく押し込ませる必要があります。細胞が分離したら、3つの皿すべての細胞を氷上の50ミリリットルのチューブにプールし、各プレートをさらに2ミリリットルのPBS-EDTAですすぎ、残りの細胞を収集します。

遠心分離により細胞を回収した後、上清を捨てて細胞ペレットの体積を決定します。溶解バッファーを添加し、細胞を再懸濁し、14ミリリットルの丸底チューブに移します。細胞を約45パルス超音波処理します。

マウスの脳溶解には、成体マウスから採取した1つの脳に500マイクロリットルのライセンスバッファーを加え、ティッシュブレンダーを使用して組織を溶解します。ライセートをその容量の1/100で等量の2X Laemmli bufferにした後、溶液を5分間煮沸します。定量までマイナス20°Cで保存してください。

この方法で、チューブリン調製の各ステップでサンプルを採取します。ライセートを清澄化するには、サンプルを遠心分離し、長い針を使用して透明な上清を新しいチューブに慎重に移し、上部の浮遊層を避けます。ライセートの清澄化後、上清中の浮遊物質を除去することが不可欠であり、そうしないとチューブリン精製の効率に悪影響を与える可能性があります。

清澄化されたライセートからチューブリンを重合するには、上清1の全容量を、1/200の容量の0.2モルGTPと半分の容量の温かいグリセロールと、適切なサイズのチューブで混合します。混合物を静かにピペットで動かし、気泡が入らないように注意してください。チューブをパラフィルムで密封し、摂氏30度の水浴に20分間入れます。

遠心分離後、上清を新しいチューブに移します。ペレット2に存在する微小管を解重合するには、ペレットを氷上に5分間氷冷したBRB 80に再懸濁します。まずP1000ピペットでサンプルをピペットで、次にP200ピペットで、氷上で5分ごとに20分間ピペットします。

サンプルが均一になったら、遠心分離機にかけ、得られた上清を新しいチューブに移します。チューブリンから微小管関連タンパク質を除去するには、上清3の全容積を、等量の予熱された1モルパイプS、同量の予熱されたグリセロール、および1/100容積の0.2モルGTPと混合します。遠心分離する前に、混合物を摂氏30度で20分間インキュベートします。

微小管関連タンパク質含有上清4を新しいチューブに移し、ペレットには重合した微小管が含まれています。3回目の重合と解重合を行った後、SDSページ分析により回収されたチューブリンの量を定量化できます。精製プロセスの成功は、Coomassie染色SDSページで確認できます。

精製されたチューブリンの収率が予想よりも低いのは、第2、第4、第6のペレット画分におけるチューブリンの量が少なく、第2、第4、および第6の上清画分におけるチューブリンの量が多いことからも明らかなように、チューブリンの重合が非効率的であるためである可能性があります。精製されたチューブリンを定量するために、サンプルを既知の量のウシ血清アルブミンの隣に分析できます。その後、タンパク質バンドの定量的デンシトメトリーにより、精製されたチューブリンの量を計算することができます。

チューブリンの修飾状態は、サンプルの免疫ブロット分析によって確認することができます。当社のプロトコールでは、制御された翻訳後修飾によるチューブリンの単離が可能です。このチューブリンを使用すると、チューブリン修飾が微小管特性に与える影響、および微小管関連タンパク質との相互作用への影響を決定できるin vitro再構成実験をセットアップできます。