PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

サルモネラ・チフス菌由来の酵素トリプトファン合成酵素を精製するこのプロトコールは、迅速、簡単、かつ短いです。硫酸アンモニア分画およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、野生型および変異型トリプトファン合成酵素複合体を1日で精製することができます。この技術は、タグなしタンパク質の精製に一般的に硫酸アンモニア分画クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーが使用されるため、他の関連タンパク質の精製に適用できます。

まず、10秒のパルスと20秒の休息を使用して、80%の振幅で氷水浴で20サイクル超音波処理することにより、細胞ペレットを混乱させます。細胞溶解物を30, 000倍gで25°Cで30分間遠心分離し、ペレットを脱落させずに上清を吸引する。清澄化した上清画分を0.45μmフィルターで室温でろ過します。

飽和度が20%に達するまで、少量の硫酸アンモニウムを濾液にゆっくりと加えます。硫酸アンモニウムを摂氏25度で分画し、泡を避けながら溶液を10分間穏やかに攪拌します。溶液を再度10分間遠心分離し、上清を清潔なフラスコに移してさらに使用します。

ペレットを20ミリリットルのサンプルバッファーに穏やかに再懸濁し、SDS-PAGEを実行するためのサンプルを調製します。30%の飽和度に達するまで上清に硫酸アンモニウムを加え、泡を避けて溶液を攪拌します。溶液を再度10分間遠心分離し、上清を清潔なフラスコに移してさらに使用します。

得られた40%ペレット画分を10ミリリットルのサンプルバッファー2に穏やかに再懸濁し、SDS-PAGEを実行するためのサンプルを調製します。次に、40%タンパク質サンプルを摂氏4度で20分間、10, 000倍gで微量遠心分離し、得られた上清を、毎分0.5ミリリットルの流速で高速タンパク質液体クロマトグラフィー装置に取り付けられた、以前に平衡化したHiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HRカラムにロードします。回収したピーク画分と硫酸アンモニウム分画を、Coomassie brilliant blue で染色した 12%SDS-PAGE ゲルで評価します。

野生型または突然変異型のα-2ベータ-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体を100キロダルトンの遠心フィルターで濃縮し、摂氏4度で3, 000倍gで回転させます。濃縮されたタンパク質を新鮮な2ミリリットルのチューブに移し、再び10, 000倍gで4度で10分間遠心分離して凝集体を除去します。サンプルのタンパク質濃度を決定した後、0.5ミリリットルのアリコートを1ミリリットルあたり20〜25ミリグラムで調製します。

液体窒素で急速冷凍し、マイナス80度で保存します。200ミリモルの精子の5ミリリットルの原液を水に調製し、マイナス20度で500マイクロリットルのアリコートに保管します。次に、30%ポリエチレングリコール8, 000の50ミリリットルのストック溶液を水で調製し、25ミリリットルを50ミリリットルの使い捨て遠心分離機の円錐フラスコに25ミリリットルを摂氏25度で保管します。

1モルの塩化セシウムと塩化ナトリウムの25ミリリットルの液液をそれぞれ水に調製し、摂氏25度に保ちます。1モルビシンの50ミリリットル原液を3セット調製し、水酸化セシウムまたは水酸化ナトリウムで滴定して、pH 7.6、7.8、および8の緩衝液を得ます。溶液の25ミリリットルのアリコートを摂氏4度に保ちます。

α-2β-2サルモネラ菌チフス菌トリプトファン合成酵素複合体のサンプルを氷浴中で解凍します。次に、摂氏25度で10分間、10, 000倍gで微量遠心分離します。透明な上清画分をきれいな遠心分離管に移します。

上清のタンパク質濃度を推定し、50ミリモルのビシンセシウム水酸化物またはpH 7.8のビシン水酸化ナトリウムでアリコートを1ミリグラム/ミリリットルに希釈し、50ミリモルのセシウムまたは塩化ナトリウムを含んでいます。滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに3つの24ウェルシッティングドロッププレート用に500マイクロリットルのリザーバー溶液を準備します。PEG 8, 000およびspermineの濃度を変化させ、各セットのテキスト原稿に記載されているように緩衝液のpHを変更します。

チューブをキャップし、10秒間激しく渦巻き、その後、10, 000倍gで10分間摂氏25度で遠心分離して気泡を取り除きます。各リザーバーにこの溶液を500マイクロリットル分注します。P-10マイクロピペットを使用して、5マイクロリットルのタンパク質溶液を1リットルあたり15マイクログラムで各シッティングドロップウェルに分注します。

次に、対応する各リザーバー溶液を5マイクロリットルをタンパク質ドロップに加えます。混合中は気泡を避け、ピペットで上下させないでください。最後に、プレートを透明粘着テープで覆い、25度で保管します。

結晶は2〜5日で現れ、2週間以内に完全な寸法に成長します。このプロトコルを使用して、サルモネラ菌チフス菌トリプトファン合成酵素のアルファサブユニットとベータサブユニットを修飾されたpET SUMOベクターにサブクローニングしました。ここでは、His6-SUMO-αおよびHis6-SUMO-βトリプトファン合成酵素融合タンパク質に対応する2つの強いバンドの代表的なSDS-PAGE結果を示します。

各タンパク質は、ニッケル-ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーと硫酸アンモニウム沈殿法により精製した後、His-SUMOタグ切断、His-SUMOタグ痕跡の除去、およびタンパク質濃度測定を行いました。ここでは、SEC上のαサブユニット、βサブユニット、およびα-2β-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体の溶出プロファイルと、それらのピーク画分の純度を示します。トリプトファン合成酵素複合体の変異型を生成した後、硫酸アンモニウム分画を使用して、異種発現系から汚染物質タンパク質を除去しました。

ここでは、排除クロマトグラフィーカラム上のα-2β-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体の相対的な溶出位置の代表的な溶出プロファイルを示します。除外されたピーク画分の純度は、プーリング前に SDS-PAGE を使用して分析しました。大きな単結晶は、PEG 8,000、スペルミン濃度、およびビシン緩衝液のpHを変化させることによる微細結晶化の最適化によって得られました。

形態の異なる結晶は2〜5日で出現し、2週間でフルサイズに成長しました。野生型α-2β-2サルモネラ・チフス菌トリプトファン合成酵素複合体の結晶構造の電子密度マップの検証は、結晶構造の精緻化後に解明された。このプロトコールを実施する際には、トリプトファン合成酵素の活性損失を防ぐために、できるだけ早く室温での初期精製ステップを完了してください。

変異体の結晶構造は、L-トリプトファン合成における主要な残基が果たすメカニズムと役割について新たな洞察を提供することが期待されます。