予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

このプロトコルは非常に効率的で汎用性があります。ほぼすべての膜タンパク質に適用でき、すべての製造手順が1日以内に完了します。合成された膜タンパク質は、供給されたリガンドによってすでに共翻訳的に安定化することができます。

界面活性剤との接触は完全に回避され、タンパク質は提供されたカスタマイズされた膜環境に直接挿入および折り畳まれます。構造的アプローチ、機能特性評価、抗体作製は、主要な応用分野です。さらに、この手法は、膜タンパク質のフォールディングと機能に対する脂質の影響を分析するのに簡単です。

培養の3日目に、100ミリリットルの予備培養物を含む15リットルの攪拌タンク反応器に10リットルの無菌摂氏37度YPTG培地を接種します。そして、摂氏37度で毎分500回転の高曝気で細菌を培養します。過度の泡立ちを防ぐために、滅菌消泡剤を追加してください。

細胞が中対数期に達したら、培養物に300ミリリットルのエタノールを加え、細胞を摂氏42度で毎分500回転させ、さらに45分間高曝気でインキュベートします。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を回収し、スパチュラとピペットを使用して細胞を300ミリリットルのS30A緩衝液に再懸濁します。再懸濁した細菌を2回遠心分離し、1回の洗浄で300ミリリットルの新鮮なS30Aでペレットを洗浄します。

2回目の洗浄後、細胞を1.1容量のS30Bバッファーに再懸濁します。懸濁液を予冷されたフレンチプレス圧力セルにロードし、1平方インチゲージあたり1,000ポンドでセルを1回破壊します。不安定な成分を除去し、リボソームからmRNAを放出するには、ライセートを0.4モルの塩化ナトリウムに調整し、サンプルを摂氏42度のウォーターバスで45分間インキュベートします。

膜足場タンパク質ナノディスクを組み立てるには、MSP1E3D1溶液と脂質溶液を混合し、DPCを最終濃度0.1%まで添加し、表に従って反応を適切な最終量に調整し、穏やかに攪拌しながら21°Cで1時間反応をインキュベートします。インキュベーションの終了時に、透析カセットのメンブレンを椎間板形成バッファーで事前に湿潤させ、シリンジを使用してアセンブリ混合物をカセットにロードします。次に、3つの5リットル容量のディスク形成バッファーに対する反応を室温で10〜20時間攪拌しながら透析した後、混合物を分子量10キロトンのカットオフでディスク形成バッファー平衡遠心フィルターユニットに移します。

次に、UV-Visリーダーを使用した遠心分離により、反応を少なくとも300マイクロモルに濃縮し、濃度を測定します。3ミリリットルの連続交換無細胞反応を調製するには、3ミリリットルの透析カセットの膜を100ミリモルのトリス酢酸で平衡化します。そして、シリンジを使用して反応混合物をカセットに移します。

シリンジを使用して、反応混合物コンパートメントから余分な空気を取り除き、カセットを透析チャンバーに入れます。チャンバーに60ミリリットルの供給混合物を入れ、チャンバーに蓋をします。蓋を固定した後、チャンバーを摂氏30度で12〜16時間、毎分200回転でインキュベー

マグネシウムイオンスクリーニング用の60マイクロリットルの細胞交換無細胞反応セットアップを調製するには、新たに調製した3X Master Mixを60マイクロリットルを反応混合物に加え、825マイクロリットルをフィーディング混合物に加えます。そして、給餌混合物を水で満たします。ボルテックス後、825マイクロリットルの供給混合物を24ウェルマイクロプレートの3つのウェルのそれぞれに加えます。

分子量10〜14キロトンのカットオフで再生したセルロース透析チューブを約25×20mmサイズに切断し、0.05%アジ化ナトリウムを添加した水で保存します。ミニセル交換無細胞容器を組み立てる前に、透析メンブレンから余分な水分を組織で取り除き、各容器にメンブレン片を1つずつ置きます。メンブレンをポリテトラフルオロエチレンリングで固定し、ミニコンテナを1つのウェルに供給混合物に移します。

表に示されているように、反応混合物に高分子成分を添加し、ピペッティングで混合します。反応容器に60マイクロリットルの反応混合物を追加し、気泡を避けます。そして、24ウェルプレートの周りにシーリング熱可塑性フィルムの8 x 10センチメートルのシートを2枚巻き付けます。

ウェルプレートの蓋をテープで固定し、プレートを摂氏30度で毎分200回転させ、12〜16時間攪拌します。翌朝、ピペットチップを使用して、ミニセル交換無細胞容器で透析膜を貫通し、反応混合物を吸引します。反応混合物を新しい遠心分離チューブに移し、遠心分離して沈殿物を除去します。

次に、上清を新しいチューブに移します。ここでは、ファインチューニング反応化合物が合成された膜タンパク質の最終収量または品質に及ぼす代表的な影響を示しています。この分析では、T-β-oneアドレナリン作動性受容体の全体的な合成とナノディスク可溶化は、分析されたすべての膜組成で類似していました。

対照的に、合成されたGタンパク質共役型受容体の品質にははるかに高い変動が検出され、DMPC脂質とPOPC脂質で得られた活性は最も低く、DOPGとPOPGを適用したときに最も活性が高かった。まとめると、これらの結果は、脂質ヘッドグループの電荷と脂肪酸鎖の柔軟性が、この細胞膜タンパク質の折り畳みと活性の重要な調節因子であることを示しています。最終的なナノディスク濃度も、膜タンパク質の品質にとって重要な要素となり得ます。

例えば、ナノディスク濃度を3.75〜60マイクロモルの範囲でスクリーニングすると、約30マイクロモルのナノディスクでGタンパク質共役受容体の完全な可溶化が得られ、膜タンパク質とナノディスクの比率が1対3になります。対照的に、プロテオロドプシンの完全な可溶化は、約10マイクロモルのナノディスクで達成でき、10対1のプロテオロドプシンとナノディスクの比率が得られます。正確なピペッティングと高品質のコンポーネントは確かに必須です。

ライセート調製の重要なステップは、中対数期の細胞を回収し、高塩分ステップを適用することです。この技術は、膜タンパク質合成の複雑さを大幅に軽減します。これまで困難だった標的を効率的に合成することで、これまで未解明の薬学的意義のあるタンパク質の分子構造に取り組むことが可能になりました。