Name: アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶ人工膜フィーダーを用いたアエデスアエジプティ蚊への動物由来血液と人工食事の摂食方法。蛍光素を用いた高精度な摂食量定量化技術により、ベクター生物学研究における薬理学的・遺伝学的操作を効率的に支援します。

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ニプン・バスル、アドリアナ・K・ロサス・ヴィルガス、ナダフ・シャイ、トレバー・ソレルズの原稿に関するコメント、中陰ゴングとカイロロス・バルソウムの技術支援に感謝します。 図1で使用されている写真を撮ってくれたアレックス・ワイルドに感謝します。K.V.はベーリンガー・インゲルハイム・フォンズ博士フェローシップによって支えられていました。V.J.はNIH T32-MH095246の一部でサポートされました。この研究の一環として、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ・プログラムを通じてロックフェラー大学への助成金がV.J.に支えられた。この資料は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの助成No.の支援を受けた作業に基づいています。NSF DGE-1325261 から V.J.この資料に記載されている意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

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著者らは開示するものは何もない。

多くの実験室の適用のために、人工膜フィーダーは研究者が直接食事の内容を操作する機能を可能にすることによって生きているホストと比較して明確な利点を提供する。人工膜送出には複数の方法が用意されていますが、ここで説明する方法は柔軟性、コスト、スループットの利点があります。他の市販の膜フィーダーと比較して、Glytubeアッセイは、必要な総容積を7、35に抑えることによって、薬物または病原体を含む高価な試薬のための効率的な送達メカニズムを作る、少量の食事量を必要とする。タンパク質フリーの生理食糸と人工血液の食事の両方がエングレーギンメントを促進するので、化合物または病原体は、注射に対するハイスループットおよび非侵襲的な代替手段として、食事に加えることができる。さらに、Glytubeの各成分は、容易に洗浄、交換、またはスケールアップすることができ、給餌装置の交差汚染なしに複数の食事タイプを提供および定量化することができます。
蚊が消費する食事量を定量化するために、蛍光ベースの方法は、摂食の前後に蚊の重量を量るよりも、より正確な食事サイズの定量を可能にする。なお、この方法は終点アッセイである。対照的に、計量は蚊がさらなる実験のために生き続けることを可能にする。プレートリーダーを使用することにより、蛍光ベースの方法を簡単にスケールアップして、何百人もの女性が消費する食事のハイスループット定量化を行うことができます。
高い給餌率を達成するには、女性のホストシーク行動を活性化し、フィーダーに女性を引き付けるのに十分なホストキューが存在する必要があります。蚊がグリチューブの下に混雑していない場合、食事が適切に温められていないか、CO2 の配達が十分でない可能性があります。膜表面に人臭を加えると、人工膜の魅力が確実に高まります。グリチューブの下で蚊が観察されるが、餌を与えることができない場合、食事の組成に欠陥がある可能性があります。女性は、食事自体が暖かくなければ、血液が古すぎる、または食事への添加物が本質的に回避的であるか、または望ましくない化学反応36を引き起こす場合、餌を与えないかもしれない。追加のATPも確実に供給速度を増加させ、提供される各レシピの2 mMの最終濃度にスケールアップすることができる。パラフィルムがGlytubeキャップを横切って引っ張られていない場合、女性は餌を与えることができません。これは女性が効果的に彼女のスタイでパラフィルムを突き刺すことができるのを防ぐので、パラフィルムは均一に透明であるべきであり、バックルすべきではありません。食事がGlytubeを通ってメッシュに漏れた場合、パラフィルムはストレッチプロセス中に破れた可能性があり、交換する必要があります。
食事の組成を変更すると、研究者は、中間腸から食事をクリアするために必要な時間の長さと、その後のホストシーク行動を操作することもできます。ここで提示される食事は、動物由来の血液と同様の消化7 のために24〜36時間を必要とします。これらの食事のいずれかを食べ物を与えた後、女性は消化時間のウィンドウ中に宿主を求めることを抑制します。生理食前の食事にはタンパク質が欠けているため、女性は食事が取り除いた後に宿主を求めて戻ります。より速いリターンが望ましい場合、研究者は約6時間27で排泄される代替の「迅速なクリア」生理食音の食事を選択することができます。ここで提示される生理食塩水の組成は、人工血液食事と直接結果を比較するために一致しているが、"迅速なクリア"食事は、脊椎動物の血液中に見られる生理学的塩分濃度とより密接に一致する。
ここで説明する方法には、研究者の実験目標に最も適したアッセイを選択する前に考慮すべき制限があります。記載されたフルオレセイン測定では、蚊を追加の実験に再び使用することはできません。しかし、体重の測定は、フルオレセインアッセイを用いて食事サイズ定量の前に行うことができる。体重と食事のサイズが特定の食事の複数の試験で一貫している場合、体重は将来の実験で代理として使用することができます。さらに、このプロトコルは、ホストシークと血液供給行動の欠損を区別しません。膜フィーダーを見つけることに障害を示す蚊は、摂食率および/または食事のサイズの減少を持つことになります。アッセイ全体の行動を記録するためにカメラを追加することで、研究者は女性がGlytubeを見つけることができないかどうか、またはGlytubeを見つけるが餌を与えないかどうかを判断することができます。
ここで説明するアッセイは、蚊の摂食行動に関連する多くの顕著な質問を探求するために適応することができる。例えば、特定の血液タンパク質の寄与は、人工血液の食事中の構成タンパク質または総タンパク質濃度の比率を変化させることによって探索することができる。複数の摂食イベントから食事のサイズを評価するために、独特の蛍光スペクトルを有する色素を添加して、食事を独特の供給源37と区別することができる。このプロトコルはまた、血液を検出し、摂取に使用される内部マウスパーツ(すなわち、stylet)と、蚊が血液供給を開始するために着陸する蚊として接触する化学感覚の付属物(すなわち、陰唇、脚)を個別に刺激するように変更することができる。例えば、リガンドを食事に直接加えた場合、膜はスタイレットによってのみ穿孔されるため、陰素と脚に接触しません。代わりにパラフィルムの外表面にリガンドを添加した場合、それらは食事から分離されたままであり、陰唇と脚36によって接触され得る。最後に、血液供給行動の詳細な運動学はよく理解されておらず、ここで提示される方法は、高解像追跡と機械学習ツールを組み合わせて、移動、姿勢、および摂食ダイナミクス38の行動読み出しを抽出するように変更することができる。
このプロトコルは、蚊の採血と摂食後の行動を研究するために薬理学的および遺伝子操作を採用する研究者にサービスを提供する能力を持つ、ユーザーフレンドリーで費用対効果の高いことを目的としています。

人工膜フィーダーを使用して Aedes aegypti 蚊に修飾された血液食事を供給し、個々の蚊が消費する食事量を正確に測定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、食事の内容を変更したり、蚊の異なる実験群によって消費される食事量を比較するために柔軟に適応することができる。
Ae. aegypti蚊は、黄熱病、デング熱、チクングニア、ジカ1、2、3、4、5などの病気を引き起こす病原体を広めることによって、世界の健康を脅かす。Ae. aegyptiメスは血液供給者を義務付ける。卵の発達に必要なタンパク質を得るために脊椎動物の血液を消費する必要があり、卵の各クラッチは少なくとも1つの宿主6、7、8からの完全な血液の食事を必要とします。メスの蚊は、まず彼女のスタイレットで皮膚を突き刺し、宿主の免疫応答を引き起こす化合物を含む唾液を注入することによって、彼女のホストを噛む9.その後、彼女は彼女のステーレットを通して彼女の中間に血液を送り込んで餌を与えます。感染した宿主から血液の食事を摂取しながら、彼女は血液媒介病原体6、8を摂取し、蚊の中腸から唾液腺10に移動する。この方法で感染した雌の蚊は、その後の宿主11、12を噛むときに唾液と一緒に病原体を注入することによって病気を広めることができる。血液供給行動のメカニズムを理解し、定量化することは、蚊媒介性疾患の伝染を制御する上で重要なステップです。
蚊の飼育と実験のための多くの実験室プロトコルは、マウス、モルモット、またはヒトを含む生きた動物を血液源13、14、15、16として使用する。生きた動物の使用は倫理的な懸念と、人員訓練、動物の住宅とケア、および制度的動物ケア・使用委員会(IACUC)政策の遵守に対する複雑な要件を課しています。また、蚊に送ることができる化合物の種類を制限します,これは、実行することができる研究を制約します 17 .
人工血液供給装置は、通常、宿主の皮膚をシミュレートするために膜システムを使用し、ライブホストの維持の必要性を回避する血液供給行動を研究するための有用なツールである。全血は、ベンダーの数から購入し、加熱された水ジャケット人工膜フィーダーまたは同様のデバイス18、19を使用して蚊に供給することができます。このプロトコルでは、「Glytubes」と呼ばれている小型の使い捨て膜フィーダーの使用を実証する。コスタ・ダ・シルバら(2013)20によって以前に発表されたこの膜フィーダーは、標準的な実験室機器から簡単に組み立てることができ、血液食事を適度な数の蚊に送り込むのに理想的であり、より大きなグループまたは複数の食事製剤をテストするためにスケールアップするのが簡単です。Glytubeは、他の商用人工フィーダーに代わる安価で効率的な代替物であり、食事量が大きい場合があり、単一の食事製剤21上で蚊の大きなグループをバッチ供給するのに適している。
このプロトコルには、人工食事の準備/配達と消費の定量化の2つのセクションが含まれています。最初のセクションでは、Glytubesは、操作された食事を提供するための効率的な手段として使用されています。全血は、血液の代わりに血液置換の効果を比較するために、完全に人工的な食事で置き換えることができます。コーガン(1990)22から適応したレシピがここで提示されていますが、複数の人工食事製剤が23,24に開発されています。さらに、給餌は、注射よりも薬理学的化合物を導入するための侵襲性が低く、手間のかからない方法です。各食事に必要な総容積(1~2 mL)が少ないため、このプロトコルは高価な試薬の量を減らすための魅力的な送達方法を提供します。ae. aegyptiメスは、単一の食事成分の効果を測定するためのベースラインを提供するアデノシン5′三リン酸(ATP)25、26と生理食塩水のタンパク質フリーの食事を容易に消費します。例えば、Ae.aegyptiにおけるニューロペプチドY様受容体7(NPYLR7)は、タンパク質が豊富な血液食事の後に宿主を求める抑制を仲介することが知られており、NPYLR7アゴニストがタンパク質を含まない生理食前の食事に添加されると、雌蚊は全血を消費したものと同様の宿主求めの抑制を示す。
第2のセクションでは、個々のメスの蚊が消費する各食事の量を定量化するためのステップが提示される。このアッセイは蛍光ベースで、腹部の膨満度の視覚的評価に基づいて女性が「供給」または「未供給」に分類される方法よりも高い解像度で摂食状態を捉える。摂食前に食事にフッ素を加えることで、個人が摂取した食事量を96ウェルプレートで均質化し、蛍光強度を読み出しとして測定することで定量化することができます。このアッセイは、食事組成や蚊の遺伝的背景などの変数に応答して、供給活力の違いを測定することができます。正確な定量化は、中間食事のサイズ、例えば女性が摂食抑止力を含む最適でない食事を提供される場合、または可変サイズ27のスクロースミールを消費する場合に重要である。食事サイズの定量化後のその後の行動アッセイに蚊を与える必要がある場合、食事のサイズは、代わりに麻酔薬をグループで計量し、個人あたりの平均増加質量を推定することによって計算することができます。フルオレセインマーキングよりも精度は低いが、計量は依然として食事量の集計推定値を提供し、食事が下流プロセス(例えば、胎児性または後の宿主誘引力)に及ぼす影響を調べることができる。血液の食事のサイズは可変であり、無数の因子11、28、29の影響を受けることができるが、ここで説明する方法で測定された摂取された食事サイズは、以前の定量7、30、31と一致している。

<table><tbody><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>直径 3 mm ホウケイ酸固体ガラスビーズ</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z143928</td><td>ビーズミルホモジナイザーに使用。ペレット乳棒グラインダー</td></tr><tr><td>32 オンスの高密度ポリエチレン (HDPE) プラスチックカップ</td><td>VWR</td><td>89009-668</td><td>例 栄養アッセイに使用される蚊の容器の例が示されています。代替オプションを使用できます</td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル黒色ポリスチレンプレート</td><td>ThermoFisher</td><td>12-566-09</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル PCR プレートシーリングフィルム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MSB1001</td><td>代替オプションを使用可能</td></tr><tr><td>96 ウェル PCR プレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSP9621</td><td>代替オプションを使用可能</td></tr><tr><td>アデノシン 5 プライム 三リン酸 (ATP) 二ナトリウム塩水和物</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン(ヒト血清)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-213</td><td>代替オプションは、フルオレセイン容器に入る光をブロックするために使用することができます</td></tr><tr><td>バランス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-911</td><td>代替オプションは、ビーズ</td></tr><tr><td>ミルホモジナイ</td><td>ザーQiagen</td><td>85300</td><td>を使用することができますペレット乳棒グラインダーを使用する場合は必要ありません</td></tr><tr><td>コットンボール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22456880</td><td>蜜供給用; 代替オプションを使用できます</td></tr><tr><td>除細動羊の血液</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DSB100</td><td>代替オプションを使用できます</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ CO2 フライパッド</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td>代替オプションを使用できます</td></tr><tr><td>フルオレセイン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>蛍光プレートリーダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>VL0000D0</td><td>代替オプションが使用可能</td></tr><tr><td>ガンマグロブリン(ヒト血液)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H7379</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>ヘモグロビン(ヒト)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G4386</td><td></td></tr><tr><td>ラボラッピングフィルム - パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-374</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>90-691</td><td>代替マグネチックスターラーを使用可能</td></tr><tr><td>96ウェルプレート用マイクロ遠心分離機</td><td>VWR</td><td>80094-180</td><td>代替オプションを使用可能</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>2236412</td><td>代替オプションを使用可能</td></tr><tr><td>ペレット乳棒グラインダー</td><td>VWR</td><td>KT749521-1500</td><td>ビーズミルホモジナイザーを使用する場合は必要ありません</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液(PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BW17-516F</td><td>オプション</td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-640</td><td>代替オプションは、切削の一貫性を高めるための旋盤など、使用できます</td></tr><tr><td>ラバーバンド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>マクマスターカー</td><td></td><td>CO2送達用のフライパッドを使用する場合に必要</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-512</td><td>代替磁気攪拌子は、</td></tr><tr><td>取り外し可能な蓋</td><td></td><td>付きの半透明ポリプロピレン収納ボックスを使用することができます</td><td>栄養アッセイに使用される例のボックス</td></tr>は<tr><td>、ボルテックスミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td>代替加熱装置を使用することができます</td></tr>ホワイト<tr><td>0.8ミリメートルポリエステル蚊帳</td><td>アメリカンホーム&アメリカンホーム株式会社Habit</td><td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td><td>代替オプション使用可能</td></tr></tbody></table>

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

特定の蚊種のメスは、卵の発達に必要なタンパク質が豊富な血液食事を得るために脊椎動物の宿主を噛みながら病気を広めることができます。実験室では、研究者は、食事組成の操作を可能にする膜フィーダーを介して蚊に動物由来および人工血液食事を提供することができます。ここでは 、Aedes aegypti 蚊に血液および人工血液食事を供給し、個々の女性が消費する量を定量化する方法を提示する。
人工的/血液食事の標的餌と定量化は、食事成分が蚊の行動や生理学に及ぼす影響のテスト、注射なしで薬理学的化合物を提供すること、蚊を特定の病原体に感染させるなど、幅広い用途を持っています。摂食前にフルオレセイン染料を食事に加えることにより、その後の食事サイズの定量が可能になります。蚊が消費する食事量は、体重、後で女性を行動実験に使用する場合、または96ウェルプレートの個々のメスを均質化し、プレートリーダーをエンドポイントアッセイとして使用して蛍光レベルを測定することによって測定することができます。食事サイズの定量化は、食事成分を変更すると摂取される食事量が変化するか、または食事の消費量が蚊の株によって異なるかどうかを決定するために使用することができます。正確な食事サイズの定量は、宿主の魅力や胎児性に対する影響を測定するような下流アッセイにとっても重要です。ここで提示される方法は、日の経過とともに食事の消化を追跡したり、異なる食事(蜜や血液など)に追加された複数の識別可能なマーカーを含むようにして、各食事の消費量を単一の蚊によって定量化するようにさらに適応することができる。
これらの方法により、研究者は単独でハイスループット測定を行い、何百もの個々の蚊が消費する食事量を比較することができます。したがって、これらのツールは、多様な生物学的質問に答えるために蚊の研究者のコミュニティに広く役立ちます。

図1 はGlytubeを組み立てる模式図を示し、図 2 は、ここで説明する蛍光ベースのアッセイを用いて食事サイズを測定する実験計画の概要を示している。 図3 は、血液供給実験からの代表的なフルオレセイン食事サイズ測定を提供する。 図 4、 図 5、および 図 6 は、このプロトコルを使用して対処できる生物学的な質問のサンプルを示しています。プロトコルの用途は広範囲に及び、血液食事組成の変化、薬理学的化合物の摂食、最適でない血液食事または小さな蜜食事の正確な定量化、蚊の遺伝子型にわたる摂食行動の比較が含まれる。
食事量計算のための標準曲線を生成するために、蛍光測定値は、それぞれ0.002%フルオレセインを有する未供給の蚊および既知の食事量を含む指定された基準ウェルからプロットされる(図3A)。残りの井戸からの蛍光測定値は、未収蚊の陰性対照群または食事を提供した蚊の実験群のいずれかから蚊を含み、各蚊が消費する食事量(μL)を定量化するためにこの標準曲線と比較される(図3B)。このアッセイのベースライン測定値を検証するには、未供給の陰性対照群の蚊にμL消費の正の値が割り当てられないことを確認する必要があります(図3B、左)。実験群の全ての女性が血液の食事を提供されたが、一部の蚊は餌を与えた(図3B、中間)、いくつかは食べなかった(図3B、右)。この結果は、このプロトコルから2種類のデータを得ることができることを示しています:1)与えられた食事を食べる女性全体の割合と、2)与えられた食事を食べる女性が摂取した体積。
このプロトコルは、様々なタンパク質組成物を含む食事を送達し、定量化するために使用できます。 図4A,Bは、 フッ素を添加した食事を用いて収集したデータを示す。餌を与えた蚊の割合と摂取した食事量は、それぞれ蛍光測定値から計算した。これらの測定値は非常に感度が高く、μLの正確な定量化が可能ですが、蚊は将来のライブ実験には使用できないという制限があります。 図4C,Dは、 フルオレセインなしで食事を提供された後に、蚊に餌を与えられたり、目で食べられないとスコア付けされた蚊を用いた独立した実験から収集されたデータを示している。食事の大きさは、5匹の蚊の群から平均体重/メスとして計算した。これらの重量測定は蛍光測定よりも感度が低いが、女性を回収し、さらなる生実験に使用することを可能にする。蚊の餌を与える割合は、実験日によって異なる可能性があります( 図 4A および 図 4Cに示すように)。
図5 は、蚊の宿主を求める行動を調節する薬物を含む食事の消費量を示す。これらの実験では、女性は、ヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338の100μMを有する血液、生理食類+ATP、または生理食物+ATP食事を提供した。この薬物は 、Ae. aegypti NPY様受容体7の活性化を通じて宿主を求める行動を変える。食事のサイズを測定することは、研究者が各女性が消費する用量を計算することを可能にするので、この薬物が血液後摂食行動に及ぼす影響を評価する実験の解釈にとって重要である。
前の例では、女性は血液または代替血液の食事を与えられ、その結果、3〜5μLの食事が生まれました(図3、図4、図5)。この蛍光ベースのアッセイは、平均グループ体重測定から正確に識別できない、より小さく、より可変的な食事サイズを測定するためにも使用できます。図6では、0.002%フルオレセインを含む10%スクロースで飽和した綿球に対してGlytubeを交換して蜜送り行動を測定するために、同じ蛍光定量プロトコルを使用した。女性はスタイレットで蜜糖の存在を検出できず、摂食を開始しないため、Glytubeアッセイではネクター糖を提示することはできません。これらのデータにより、研究者は、前の研究34(図6)と一致して、砂糖の食事が血液の食事よりも一貫して小さいことを決定することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> 図1:蚊に食事を与えるために使用されるGlytube法の設定。(A) 蚊に血液やその他の食事を供給するために使用される分解されたGlytubeの模式図。(B) Glytube の模式図は、メッシュの蓋をした蚊の容器の上に提示した。メスの蚊は、餌を与えるためにメッシュ蓋を通して突き刺すことができます。(C)グリチューブ(上)と雌の Aedes aegypti 蚊の写真は、グリチューブが配達した食事の前、中、および後(下、左から右)に餌を与えた後である。蚊は、膜フィーダーにアクセスするために容器を覆うメッシュを通して突き刺さって示されています。(D) 餌を与えず、人工血液の食事(右、上)または生理食費+ATPミール(右、下)のいずれかに夢中になっている雌の Ae.aegypti 蚊の外観を示す写真。Glytube 法は以前にコスタダ・シルバら (2013)20で出版された。写真(C)と(D)はアレックス・ワイルドの礼儀です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> 図2:Glytubeの採血プロトコル後の食事サイズを定量化する方法の概略図。(A)蚊はフルオレセイン(上、実験群)または食事なし(下、未供給の陰性対照群)の食事を提供される。(B)餌付け実験を終了した後、96ウェルプレートに個々の蚊を加える。(C)標準曲線は、0.002%フルオレセインを含む既知の量の食事を使用して生成される。(D) 蚊は、消費された蛍光を放出するために均質化され、各ウェルの蛍光レベルはプレートリーダーを用いて定量化される。この蛍光定量法は、Lieschら(2013)34から修飾される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> 図3:フルオレセインベース定量によるグリチューブ給餌実験(A) 未供給の対照群から得られた、0.002%フルオレセイン(y軸スケール=任意の単位)を含む既知の量の食事に添加された井戸から得られる標準曲線測定。(B)未供給対照群の女性の蛍光測定値(左、黒、n=40)、血液を与えた実験群(中、赤、n=37)、および血液を食べなかった実験群(右、赤、n=23)を用いて計算した食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p&lt;0.01をテストします。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> 図4:タンパク質組成が異なる食事の定量化女性は、羊の血液(赤)、ヒト血液タンパク質を有する人工血液(コーガン(1990)22)(オレンジ)、またはタンパク質フリーの生理食動物+ATPミール(アクア)7のいずれかの食事を提供した。(A) 蛍光測定値を用いて採点された女性の割合。各ポイントは12~16人の女性のグループを表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(B)蛍光測定値を用いて計算した食事量。各ポイントは、図4Aからの単一の試験における個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(C) 人工膜供給後に完全に充満した女性の割合は、目で採点される。各ポイントは、20~30人の女性のグループから集まった女性の割合を表します。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。(D) 給餌状態が目で採点された後、体重/女性として採点された食事サイズ。体重は5つの蚊の群の平均として計算した。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。A–D: 文字は統計的に異なるグループを示し、 Kruskal-Wallis 検定とダンの多重比較、 p&lt;0.05.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> 図5:薬理化合物による食事の定量化メスは、同じ大きさの羊の血液(赤)、生理食い+ ATP(アクア)、および生理食類+ATP + 100 μM用量のヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338(ダークブルー)の食事を消費する。蛍光測定値を用いて計算された食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p&lt;0.05をテストします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> 図6:小さい蜜の食事の定量化。(A) 蜜送りアッセイの概略図。(B)野生型メスの蛍光測定値を用いて計算された食事量は、水(青、n=36)または10%スクロース(緑、n=53)の食事を提供し、それぞれ0.002%フルオレセインを含む、蜜供給アッセイで提供した。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループ、マン・ホイットニー検定、p&lt;0.05を示します。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">人工血液の食事</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mg/mL)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">タンパク質成分*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γグロブリン</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘモグロビン</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>アルブミン</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>総タンパク質</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">非タンパク質成分</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">※タンパク質成分は、400 mM NaHCO3 に溶解し、可変量のNaCl(2-4%)を含むγグロブリンを除き、二重蒸留水のストック溶液に調製される製品に含まれる。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:人工血液の食事を準備するためのレシピ(コーガン(1990)から適応22)。人工血液は、ヒトの血液中に定期的に見られるタンパク質および非タンパク質成分で構成され、これらの成分の比率を変化させるオプションを提供する。蚊は人工血液7、22を食べた後に卵を作り出すことができます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">生理食いの食事</td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ATPによる生理食用のレシピ(デュヴァルらから適応(2019)7)。タンパク質フリーの生理食動物の食事は、血液を摂食した後に起こる腹部の膨満を模倣しながら、蚊に関心のある化合物を提供するために使用することができますが、タンパク質を摂取したときに発生する卵の発達を引き起こすことなく。

このプロトコルの目標は、人工膜フィーダーを介して Aedes aegypti 蚊に動物由来および人工血液食事を提供し、摂取される食事の量を正確に定量することです。

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

この技術により、研究者は餌を与え、単独でハイスループット測定を行い、数百匹の蚊が消費する食事量を比較することができます。食事の内容を変更したり、異なる実験グループによって消費された量を比較したりすることは適応可能です。このプロトコルは、ユーザーフレンドリーで低コストであることを目的としています。薬理学的および遺伝的操作のために、蚊の血液摂食と洪水後の摂食行動を研究すること。このプロトコルでは、組織化が重要です。事前にセットアップと試薬を準備しておくと、蚊に食事をすばやく届けることができます。まず、1.98〜2ミリリットルの除細動羊の血液を15ミリリットルの円錐管に移します。蛍光ベースの食事サイズの定量を行う場合は、フルオレセイン溶液を最終濃度0.002%まで添加し、フルオレセインを添加した血液量と同量だけ減らします。最終食用製剤を1ミリリットル保持して、参照標準曲線を生成します。フルオレセインを含むすべての食事と溶液は、アルミホイルで包むか、暗所に保管する必要があります。プロテインフリーの生理食塩水を準備するには、600マイクロリットルの400ミリモル重炭酸ナトリウムと1.39ミリリットルの二重蒸留水を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。蛍光に基づく食事サイズの定量化を後で実施する場合は、フルオレセイン溶液を最終濃度0.002%まで追加し、フルオレセインを添加した水の量と同じ量だけ減らします。0.002% フルオレセインを含む最終食用製剤を少なくとも 1 ミリリットル保持して、参照標準曲線を作成します。準備された食事は、配達する準備ができるまで取っておきます。フルオレセインを含むすべての食事と溶液は、アルミホイルで包むか、暗所に保管する必要があります。メスの蚊の実験グループを容器に入れ、メッシュで覆います。これらの女性が給餌室に順応するのを待ちます。食事が提供されない餌を与えられていない蚊の対照群を取っておきます。GLIチューブを構築するには、50ミリリットルの円錐管に40ミリリットルの100%グリセロールを充填します。開いた円錐形のチューブを2枚のパラフィルムで密封して、漏れの可能性を最小限に抑えます。必要に応じて、輪ゴムを使用してパラフィルムを所定の位置に保持します。チューブを反転させて、穴や隙間がないことを確認します。食事配達装置を作成するには、鋭利なカミソリの刃または溶岩を使用して、円錐形のチューブのスクリューキャップに中央に2.5センチの穴を開けます。パラフィルムを均等に伸ばして、サイズが約2倍になるようにします。パラフィルムは、蚊が簡単に侵入できるほど薄くする必要がありますが、漏れがあってはなりません。スクリューキャップの外面をパラフィルムでシールして穴を完全に覆い、キャップを脇に置きます。グリセロールの密封されたチューブと血液および生理食の両方、および摂氏42〜45度の水浴を少なくとも15分間加熱します。温めた食事にATPを加え、しっかりと渦巻きます。温めた食事の2ミリリットルをスクリューキャップの内側のチャンバーにピペットで入れ、逆さに温めたグリセロールを充填した円錐形のチューブをそっと置きます。部分的に、食事やグリセロールの漏れを防ぐのに十分なだけ、食事の入ったキャップをグリセロールで満たされたチューブにねじ込みます。組み立てたglyチューブを蚊の容器の上に置き、二酸化炭素を適用し、蚊が少なくとも15分間餌を供給できるようにして、最大の摂食速度を達成します。給餌後、GLIチューブキャップはバイオハザード廃棄物として廃棄するか、低の割合の漂白剤溶液に浸し、水で十分にすすいだ後に再利用することができます。参照標準曲線を生成するには、蚊の実験グループに提供されたのと同じ食事の0.002%フルオレセインを含む段階希釈液を準備します。標準曲線の最初の解を作成するには、0.002%フルオレセインを含む50マイクロリットルの食事を950マイクロリットルのPBSに加え、完全にボルテックスします。残りの標準曲線溶液については2倍希釈を行い、各希釈のかなり前にボルテックスします。各標準曲線溶液100マイクロリットルを、96ウェルPCRプレートの最初の列にある8つのウェルのそれぞれにピペットで移します。麻酔をかけた、または冷凍した給餌されていない対照蚊を1匹ずつ、同じ8つの井戸のそれぞれに追加します。プレートの2列目で繰り返して、繰り返し測定を行います。100マイクロリットルのPBSを、未供給の対照群と実験群のために残った各ウェルに加えます。ネガティブコントロールとして、プレートの次の2列の各ウェルに1匹の給餌されていない蚊を追加します。食事を提供された実験グループからの残りの井戸に、井戸ごとに1匹の蚊を追加します。ビーズミルホモジナイザーで組織を破壊する場合は、各ウェルに3mmのホウケイ酸固体ガラスビーズを追加します。プレートを慎重に密封し、組織を破壊してから、プレートを2000RPMで1〜2分間遠心分離してライセートを収集します。各ウェルに180マイクロリットルのPBSが入った黒色の96ウェルプレートを準備します。次に、各ウェルに20マイクロリットルのライセートを加えて混合します。485励起チャンネルと520蛍光チャンネルを備えたプレートリーダーを使用して、フルオレセイン強度を測定します。参照標準曲線を生成するには、既知の食事量を対応する蛍光強度測定値に対してプロットします。生成された参照標準曲線を使用して、実験グループの各蚊が摂取した食事量を推定します。各実験群の個々の蛍光強度の読み取り値から、給餌されていないネガティブコントロールグループの平均蛍光強度の読み取り値を差し引いて、ベースライン組織の自家蛍光を補正します。給血実験からフルオレセインの食事サイズを測定するために、給餌されていない蚊と0.002%フルオレセインを含む既知の食事量を含む指定された参照ウェルからの蛍光測定値をプロットすることにより、標準曲線を作成しました。給餌されていない蚊のネガティブコントロールグループ、または食事を提供した蚊の実験グループのいずれかからの蚊を含む残りの井戸からの蛍光測定値を、この標準曲線と比較して、消費された食事量を定量化します。実験群のすべての女性に血液の食事が提供されましたが、一部の蚊は餌を与え、一部の蚊は餌を与えませんでした。このプロトコルは、さまざまなタンパク質組成の食事を送達および定量するために使用できます。ここには、フッ素を添加した食事を使用して収集されたデータが示されています。蚊にフッ素を含まない食事を提供した後、蚊に餌を与えたかどうかを目で採点する独立した実験も行われました。このプロトコルは、蚊の宿主を求める行動を調節する薬物による食事の消費量を決定するために使用されました。これらの実験では、女性に生理食塩水とATP食事とヒトNPY2受容体アゴニストを提供しました。この手法は、0.002%フルオレセインを含む10%スクロースで飽和した綿球とグリチューブを交換することにより、蜜の摂食行動を測定するためにも使用され、グループの体重測定から正確に識別できない、より小さいまたはより変動する食事サイズを測定するために使用できることを実証しました。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、サンプルをイベントに整理し、給餌されていない蚊と各食事の1 MLを標準曲線を生成するために確保することです。この手順に従うと、給血後の動物の行動を観察し、消化を追跡することができます。この方法により、研究者は遺伝子組み換え蚊の食事摂取量の変化を評価できます。また、蚊に薬を送達し、蚊が行動に及ぼす影響をテストするための、簡単で迅速かつ非侵襲的な方法も提供します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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トランスジェニック ネッタイシマカ の適応コストの定量化

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アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

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