Name: 予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶ 膜タンパク質の共翻訳挿入法。ナノディスクを用いて界面活性剤を回避し、1日で効率的に合成・折りたたみを行い、構造解析や機能評価に応用する革新的な生化学的手法です。

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ドイツ科学研究センター(DFG)助成金BE1911/8-1、ロエベプロジェクトGLUE、および膜を越えた輸送と通信共同研究センター(SFB807)の財政支援に感謝します。

<ol><li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li>
<li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li>
<li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li>
<li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li>
<li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li>
<li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+expression%3A+no+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li>
<li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters%2C+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li>
<li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein%2C+forming+soluble+nanolipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors%3A+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li>
<li>Rues, R. B., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor%2Fnanodisc+complexes+with+different+lipid+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li>
<li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li>
<li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li>
<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li>
<li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li>
<li>Rues, R. B., Dong, F., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li>
<li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., Dötsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li>
<li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li>
<li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li>
<li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li>
<li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li>
<li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E.+coli+S30+lysate+proteome%3A+A+prototype+for+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li>
<li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li>
<li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4%3A+Linkages+in+substrate+binding%2C+spin+state%2C+uncoupling%2C+and+product+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li>
<li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li>
<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li>
<li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes%3A+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

CF発現とナノディスクへの機能性MPの共翻訳挿入を最適化するためのセットアップと戦略について説明します。必要な機器は、バイオリアクター、フレンチプレス装置など、UV/VISおよび蛍光リーダー、2コンパートメント構成のセットアップに適したCF反応容器、および温度制御されたインキュベーターで構成されます。さらに標準的な装置は、大腸菌細胞を回収するための遠心分離機と、S30溶解物を調製するための少なくとも30,000 x gに達する卓上遠心分離機です。S80-S100ライセートを調製する必要がある場合は、超遠心分離機が必要です。記載されている機器は生化学ラボで定期的に入手可能であり、CF発現を開始するために大きな初期投資は必要ありません。さらに、CFライセートおよびT7RNAP調製物のための大腸菌細胞の発酵および取り扱いは、一般的で堅牢な技術である。最も高価な化合物は、CFライセート、T7RNAP、およびナノディスクです。信頼性が高く効率的なプロトコルで調製でき、アリコートは-80°Cで何年も安定しています。 このプロトコルは、CFライセートとT7RNAPの調製にそれぞれ3日、MSPの発現...

膜タンパク質(MP)は、水性環境に不溶であるため、タンパク質生産研究において困難な標的です。従来のMP生産プラットフォームは、 大腸菌、酵母、真核細胞などの細胞ベースのシステムで構成されています。合成された組換えMPは、細胞膜から抽出されるか、封入体1からリフォールディングされます。界面活性剤の可溶化後、MPは、確立されたin vitro再構成プロトコルによって適切な膜環境に移すことができます。小胞およびリポソームに加えて、MPはナノディスク2 またはサリプロ3 粒子の形態の平面膜に再構成され、最近では日常的な技術となっている。ただし、これらの戦略はすべて、MPとの界面活性剤の接触を意味し、不安定化、オリゴマーの解離、さらにはタンパク質の構造と活性の喪失を引き起こす可能性があります4。したがって、最適な洗剤の可溶化および再構成条件のスクリーニングは、面倒で時間がかかる場合があります5。
無細胞(CF)系の開放性により、発現反応は、定義された脂質組成を有する予め形成された膜で直接供給される。この脂質ベースの発現モード(L-CF)では、合成されたMPは、提供された二重層6,7に共翻訳的に挿入する機会を有する(図1)。平面脂質二重層ディスク8を取り囲む膜足場タンパク質(MSP)からなるナノディスクは、この戦略に特に適していると思われる9、10。ナノディスクは、さまざまな脂質を使用してin vitroで日常的に組み立てることができ、非常に安定しており、ストックは最大1 mMまで濃縮できます。しかしながら、大腸菌におけるMSP発現およびその精製は必要である。代替戦略として、MSPは、リポソーム11、12、13と共に供給されるCF反応において標的MPと共に共発現され得る。MSPとMPの両方のDNAテンプレートが反応に添加され、発現時にMP/ナノディスクが形成されます。MSP産生は回避されますが、共発現戦略では最終的なDNAテンプレート濃度の慎重な微調整が必要であり、サンプル産生効率のより高い変動が予想されます。
予め形成されたナノディスクの膜へのMPの共翻訳挿入は、トランスロコン機構およびシグナル配列から独立した非生理学的でまだほとんど知られていないメカニズムである13,14,15,16。挿入効率の主な決定要因は、膜タンパク質の種類と提供された膜の脂質組成であり、負に帯電した脂質が頻繁に好まれます15,17。ナノディスク膜はサイズが比較的限られているため、MP挿入時にかなりの量の脂質が放出されます18。ナノディスクサイズの変動は、より高いオリゴマーMP複合体の挿入および調整を可能にする15,18。とりわけ、ホモオリゴマー複合体の正しい集合は、イオンチャネルKcsA、イオンポンププロテオロドプシン(PR)、および多剤トランスポーターEmrE15,18について示されました。MPは、対称ナノディスク膜に両側から比較的等しい周波数で入る可能性があります。したがって、1つのナノディスクに挿入された異なるモノマーまたはオリゴマーは、反対の配向を有する可能性があることを考慮する必要があります。しかし、配向の偏りは、PR六量体およびKcsA四量体の形成について報告されているように、協同的な挿入機構によって引き起こされる可能性があります18。MP配向のさらなるバイアスは、おそらくナノディスク膜の縁に挿入されたMPの配向スイッチに起因する可能性があります。
大腸菌株からのCFライセートの製造は、信頼できるルーチン技術であり、ほぼすべての生化学実験室で実施することができる19,20。ジスルフィド架橋形成に加えて、MPが大腸菌溶解物を用いて合成される場合、他のほとんどの翻訳後修飾は存在しないと考えられるべきである。これにより、構造研究のためにより均質なサンプルが生成される可能性がありますが、個々のMPターゲットの機能に対する潜在的な影響を排除する必要がある場合があります。しかし、大腸菌CFライセート中のGタンパク質共役受容体(GPCR)14,21,22、真核生物トランスポーター23、または大型ヘテロマーアセンブリ24の高品質サンプルを効率的に生産することは、複雑な標的にも適していることを示しています。サンプルの分取スケール量(≈ 1 mg/mL)は、反応混合物(RM)と供給混合物(FM)コンパートメントで構成される2コンパートメント連続交換セルフリー(CECF)構成で得ることができます。FM体積はRM体積を15〜20倍超え、低分子量エネルギー化合物および前駆体19のリザーバを提供する。したがって、発現反応は数時間延長され、MPターゲットの最終収率が増加します。RMコンパートメントとFMコンパートメントは、10〜14 kDaのカットオフを備えた透析膜によって分離されています。2つのコンパートメントには、CECF反応容器の特別な設計が必要です(図1)。FMを保持するテーラードプレキシガラス容器と組み合わせたRM容器としての市販の透析カセットが好適な例である。MP収量は、RM:FM比を変更するか、一定期間のインキュベーション後にFMを交換することによってさらに操作できます。
MPの収率と品質には、反応パラメータの徹底的な最適化が求められることがよくあります。CF発現の重要な利点は、MPの個々の要件に応じてほぼすべての化合物を修正および微調整できることです。簡単な戦略は、最初に基本的な生産プロトコルを確立してMPの歩留まりを向上させることに焦点を当て、次に反応と折り畳み条件を微調整することによってMPの品質を最適化することです。CFライセートに生理学的プロセスがなく、複雑さが軽減されているため、MP25の効率的な生産の成功率が高くなっています。DNAテンプレートの設計およびMg2+イオン濃度の最適化に関する日常的な考慮事項は、ほとんどの場合、満足のいく収率を得るのに十分である26。発現モードによっては、より多様なパラメータをスクリーニングする必要があるため、MP品質の最適化に時間がかかる場合があります14、17、22。
記載されたCF発現プラットフォームを確立するには、 大腸菌 CFライセート(i)、T7 RNAポリメラーゼ(ii)、ナノディスク(iii)、および塩基性CECF反応化合物(iv)の生産にプロトコルが必要です(図1)。 大腸菌 K12株A1927 またはBL21誘導体は、効率的なS30(30,000 x gでの遠心分離)溶解物の調製に頻繁に使用されます。S30溶解物に加えて、他の g力で遠心分離された対応する溶解物(例えばS12)が使用され得る。ライセートは、発現効率とプロテオームの複雑さが異なります。記載されたプロトコルによって調製されたS30ライセートのプロテオームは、詳細に研究されている28。S30プロテオームには、イオンチャネルの発現および分析時にバックグラウンドの問題を引き起こす可能性のある残留外膜タンパク質がまだ含まれています。このようなターゲットには、S80-S100ライセートの使用が推奨されます。ライセート調製中の貴重な変更は、細胞の対数増殖期半ばでの熱ショックとエタノール供給の組み合わせによるSOS応答の誘導です。得られたHS30ライセートはシャペロンに富んでおり、MPフォールディングを改善するためにS30ライセートとのブレンドで使用することができる22。 大腸菌 ライセートにおけるCF発現は、T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)によって制御されるプロモーターを含むDNAテンプレートとの共役転写/翻訳プロセスとして操作されます。この酵素は、pAR1219プラスミド29を保有するBL21(DE3)スター細胞で効率的に生産することができます。
MSP1E3D1の2つのコピーは、直径10〜12nmの1つのナノディスクに集合するが、以下に説明するプロトコルは、他のMSP誘導体に対しても機能する可能性がある。ただし、MSP1E3D1で形成されたナノディスクよりも大きいナノディスクは安定性が低下する傾向があり、MSP1などのMSP誘導体で形成された小さなナノディスクは、より大きなMPまたはMP複合体に対応できない可能性があります。MSP1E3D1ナノディスクは、多種多様な異なる脂質または脂質混合物を用いてin vitroで組み立てることができます。予め形成されたナノディスクは通常、-80°Cで>1年間安定ですが、安定性は脂質成分によって異なる場合があります。MPの折り畳みと安定性に対する脂質効果のスクリーニングのためには、代表的な種類の脂質/脂質混合物で組み立てられたナノディスクの包括的なセットを準備する必要があります。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(DMPG)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(POPG)および1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)。
3 mL CECF反応を調製するためのプロトコルについて説明します。1:1の比率でさらに拡大または縮小することが可能です。2コンパートメントCECF構成の場合、すべての化合物を含むRMと低分子量化合物のみを含むFMを準備する必要があります。10〜14 kDa MWCOの市販の3 mL透析装置はRM容器として使用でき、RM容器はFMを保持するカスタムメイドのプレキシガラス容器に入れられます(図1D)30。RM:FMの比率は1:20であるため、3 mL RMに対して60 mLのFMを準備する必要があります。 いくつかの成分の品質、濃度、または種類は、合成されたMPの最終的な収率および/または品質にとって重要な場合があります(表1)。DNAテンプレートは、公表されたガイドラインに従って調製されるべきであり、ターゲットのリーディングフレームのコドン最適化は、生成物収率をさらに有意に改善することができる26。分取スケールCECF反応について、PRの産生のための確立されたプロトコルが記載されている。新しいMPの発現プロトコルを確立するには、通常、収率と品質を向上させるために、特定の化合物の最適化スクリーニングを実行する必要があります(表1)。Mg2+ イオンについては、異なるDNAテンプレートに対して有意な変動を頻繁に示す、焦点を絞った最適な濃度が存在する。T7RNAPまたはS30ライセートの新しいバッチなどの他のCF反応化合物は、最適なMg2+ 濃度をさらにシフトさせる可能性があります。一例として、14〜24mMの濃度の範囲内でかつ2mMのステップで典型的なMg2+ スクリーンが説明される。各濃度は、二重および分析スケールのCECF反応でスクリーニングされます。CECF反応容器として、RMを保持するカスタムメイドのMini−CECFプレキシグラス容器30 が、FMを保持する標準的な24ウェルマイクロプレートと組み合わせて使用される(図1B)。あるいは、96深さウェルマイクロプレートまたは他の市販の透析装置と組み合わせた市販の透析カートリッジを適切なセットアップで使用してもよい(図1C)。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール) (ナトリウム塩) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (ナトリウム塩) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (ナトリウム塩) (DOPG)</td><td></td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (ナトリウム塩) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-プロパン-1,3-ジオール (トリス)</td><td>カール・ロス (ドイツ)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>カール・ロス (ドイツ)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>カール・ロス (ドイツ)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[3H]-ジヒドロアルプレノロール塩</td>酸塩 <td>アメリカ放射性標識化学品 (米国)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>アセチルリン酸リチウムカリウム塩 (ACP)</td><td>メルク (ドイツ)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (ドイツ)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>アルプレノロール塩酸塩</td><td>Merck (ドイツ)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>陰イオン交換クロマトグラフィー カラム材料: Q-セファロース&reg;</td><td>Sigma-Aldrich (ドイツ)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sorvall RC12BP+;Thermo Scientific(ドイツ);ソルバルRC-5C;Thermo Scientific(ドイツ);ミクロ 22 R;Hettich (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ 500 ml バッフルフラスコ、2 l バッフルフラスコ</td><td>Schott Duran (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5'-trirholing 二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich (ドイツ)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース一水和物</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム水素三水和物</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO 標準 RC チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (ドイツ)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>カール・ロス (ドイツ)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>カールロス(ドイツ)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸カルシウム塩水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ(ドイツ)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>フランスの圧力セルディスラプ</td><td>ターSLM;Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5'-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>・カール・ロス(ドイツ)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>・カール・ロス(ドイツ)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-グリシン</td><td>・カール・ロス(ドイツ)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>・カールRoth (ドイツ)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 透析ユニット</td><td>Scienova (ドイツ)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-ドデシルホスホコリン</td><td>Antrace (米国)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE チャンバー: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE ゲルキャスティングシステム: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGEゲル電源:Power Pac 3000</td><td>Biorad(ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カゼインからのトリプトン/ペプトン</td>Carl <td>Roth(ドイツ)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ:ip-12</td><td>Ismatec(ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸モノカリウム塩</td><td>Sigma Aldrich(ドイツ)</td><td>860077</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二水素カリウム</td><td>Carl Roth(ドイツ)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸キナーゼ</td><td>・ロシュ(ドイツ)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションカウンター:Hidex 300 SL</td><td>Hidex(フィンランド)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDSペレット</td><td>カール・ロス(ドイツ)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich (ドイツ)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Carl Roth (ドイツ)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 Nanodrop</td><td>Peqlab (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計/蛍光リーダー Spark&reg;</td><td>Tecan (スイス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5'-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>カール・ロート(ドイツ)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

無細胞発現システムにより、膜タンパク質などの複雑なタンパク質の機能的フォールディングをサポートするために、反応環境を調整して設計することができます。ナノディスクとして供給される事前に形成され定義された膜への膜タンパク質の共翻訳挿入および折り畳みの実験手順が実証されています。このプロトコルは完全に洗剤を含まず、1日以内にミリグラムの精製サンプルを生成できます。得られた膜タンパク質/ナノディスクサンプルは、結晶化、核磁気共鳴、電子顕微鏡などのさまざまな機能研究や構造応用に使用できます。無細胞溶解物、設計されたメンブレンを備えたナノディスク、重要なストック溶液、および2コンパートメント無細胞発現反応の組み立てなどの基本的な主要コンポーネントの調製について説明します。膜タンパク質のフォールディング要件は非常に多様であるため、このプロトコルの主な焦点は、重要な塩基性反応化合物、ナノディスクの膜組成、酸化還元およびシャペロン環境、DNAテンプレート設計など、サンプル品質にとって重要なパラメーターと反応ステップの調節です。全過程は、プロテオロドプシンおよびGタンパク質共役受容体の合成によって実証される。

合成されたMPの最終的な収率または品質に対する微調整反応化合物の影響が例示されます。頻繁に日常的なアプローチは、システム効率の便利なモニターとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってCF反応における最適なMg2+濃度を調整することです。一例として、GFPはpET-21a(+)ベクターから14〜24 mMのMg2+濃度で合成されました(図2)。SDS-PAGE分析により、CF反応上清の相補的な蛍光測定(485 nmでの励起、535 nmでの発光測定)とよく一致する20 mMでの最適なMg2+濃度が特定されました(図2A)。pIVEX 2.3ベクターから発現した細菌PRおよびpET-21a(+)ベクターから発現するシチメンチョウβ 1アドレナリン受容体(Tβ1AR)のCF発現について、最適なMg2+濃度を20〜22 mMで同定...

予め形成されたナノディスクへの共翻訳挿入により、界面活性剤と接触することなく、定義された脂質環境で無細胞合成膜タンパク質を研究することが可能になります。このプロトコルでは、必須のシステムコンポーネントの調製と、発現効率とサンプル品質を改善するための重要なパラメーターについて説明します。

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

このプロトコルは非常に効率的で汎用性があります。ほぼすべての膜タンパク質に適用でき、すべての製造手順が1日以内に完了します。合成された膜タンパク質は、供給されたリガンドによってすでに共翻訳的に安定化することができます。界面活性剤との接触は完全に回避され、タンパク質は提供されたカスタマイズされた膜環境に直接挿入および折り畳まれます。構造的アプローチ、機能特性評価、抗体作製は、主要な応用分野です。さらに、この手法は、膜タンパク質のフォールディングと機能に対する脂質の影響を分析するのに簡単です。培養の3日目に、100ミリリットルの予備培養物を含む15リットルの攪拌タンク反応器に10リットルの無菌摂氏37度YPTG培地を接種します。そして、摂氏37度で毎分500回転の高曝気で細菌を培養します。過度の泡立ちを防ぐために、滅菌消泡剤を追加してください。細胞が中対数期に達したら、培養物に300ミリリットルのエタノールを加え、細胞を摂氏42度で毎分500回転させ、さらに45分間高曝気でインキュベートします。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞を回収し、スパチュラとピペットを使用して細胞を300ミリリットルのS30A緩衝液に再懸濁します。再懸濁した細菌を2回遠心分離し、1回の洗浄で300ミリリットルの新鮮なS30Aでペレットを洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を1.1容量のS30Bバッファーに再懸濁します。懸濁液を予冷されたフレンチプレス圧力セルにロードし、1平方インチゲージあたり1,000ポンドでセルを1回破壊します。不安定な成分を除去し、リボソームからmRNAを放出するには、ライセートを0.4モルの塩化ナトリウムに調整し、サンプルを摂氏42度のウォーターバスで45分間インキュベートします。膜足場タンパク質ナノディスクを組み立てるには、MSP1E3D1溶液と脂質溶液を混合し、DPCを最終濃度0.1%まで添加し、表に従って反応を適切な最終量に調整し、穏やかに攪拌しながら21°Cで1時間反応をインキュベートします。インキュベーションの終了時に、透析カセットのメンブレンを椎間板形成バッファーで事前に湿潤させ、シリンジを使用してアセンブリ混合物をカセットにロードします。次に、3つの5リットル容量のディスク形成バッファーに対する反応を室温で10〜20時間攪拌しながら透析した後、混合物を分子量10キロトンのカットオフでディスク形成バッファー平衡遠心フィルターユニットに移します。次に、UV-Visリーダーを使用した遠心分離により、反応を少なくとも300マイクロモルに濃縮し、濃度を測定します。3ミリリットルの連続交換無細胞反応を調製するには、3ミリリットルの透析カセットの膜を100ミリモルのトリス酢酸で平衡化します。そして、シリンジを使用して反応混合物をカセットに移します。シリンジを使用して、反応混合物コンパートメントから余分な空気を取り除き、カセットを透析チャンバーに入れます。チャンバーに60ミリリットルの供給混合物を入れ、チャンバーに蓋をします。蓋を固定した後、チャンバーを摂氏30度で12〜16時間、毎分200回転でインキュベートします。マグネシウムイオンスクリーニング用の60マイクロリットルの細胞交換無細胞反応セットアップを調製するには、新たに調製した3X Master Mixを60マイクロリットルを反応混合物に加え、825マイクロリットルをフィーディング混合物に加えます。そして、給餌混合物を水で満たします。ボルテックス後、825マイクロリットルの供給混合物を24ウェルマイクロプレートの3つのウェルのそれぞれに加えます。分子量10〜14キロトンのカットオフで再生したセルロース透析チューブを約25×20mmサイズに切断し、0.05%アジ化ナトリウムを添加した水で保存します。ミニセル交換無細胞容器を組み立てる前に、透析メンブレンから余分な水分を組織で取り除き、各容器にメンブレン片を1つずつ置きます。メンブレンをポリテトラフルオロエチレンリングで固定し、ミニコンテナを1つのウェルに供給混合物に移します。表に示されているように、反応混合物に高分子成分を添加し、ピペッティングで混合します。反応容器に60マイクロリットルの反応混合物を追加し、気泡を避けます。そして、24ウェルプレートの周りにシーリング熱可塑性フィルムの8 x 10センチメートルのシートを2枚巻き付けます。ウェルプレートの蓋をテープで固定し、プレートを摂氏30度で毎分200回転させ、12〜16時間攪拌します。翌朝、ピペットチップを使用して、ミニセル交換無細胞容器で透析膜を貫通し、反応混合物を吸引します。反応混合物を新しい遠心分離チューブに移し、遠心分離して沈殿物を除去します。次に、上清を新しいチューブに移します。ここでは、ファインチューニング反応化合物が合成された膜タンパク質の最終収量または品質に及ぼす代表的な影響を示しています。この分析では、T-β-oneアドレナリン作動性受容体の全体的な合成とナノディスク可溶化は、分析されたすべての膜組成で類似していました。対照的に、合成されたGタンパク質共役型受容体の品質にははるかに高い変動が検出され、DMPC脂質とPOPC脂質で得られた活性は最も低く、DOPGとPOPGを適用したときに最も活性が高かった。まとめると、これらの結果は、脂質ヘッドグループの電荷と脂肪酸鎖の柔軟性が、この細胞膜タンパク質の折り畳みと活性の重要な調節因子であることを示しています。最終的なナノディスク濃度も、膜タンパク質の品質にとって重要な要素となり得ます。例えば、ナノディスク濃度を3.75〜60マイクロモルの範囲でスクリーニングすると、約30マイクロモルのナノディスクでGタンパク質共役受容体の完全な可溶化が得られ、膜タンパク質とナノディスクの比率が1対3になります。対照的に、プロテオロドプシンの完全な可溶化は、約10マイクロモルのナノディスクで達成でき、10対1のプロテオロドプシンとナノディスクの比率が得られます。正確なピペッティングと高品質のコンポーネントは確かに必須です。ライセート調製の重要なステップは、中対数期の細胞を回収し、高塩分ステップを適用することです。この技術は、膜タンパク質合成の複雑さを大幅に軽減します。これまで困難だった標的を効率的に合成することで、これまで未解明の薬学的意義のあるタンパク質の分子構造に取り組むことが可能になりました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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