Name: PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶSalmonella typhimurium由来トリプトファン合成酵素の高速精製法。硫酸アンモニウム分画とゲル濾過クロマトグラフィーを用い、野生型および変異型タンパク質複合体を1日で精製可能です。他の非タグタンパク質にも応用できます。

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この研究は、米国国立衛生研究所(GM097569)によって支援されました。

<ol><li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li>
<li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+mine+for+enzymologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li>
<li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li>
<li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protozoan+genomics+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li>
<li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li>
<li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize%2C+two+evolutionarily+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li>
<li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li>
<li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%2C+a+two-component+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li>
<li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification%2C+crystallization%2C+and+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li>
<li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li>
<li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li>
<li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li>
<li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li>
<li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li>
<li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86%2C+lysine+87%2C+arginine+148%2C+cysteine+170%2C+and+cysteine+230%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li>
<li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+K%2B+or+Cs%2B+for+Na%2B+induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+mutant+%28betaK87T%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li>
<li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li>
<li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crystallography+of+a+true+substrate%2C+indole-3-glycerol+phosphate%2C+bound+to+a+mutant+%28alphaD60N%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li>
<li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li>
<li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li>
<li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium%3A+On+the+roles+of+beta+%282%29+subunit+Lys-382%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li>
<li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+replacement+with+MOLREP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).</li>
<li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+content+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li>
<li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coefficient+probabilities%3A+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins%2C+DNA%2C+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を開示し、宣言するものは何もありません。

2 β 2 βの変異型α、α 2 β 2βK167T、α 2 β 2βS377A StTS複合体の構造機能相関研究に成功しました。 当初、我々は、精製中にPEG8000とスペルミンでα 2 β 2StTS複合体結晶化を必要とする以前の精製プロトコル22を用いて変異体を精製しようと試みた。結晶化速度は、変異体の形態および溶液中の複合体の濃度に依存するが、結晶が大きな溶液体積に現れる時期を予測することは困難である。結晶化は、長い期間(48-96時間)後、または結晶化開始15後にPEG 8000の余分な量を添加する必要があるいずれかの達成することができる。
残念ながら、本研究で提示された2stTS複合体β α 2の変異形態は、プロトコルの初期ステップ中に結晶化に失敗し...

トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核4、生殖器および眼感染症5の治療のための潜在的な薬物標的として探求されてきた。 αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。
α2β2StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌α 2 β 2TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット8、9、単離βサブユニット10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット12からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム12上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析13を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリα 2 β 2TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。
新規研究では、S.チフィムリウムα 2 β 2TS複合体の組換えおよび野生型形態を精製し、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体15の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量のα 2 β 2StTS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法15に成長した。当時のα 2 β 2StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。 
ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。

<table><tbody><tr><td>15 mL 10 kDaフィルター</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC901024</td><td>遠心フィルターユニット</td></tr><tr><td>15 mL 100 kDaフィルター</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td>遠心フィルターユニット</td></tr><tr><td>2 mL 極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>CLS430489</td><td>極低温バイアル</td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-141</td><td>微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>24ウェルCryschem プレート</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR3-158</td><td>24ウェルシッティングドロッププレート</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3446I-100</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離機コニカルチューブ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>12-565-270</td><td>遠心分離コニカルチューブ</td></tr><tr><td>AB15 ACCUMET ベーシック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-636-AB15</td><td>pHメーター</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1356-100</td><td>アガロースゲル</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A702-500</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>・アンピシリン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP1760-5</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>バクテリア・インキュベーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S35836</td><td>インキュベーター。</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ニューイングランド Biolabs</td><td>R0136S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>ビシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2646100</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ブランソン 450 デジタルソニファイア</td><td>ブレイソン</td><td>B450</td><td>細胞破壊器</td></tr><tr><td>塩化セシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP210-100</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>水酸化セシウム</td><td>アクロス オーガニック AC213601000</td><td></td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP904-100</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1391</td><td>化学</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP172-5</td><td>化学</td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>F530S</td><td>HF ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>dNTP セット</td><td>Invitrogen</td><td>10-297-018</td><td>dNTPs セット</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311-100</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>エクセラ E25R オービタルシェーカー</td><td>エッペンドルフ ニューブランズウィック</td><td>M1353-0004</td><td>オービタルインキュベーター</td></tr><tr><td>GE AKTA Prime Plus</td><td>GE ヘルスケア</td><td>8149-30-0004</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td>DNA精製キット</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>His-Trap columns</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5255-01</td><td>5 mL Histrap column</td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Fisher Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisherサイエンティフィック</td><td>R0392</td>イン<td>デューサー</td></tr><tr>カナ<td>マイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP906-5</td><td></td></tr>抗生物質<tr><td>ケルビネーターシリーズ-100</td>ケル<td>ビネーター</td><td>製造中止</td>超<td>低冷凍LB</td></tr><tr><td>ブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1426-500</td>液体<td>ブロス</td></tr>ル<tr><td>リアベルタニ寒天</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP1425-2</td><td>固体ブロス</td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーScientific</td><td>S271-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0193S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>Ni-NTA アフィニティービーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R90115</td><td>Ni-NTA アガロースビーズ</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP233-100</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>44-865-0</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>ピリドキサールリン酸</td><td>アクロス有機AC228170010</td><td></td><td>化学</td></tr><tr><td>S-200 HR</td><td>サイティバ</td><td>45-000-196</td><td>サイズ排除列</td></tr><tr><td>SacI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0156S</td><td>制限酵素</td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318-100化学</td><td>薬</td></tr>品<tr><td>Sorvall RC-5B遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1004</td><td>床cetrifuge</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Acros Organics</td><td>AC132750010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Superdex 200 prep grade</td><td>Cytiva</td><td>45-002-491</td><td>サイズ排除カラム</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202S</td><td>DNAリエーゼ</td></tr><tr><td>トリス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>Ubl特異的プロテアーゼ 1</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>12588018</td><td>SUMOプロテアーゼ</td></tr></tbody></table>

pcr変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

サルモネラチフィムリウム由来のトリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2 TS)を用いた構造研究が行われ、その触媒機構、アロステリック挙動、およびPLP依存酵素における生成物への酵素的形変換の詳細を理解することが行われている。本研究では、単離されたαおよび単離されたβサブユニットを生成する新規発現系により、2日以内に分離されたサブユニットから2 β st TS複合体をα大量に精製した。精製は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより行い、続いて親和性タグの切断、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。β部位の酵素における重要な残基の役割をよりよく理解するために、部位特異的突然変異誘発は、以前の構造研究で行われた。野生型および変異型α 2stTS複合体βを精製する別のプロトコルが作成されました。硫酸アンモニウム分画とSECを用いたシンプルで高速かつ効率的なプロトコルにより、1日で2stTS複合体α 2 β精製が可能になりました。この研究で説明した両方の精製プロトコルは、PEG 8000およびシュペルミンを使用して同じ複合体を精製する前のプロトコルと比較して、精製プロトコルに沿ってα 2 β 2StTS複合体を結晶化する場合にかなりの利点を有する。野生型および変異型の結晶化は、わずかに異なる条件下で生じ、PEG 8000およびスペルミンを用いた一部の変異体の精製を損なう。X線結晶学研究に適した結晶を調製するために、結晶化、結晶質、および凍結保護を最適化するためにいくつかの努力がなされた。ここで提示される方法は、一般に、2st TS複合体のトリプトファン合成酵素サブユニットおよび野生型および変異型α 2 β 2の精製に適用されるべきである。

トリプトファン合成酵素のαとβサブユニットの精製 α-subunit(αSt TS)およびサルモネラ・チフィムリウム・トリプトファンシンターゼのβサブユニット(β StTS)を、改変pET SUMOベクター中でサブクローニングした。 図1Aは、His6-SUMO-α St TS(lane αON)およびHis6-SUMO-β St TS(レーンβON)融合タンパク質に対応する2つの強いバンドの代表的なSDS-PAGE結果を示す。本研究で説明した精製プロトコルにより、2日以内に両方のサブユニットを個別に精製することができた。最初の日は、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、続いてHis-SUMOタグ切断、His-SUMOタグの痕跡の除去、...

本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、 大腸菌におけるタンパク質発現、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化である。

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

サルモネラ・チフス菌由来の酵素トリプトファン合成酵素を精製するこのプロトコールは、迅速、簡単、かつ短いです。硫酸アンモニア分画およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、野生型および変異型トリプトファン合成酵素複合体を1日で精製することができます。この技術は、タグなしタンパク質の精製に一般的に硫酸アンモニア分画クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーが使用されるため、他の関連タンパク質の精製に適用できます。まず、10秒のパルスと20秒の休息を使用して、80%の振幅で氷水浴で20サイクル超音波処理することにより、細胞ペレットを混乱させます。細胞溶解物を30, 000倍gで25°Cで30分間遠心分離し、ペレットを脱落させずに上清を吸引する。清澄化した上清画分を0.45μmフィルターで室温でろ過します。飽和度が20%に達するまで、少量の硫酸アンモニウムを濾液にゆっくりと加えます。硫酸アンモニウムを摂氏25度で分画し、泡を避けながら溶液を10分間穏やかに攪拌します。溶液を再度10分間遠心分離し、上清を清潔なフラスコに移してさらに使用します。ペレットを20ミリリットルのサンプルバッファーに穏やかに再懸濁し、SDS-PAGEを実行するためのサンプルを調製します。30%の飽和度に達するまで上清に硫酸アンモニウムを加え、泡を避けて溶液を攪拌します。溶液を再度10分間遠心分離し、上清を清潔なフラスコに移してさらに使用します。得られた40%ペレット画分を10ミリリットルのサンプルバッファー2に穏やかに再懸濁し、SDS-PAGEを実行するためのサンプルを調製します。次に、40%タンパク質サンプルを摂氏4度で20分間、10, 000倍gで微量遠心分離し、得られた上清を、毎分0.5ミリリットルの流速で高速タンパク質液体クロマトグラフィー装置に取り付けられた、以前に平衡化したHiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HRカラムにロードします。回収したピーク画分と硫酸アンモニウム分画を、Coomassie brilliant blue で染色した 12%SDS-PAGE ゲルで評価します。野生型または突然変異型のα-2ベータ-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体を100キロダルトンの遠心フィルターで濃縮し、摂氏4度で3, 000倍gで回転させます。濃縮されたタンパク質を新鮮な2ミリリットルのチューブに移し、再び10, 000倍gで4度で10分間遠心分離して凝集体を除去します。サンプルのタンパク質濃度を決定した後、0.5ミリリットルのアリコートを1ミリリットルあたり20〜25ミリグラムで調製します。液体窒素で急速冷凍し、マイナス80度で保存します。200ミリモルの精子の5ミリリットルの原液を水に調製し、マイナス20度で500マイクロリットルのアリコートに保管します。次に、30%ポリエチレングリコール8, 000の50ミリリットルのストック溶液を水で調製し、25ミリリットルを50ミリリットルの使い捨て遠心分離機の円錐フラスコに25ミリリットルを摂氏25度で保管します。1モルの塩化セシウムと塩化ナトリウムの25ミリリットルの液液をそれぞれ水に調製し、摂氏25度に保ちます。1モルビシンの50ミリリットル原液を3セット調製し、水酸化セシウムまたは水酸化ナトリウムで滴定して、pH 7.6、7.8、および8の緩衝液を得ます。溶液の25ミリリットルのアリコートを摂氏4度に保ちます。α-2β-2サルモネラ菌チフス菌トリプトファン合成酵素複合体のサンプルを氷浴中で解凍します。次に、摂氏25度で10分間、10, 000倍gで微量遠心分離します。透明な上清画分をきれいな遠心分離管に移します。上清のタンパク質濃度を推定し、50ミリモルのビシンセシウム水酸化物またはpH 7.8のビシン水酸化ナトリウムでアリコートを1ミリグラム/ミリリットルに希釈し、50ミリモルのセシウムまたは塩化ナトリウムを含んでいます。滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに3つの24ウェルシッティングドロッププレート用に500マイクロリットルのリザーバー溶液を準備します。PEG 8, 000およびspermineの濃度を変化させ、各セットのテキスト原稿に記載されているように緩衝液のpHを変更します。チューブをキャップし、10秒間激しく渦巻き、その後、10, 000倍gで10分間摂氏25度で遠心分離して気泡を取り除きます。各リザーバーにこの溶液を500マイクロリットル分注します。P-10マイクロピペットを使用して、5マイクロリットルのタンパク質溶液を1リットルあたり15マイクログラムで各シッティングドロップウェルに分注します。次に、対応する各リザーバー溶液を5マイクロリットルをタンパク質ドロップに加えます。混合中は気泡を避け、ピペットで上下させないでください。最後に、プレートを透明粘着テープで覆い、25度で保管します。結晶は2〜5日で現れ、2週間以内に完全な寸法に成長します。このプロトコルを使用して、サルモネラ菌チフス菌トリプトファン合成酵素のアルファサブユニットとベータサブユニットを修飾されたpET SUMOベクターにサブクローニングしました。ここでは、His6-SUMO-αおよびHis6-SUMO-βトリプトファン合成酵素融合タンパク質に対応する2つの強いバンドの代表的なSDS-PAGE結果を示します。各タンパク質は、ニッケル-ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーと硫酸アンモニウム沈殿法により精製した後、His-SUMOタグ切断、His-SUMOタグ痕跡の除去、およびタンパク質濃度測定を行いました。ここでは、SEC上のαサブユニット、βサブユニット、およびα-2β-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体の溶出プロファイルと、それらのピーク画分の純度を示します。トリプトファン合成酵素複合体の変異型を生成した後、硫酸アンモニウム分画を使用して、異種発現系から汚染物質タンパク質を除去しました。ここでは、排除クロマトグラフィーカラム上のα-2β-2サルモネラチフス菌トリプトファン合成酵素複合体の相対的な溶出位置の代表的な溶出プロファイルを示します。除外されたピーク画分の純度は、プーリング前に SDS-PAGE を使用して分析しました。大きな単結晶は、PEG 8,000、スペルミン濃度、およびビシン緩衝液のpHを変化させることによる微細結晶化の最適化によって得られました。形態の異なる結晶は2〜5日で出現し、2週間でフルサイズに成長しました。野生型α-2β-2サルモネラ・チフス菌トリプトファン合成酵素複合体の結晶構造の電子密度マップの検証は、結晶構造の精緻化後に解明された。このプロトコールを実施する際には、トリプトファン合成酵素の活性損失を防ぐために、できるだけ早く室温での初期精製ステップを完了してください。変異体の結晶構造は、L-トリプトファン合成における主要な残基が果たすメカニズムと役割について新たな洞察を提供することが期待されます。

pcr-mutagenesis-cloning-expression-fast-protein-purification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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