アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

この技術により、研究者は餌を与え、単独でハイスループット測定を行い、数百匹の蚊が消費する食事量を比較することができます。食事の内容を変更したり、異なる実験グループによって消費された量を比較したりすることは適応可能です。このプロトコルは、ユーザーフレンドリーで低コストであることを目的としています。

薬理学的および遺伝的操作のために、蚊の血液摂食と洪水後の摂食行動を研究すること。このプロトコルでは、組織化が重要です。事前にセットアップと試薬を準備しておくと、蚊に食事をすばやく届けることができます。

まず、1.98〜2ミリリットルの除細動羊の血液を15ミリリットルの円錐管に移します。蛍光ベースの食事サイズの定量を行う場合は、フルオレセイン溶液を最終濃度0.002%まで添加し、フルオレセインを添加した血液量と同量だけ減らします。最終食用製剤を1ミリリットル保持して、参照標準曲線を生成します。

フルオレセインを含むすべての食事と溶液は、アルミホイルで包むか、暗所に保管する必要があります。プロテインフリーの生理食塩水を準備するには、600マイクロリットルの400ミリモル重炭酸ナトリウムと1.39ミリリットルの二重蒸留水を15ミリリットルの円錐管に組み合わせます。蛍光に基づく食事サイズの定量化を後で実施する場合は、フルオレセイン溶液を最終濃度0.002%まで追加し、フルオレセインを添加した水の量と同じ量だけ減

0.002% フルオレセインを含む最終食用製剤を少なくとも 1 ミリリットル保持して、参照標準曲線を作成します。準備された食事は、配達する準備ができるまで取っておきます。フルオレセインを含むすべての食事と溶液は、アルミホイルで包むか、暗所に保管する必要があります。

メスの蚊の実験グループを容器に入れ、メッシュで覆います。これらの女性が給餌室に順応するのを待ちます。食事が提供されない餌を与えられていない蚊の対照群を取っておきます。

GLIチューブを構築するには、50ミリリットルの円錐管に40ミリリットルの100%グリセロールを充填します。開いた円錐形のチューブを2枚のパラフィルムで密封して、漏れの可能性を最小限に抑えます。必要に応じて、輪ゴムを使用してパラフィルムを所定の位置に保持します。

チューブを反転させて、穴や隙間がないことを確認します。食事配達装置を作成するには、鋭利なカミソリの刃または溶岩を使用して、円錐形のチューブのスクリューキャップに中央に2.5センチの穴を開けます。パラフィルムを均等に伸ばして、サイズが約2倍になるようにします。

パラフィルムは、蚊が簡単に侵入できるほど薄くする必要がありますが、漏れがあってはなりません。スクリューキャップの外面をパラフィルムでシールして穴を完全に覆い、キャップを脇に置きます。グリセロールの密封されたチューブと血液および生理食の両方、および摂氏42〜45度の水浴を少なくとも15分間加熱します。

温めた食事にATPを加え、しっかりと渦巻きます。温めた食事の2ミリリットルをスクリューキャップの内側のチャンバーにピペットで入れ、逆さに温めたグリセロールを充填した円錐形のチューブをそっと置きます。部分的に、食事やグリセロールの漏れを防ぐのに十分なだけ、食事の入ったキャップをグリセロールで満たされたチューブにねじ込みます。

組み立てたglyチューブを蚊の容器の上に置き、二酸化炭素を適用し、蚊が少なくとも15分間餌を供給できるようにして、最大の摂食速度を達成します。給餌後、GLIチューブキャップはバイオハザード廃棄物として廃棄するか、低の割合の漂白剤溶液に浸し、水で十分にすすいだ後に再利用することができます。参照標準曲線を生成するには、蚊の実験グループに提供されたのと同じ食事の0.002%フルオレセインを含む段階希釈液を準備します。

標準曲線の最初の解を作成するには、0.002%フルオレセインを含む50マイクロリットルの食事を950マイクロリットルのPBSに加え、完全にボルテックスします。残りの標準曲線溶液については2倍希釈を行い、各希釈のかなり前にボルテックスします。各標準曲線溶液100マイクロリットルを、96ウェルPCRプレートの最初の列にある8つのウェルのそれぞれにピペットで移します。

麻酔をかけた、または冷凍した給餌されていない対照蚊を1匹ずつ、同じ8つの井戸のそれぞれに追加します。プレートの2列目で繰り返して、繰り返し測定を行います。100マイクロリットルのPBSを、未供給の対照群と実験群のために残った各ウェルに加えます。

ネガティブコントロールとして、プレートの次の2列の各ウェルに1匹の給餌されていない蚊を追加します。食事を提供された実験グループからの残りの井戸に、井戸ごとに1匹の蚊を追加します。ビーズミルホモジナイザーで組織を破壊する場合は、各ウェルに3mmのホウケイ酸固体ガラスビーズを追加します。

プレートを慎重に密封し、組織を破壊してから、プレートを2000RPMで1〜2分間遠心分離してライセートを収集します。各ウェルに180マイクロリットルのPBSが入った黒色の96ウェルプレートを準備します。次に、各ウェルに20マイクロリットルのライセートを加えて混合します。

485励起チャンネルと520蛍光チャンネルを備えたプレートリーダーを使用して、フルオレセイン強度を測定します。参照標準曲線を生成するには、既知の食事量を対応する蛍光強度測定値に対してプロットします。生成された参照標準曲線を使用して、実験グループの各蚊が摂取した食事量を推定します。

各実験群の個々の蛍光強度の読み取り値から、給餌されていないネガティブコントロールグループの平均蛍光強度の読み取り値を差し引いて、ベースライン組織の自家蛍光を補正します。給血実験からフルオレセインの食事サイズを測定するために、給餌されていない蚊と0.002%フルオレセインを含む既知の食事量を含む指定された参照ウェルからの蛍光測定値をプロットすることにより、標準曲線を作成しました。給餌されていない蚊のネガティブコントロールグループ、または食事を提供した蚊の実験グループのいずれかからの蚊を含む残りの井戸からの蛍光測定値を、この標準曲線と比較して、消費された食事量を定量化します。

実験群のすべての女性に血液の食事が提供されましたが、一部の蚊は餌を与え、一部の蚊は餌を与えませんでした。このプロトコルは、さまざまなタンパク質組成の食事を送達および定量するために使用できます。ここには、フッ素を添加した食事を使用して収集されたデータが示されています。

ッ素を含まない食事を提供した後、蚊に餌を与えたかどうかを目で採点する独立した実験も行われました。このプロトコルは、蚊の宿主を求める行動を調節する薬物による食事の消費量を決定するために使用されました。これらの実験では、女性に生理食塩水とATP食事とヒトNPY2受容体アゴニストを提供しました。

この手法は、0.002%フルオレセインを含む10%スクロースで飽和した綿球とグリチューブを交換することにより、蜜の摂食行動を測定するためにも使用され、グループの体重測定から正確に識別できない、より小さいまたはより変動する食事サイズを測定するために使用できることを実証しました。このプロトコルを実行する際に最も重要なことは、サンプルをイベントに整理し、給餌されていない蚊と各食事の1 MLを標準曲線を生成するために確保することです。この手順に従うと、給血後の動物の行動を観察し、消化を追跡することができます。

この方法により、研究者は遺伝子組み換え蚊の食事摂取量の変化を評価できます。また、蚊に薬を送達し、蚊が行動に及ぼす影響をテストするための、簡単で迅速かつ非侵襲的な方法も提供します。