Name: 膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ 小麦無細胞系を用いたプロテオリポソームの無細胞生産法。膜タンパク質の機能解析と創薬標的スクリーニング、抗体開発を効率的に支援する革新的な手法です。

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本研究は、AMEDの創薬・ライフサイエンス研究支援プラットフォームプロジェクト(革新的創薬・ライフサイエンス研究支援基盤(BINDS))の支援を受けて、JP20am0101077の支援を受けて行われました。本研究の一部は、JSPS科研費20K05709の支援も受けました。

1. pEU発現プラスミドの調製
注:pEU発現プラスミドには、開始コドン、標的膜タンパク質のオープンリーディングフレーム、およびフラグメント内の終止コドンを含める必要があります( 図1を参照)。必要に応じて、検出/精製タグ配列を適切な位置に追加します。制限酵素消化またはシームレスクローニングのいずれかがサブクローニングに適用できます。ここでは、シームレスクローニング法を用いたプロトコルについて説明する。
<ol><li>インサートDNA断片を準備します。<ol><li>cDNA鋳型、プライマー1およびプライマー2を用いたPCRにより目的の遺伝子を増幅する。プライマー1とプライマー2には、シームレスなクローニングのためにそれぞれ15 bpのオーバーラップが含まれています( 材料表を参照)。 注:細胞内の成熟タンパク質から処理および除去される配列(シグナル配列など)は含めないでください。合成されたタンパク質のプロセシングは、小麦無細胞系では行われない。コザックシーケンスを追加しないでください。pEU-E01-MCSベクターはE01翻訳エンハンサーを有する。</li>
		<li>1/25容量の DpnI制限酵素をPCR産物に加え、鋳型プラスミドDNAを除去します。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>PCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、濃度を20〜50 ng / μLに調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>pEU-E01-MCSベクトルを線形化します。<ol><li>pEU-E01-MCS、プライマー3、プライマー4を用いてインバースPCRを実施します。</li>
		<li>1/25容量の DpnI制限酵素をインバースPCR産物に加えます。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>PCR精製キットを使用して、メーカーの推奨に従ってPCR産物を精製します。濃度を20〜50 ng / μLに調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>2 μLのインサートDNAフラグメント、2 μLの直鎖化ベクター、および4 μLの2xシームレスクローニング酵素混合物を混合します。</li>
	<li>大腸菌JM109株をシームレスクローニング産物で形質転換する。スプレッダーを使用して、LB-アンピシリン寒天プレート上に細菌懸濁液を広げる。 注:pEUベクターはアンピシリン耐性マーカーを有する。</li>
	<li>pEUプラスミドにおけるMCSの5'側および3'側からそれぞれプライマー5およびプライマー6を用いて構築した発現プラスミドの配列を確認する。</li>
	<li>発現プラスミドを増幅および精製する。<ol><li>プラスミド形質転換 大腸菌 JM109株を150 mLのLB-アンピシリン培地中で37°C、毎分125ストロークで一晩振とう培養した。</li>
		<li>市販のプラスミド調製MIDIキットを用いてプラスミドを抽出・精製します。プラスミドを 500 μL の TE バッファーに溶解します。 注意: プラスミド抽出にミニプレップキットを使用しないでください。それはプラスミドの十分な質と量を提供しません。</li>
		<li>500 μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。5分間激しく混合し、17,800 x g 、室温で5分間遠心分離します。上部プラスミド溶液を新しいチューブに移します。 注意: フェノールやクロロホルムから皮膚を保護するために、使い捨て手袋を着用してください。 注:プラスミド抽出キットからRNaseの汚染を除去するには、フェノール-クロロホルム精製を使用してプラスミドを精製します。</li>
		<li>500μLのクロロホルムを加えてフェノールを完全に除去します。5分間激しく混合し、17,800 x g 、室温で5分間遠心分離します。上部プラスミド溶液を新しいチューブに移します。</li>
		<li>2.5容量のエタノールと1/8容量の7.5 M酢酸アンモニウムを加え、-30°Cで1時間保存します。</li>
		<li>17,800 x g 、4°C、10分間遠心分離します。ペレットを500μLの70%エタノールで洗浄します。上清を注意深く取り除き、ペレットを5分間放置して乾かします。</li>
		<li>発現プラスミドを100 μLの超純水に完全に溶解します。260 nmの吸光度でプラスミドの濃度を測定します。濃度を1 mg/mLに調整してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2.インビトロ転写
注意: 転写および翻訳のステップでは、DNaseおよびヌクレアーゼフリーのプラスチックチューブとチップを使用してください。汚染を防ぐために、プラスチック製品のオートクレーブは避けてください。
<ol><li>新しいプラスチックチューブで超純水を収穫します。 注意: DEPC処理水は残留すると反応が強く阻害されるため、使用しないでください。転写と翻訳には、新たに精製された超純水を使用してください。</li>
	<li>115.2 μLの超純水、40 μLの転写バッファーLM、20 μLのNTPミックス、2.4 μLの80 U/μL RNase阻害剤、2.4 μLの80 U/μL SP6ポリメラーゼ、および20 μLの1 mg/mL pEU発現プラスミドを混合して、転写反応ミックスを調製します。反転させて試薬を穏やかに混合します。クイックスピンを実行します。</li>
	<li>転写反応を37°Cで6時間インキュベートします。</li>
	<li>反転して反応を穏やかに混ぜ合わせ、すばやく回転させます。翻訳には直ちに使用し、それ以外の場合は凍結して-80°Cで保存してください。</li>
	<li>電気泳動により転写産物を確認する。<ol><li>100 mLの1x TAEバッファーと1 gのアガロースを混合します。懸濁液を電子レンジで加熱し、1%アガロースTAEゲルを調製した。</li>
		<li>1 μLの転写反応を取り、3 μLの水および4 μLの2xローディング色素と混合します。 注:RNAの変性は必要ありません。</li>
		<li>混合物4 μLとDNAラダーマーカー2 μLをアガロースTAEゲルにロードします。</li>
		<li>100 Vで20分間電気泳動します。</li>
		<li>ゲルを臭化エチジウムで30分間染色する。UVトランスイルミネーターとゲルイメージャーを使用してmRNAのラダーバンドパターンを確認します。 注:500 bp未満の塗抹バンドが観察された場合、mRNAの分解が疑われます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 翻訳資料の作成
<ol><li>翻訳バッファを準備します。<ol><li>調製したての超純水27 mLと、S1、S2、S3、S4の40xストック溶液0.75 mLをそれぞれ50 mLチューブに混合します。 注: 1x 変換バッファの最終必要量に応じて、材料の量を調整してください。 注意: 使用後に余分な 1x 翻訳バッファを保存または再フリーズしないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>クレアチンキナーゼストック溶液を調製します。凍結乾燥クレアチンキナーゼを超純水に溶解し、最終濃度20 mg/mLにします。溶液を少量(各10〜50 μL)で0.2 mL 8ストリップPCRチューブに分注します。チューブを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。 注意: 解凍後にクレアチンキナーゼ溶液を再凍結しないでください。</li>
	<li>透析カップ(0.1mLサイズ)を洗浄し、透析膜からグリセロールを除去します。 注意: いくつかの異なるサイズの透析カップがあります。小規模テストには小型カップ(0.1 mL)が使用され(セクション5.4)、大規模生産には大型カップ(2 mL)がそれぞれ使用されます(セクション5.5)。大型カップの透析膜の洗浄工程は回避可能である。<ol><li>1mLの超純水を新しい1.5mLチューブに入れます。小型の透析カップ(0.1 mL)をチューブに挿入します。カップに超純水0.5mLを加えます。</li>
		<li>室温で30分以上インキュベートします。</li>
	</ol></li>
</ol>4.リポソームの調製
注:ここでは、リポソームの調製のための2つのプロトコルについて説明します。1つはすぐに使用できる凍結乾燥リポソームを使用し(セクション4.1)、もう1つは薄い脂質膜を水和することによってリポソームを生成します(セクション4.2)。
<ol><li>凍結乾燥リポソームを用いてリポソームを調製する。 注:プロテオリポソームを製造するより簡単な方法は、市販のアソレクチンリポソームを使用することです。アソレクチンは大豆から抽出された天然脂質の一種です。<ol><li>10 mgの凍結乾燥アソレクチンリポソーム( 材料表を参照)を含むバイアルを開き、200 μLの翻訳バッファー(セクション3.1)をバイアルの底に追加します。バイアルを密封し、10分間インキュベートします。</li>
		<li>バイアルをボルテックスミキサーに1分間置き、激しく混合します。</li>
		<li>バイアルを50 mLチューブに挿入します。500 x g で1分間遠心分離してチューブをスピンダウンします。</li>
		<li>ピペットを使用して、アソレクチンリポソーム懸濁液(50 mg脂質/ mL)を新しい1.5 mLチューブに移します。翻訳のためにすぐにリポソームを使用し、それ以外の場合は液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>薄い脂質膜を水和してリポソームを調製する。<ol><li>脂質が粉末状で販売されている場合は、クロロホルムまたは適切な有機溶媒に10〜100 mg / mLの濃度に溶解します。 注:薄い脂質膜は、精製および/または合成された両親媒性脂質を使用して調製できます。アソレクチンの精製方法は、先に説明した38。ビオチン化脂質、蛍光脂質、アジュバント脂質などの機能修飾脂質を基底脂質に添加して、機能性リポソームを製造することができる。</li>
		<li>50 mgの脂質を含む脂質溶液を蒸発フラスコに移します。</li>
		<li>ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を蒸発させ、フラスコ底の壁に脂質を均一に広げて、脂質の薄膜を形成します。</li>
		<li>フラスコを真空デシケーターに入れ、負圧下で一晩放置して溶媒を完全に除去します。</li>
		<li>1 mLの翻訳バッファーを蒸発フラスコに加えます。フラスコを回転させて、薄い脂質膜上にバッファーを広げます。5分間インキュベートしてフィルムを水和させます。</li>
		<li>超音波ホモジナイザーまたは超音波洗浄機でフラスコを超音波処理します。フラスコの角度を時々変更して、溶液がフィルムに完全に触れるようにします。薄い脂質フィルムが底から剥がされ、完全かつ均質に乳化されていることを確認してください。 注:ビオチン化脂質含有リポソームの電子顕微鏡写真を 図1に示す。</li>
		<li>リポソーム懸濁液(50 mg脂質/ mL)を新しい1.5 mLチューブに移します。すぐに使用しない場合は、リポソームを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存してください。</li>
	</ol></li>
</ol>5. インビトロ翻訳
<ol><li>チューブを室温の水に数分間浮かべて、小麦胚芽抽出物をすばやく解凍します。解凍後、すぐにチューブを反転させて穏やかに混合し、回転させ、使用するまで氷の上で冷やします。 注:使用後は小麦胚芽抽出物を液体窒素で凍結し、-80°Cで保存してください。 いくつかの凍結/解凍サイクルに耐えます。</li>
	<li>20 mg/mLのクレアチンキナーゼストック溶液を解凍します。5 μLのストック溶液と45 μLの翻訳バッファーを混合して、2 mg/mLのクレアチンキナーゼ作業溶液を調製します。 注意: クレアチンキナーゼの再凍結はお勧めしません。</li>
	<li>必要に応じてリポソームまたはmRNAを解凍します。</li>
	<li>小規模なタンパク質翻訳を実施します。<ol><li>ステップ3.3.2で準備したように、チューブと透析カップ(0.1 mL)の両方から水を取り除きます。</li>
		<li>1 mL および 300 μL の翻訳バッファーをチューブと透析カップにそれぞれ注入します。 注意: 透析カップの底部が1.5 mLチューブの翻訳バッファーの表面に届かない場合は、さらに50〜100 μLのバッファーをチューブに注入します。</li>
		<li>翻訳バッファー15.6 μL、2 mg/mLクレアチンキナーゼ2.4 μL、50 mg/mLリポソーム12 μL、小麦胚芽抽出物15 μL、およびmRNA15 μLを混合して、翻訳反応混合物を調製します。チューブを反転させて穏やかに混合し、スピンダウンします。</li>
		<li>200 μLのピペットを用いて60 μLの翻訳反応混合物を吸引します。</li>
		<li>ピペットチップを透析カップの翻訳バッファーの下面に挿入します。反応混合物をゆっくりと穏やかにピペットで取り出します。蒸発を防ぐために、透析カップを蓋で覆います。 注意: 反応混合物はカップの底に自然に沈み、二重層を形成します。カップを混ぜたり振ったりして二重層を邪魔しないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>大規模な翻訳を行います(図1)。<ol><li>22 mLの翻訳バッファーを25 mLチューブに注ぎます。大型の透析カップ(2 mL)をチューブに挿入し、カップに2 mLの翻訳バッファーを追加します。</li>
		<li>翻訳バッファー130 μL、2 mg/mLクレアチンキナーゼ20 μL、50 mg/mLリポソーム100 μL、小麦胚芽抽出物125 μL、およびmRNA125 μLを混合して、翻訳反応混合物を調製します。ピペッティングで穏やかに混ぜます。</li>
		<li>すべての翻訳反応混合物(500 μL)を1,000 μLピペットで吸引します。ステップ5.4.5で説明されているのと同じ方法で、翻訳反応混合物を透析カップに注入します。蒸発を防ぐために、透析カップを蓋で覆います。</li>
	</ol></li>
	<li>反応物を15°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>ピペッティングにより透析カップ内で反応をよく混合する。粗プロテオリポソーム懸濁液を新しいチューブに移します。 注:小規模翻訳からプロテオリポソームを採取するには、平底の1.5 mLチューブをお勧めします。遠心分離後、リポソームはチューブの下隅にコンパクトで見やすいペレットを形成します。</li>
</ol>6. プロテオリポソームの精製
<ol><li>粗プロテオリポソーム懸濁液を含むチューブを17,800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り除きます。プロテオリポソームペレットをピペッティングによりPBS(小スケール:1mL、大スケール:10mL)に懸濁する。</li>
	<li>プロテオリポソームの遠心分離と洗浄をさらに2つの円で繰り返します。</li>
	<li>洗浄後、少量のPBSを加え、ピペッティングでプロテオリポソームペレットをよく再懸濁します。マイクロピペットを使用して懸濁液の量を測定します。PBSを加えて、容量を60 μL(小規模)または500 μL(大規模)に調整します。懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>10 μLのプロテオリポソーム懸濁液をSDS-PAGE用の新しいPCRチューブに移します。残りのサンプルを小さな部分に分割して、必要に応じて使用します。液体窒素中で凍結し、-80°Cで保存する。</li>
</ol>7. SDS-PAGEおよびCBB染色
<ol><li>70 μLの水と40 μLの3x SDS-PAGEサンプルバッファーを10 μLのプロテオリポソーム懸濁液に加えます。 注意:膜タンパク質が凝集し、電気泳動でアクリルアミドゲルに浸透しにくいため、SDS-PAGEサンプルを沸騰させないでください。また、酸化を防ぐために、SDS-PAGEサンプルバッファーに十分な還元剤(例えば、最終濃度3%の2-メルカプトエタノール)を加えます。</li>
	<li>電気泳動チャンバーに5%〜20%のグラジエントSDS-PAGEゲルをセットします。3 μL、6 μL、12 μLのプロテオリポソームサンプル、2 μLのタンパク質サイズマーカー、およびBSA標準シリーズもロードします。</li>
	<li>52 mA、400 Vで30分間電気泳動します。</li>
	<li>ゲルをCBB染料で1時間染色します。お湯で脱色し、ゲル画像をスキャンします。</li>
	<li>NIH Image Jソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/)を用いて、各レーンにおける膜タンパク質のバンド強度を定量化する。BSA標準系列で合成した膜タンパク質の量を推定します。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

提示されたプロトコルは、高い成功率で膜タンパク質を生産する方法を提供する。このプロトコルはシンプルで再現性が高く、スケールアップも簡単です。また、膜タンパク質を大量に消費する実験の時間とコストを削減できる可能性もあります。二重層透析法は、二分子膜法または透析法と比較して生産性を4〜10倍向上させます(図2B)45。極端な場合、イオンチャネルとトランスポーターの収率は、二層透析法の場合よりも二重層透析法でそれぞれ30倍と20倍増加しました(データ示さず)。このプロトコールの高い生産性は、免疫化のための抗原産生における利点である。プロテオリポソームは、抗膜タンパク質抗体開発のための免疫抗原としてよく使用されます。プロテオリポソームに埋め込まれた高濃度および精製された膜タンパク質は、免疫応答を効果的に刺激し、抗体を誘導する41,47。この二重層透析法を用いると、免疫目的で数ミリグラムの膜タンパク質を担持したプロテオリポソ...

膜タンパク質は、診断および治療において最も重要な薬物標的の1つです。実際、標的とする低分子化合物の半分は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)やイオンチャネル1などの膜タンパク質です。長年にわたり、研究者は膜タンパク質の構造と機能を解明するために、膜タンパク質の生化学的、生物物理学的、および構造的研究に取り組んできました2,3。膜タンパク質に対するモノクローナル抗体の開発も、機能的および構造的研究を加速し、治療および診断アプリケーションを開発するために積極的に行われています4,5,6,7,8,9。これらの研究はすべて、大量の高品質の膜タンパク質を必要とします10。例えば、抗体開発には、天然の立体配座を有する数ミリグラムの精製膜タンパク質が必要です。X線結晶学には、はるかに大量の高度に精製された膜タンパク質が必要です。しかし、膜タンパク質の大量生産は、膜タンパク質研究のボトルネックとして残っています11。膜タンパク質は、1つまたは複数の膜貫通ヘリックスを有する複雑な構造を有し、細胞の恒常性において重要な役割を果たします。膜タンパク質の異種過剰発現は、高局所濃度で蓄積する膜タンパク質の凝集や細胞シグナル経路の乱れなど、複数の障害を引き起こします。発現が成功したとしても、サンプル調製の後続のステップも困難に直面します。例えば、プロテオリポソームの調製には、膜タンパク質の可溶化、精製、安定化における高度なスキルと専門的な経験が必要であり、同様に多くの労力と時間が必要です12,13。
一方、生細胞を使用せずにタンパク質を生産するために、ここ数十年でいくつかの高度な技術が出現しました14、15、16、17、18。無細胞タンパク質合成技術は、試験管内で翻訳反応を再構成します。細胞発現系には制限がないため、無細胞系は、細胞内で発現が困難な、または毒性を示す様々なタンパク質を合成できる可能性がある。精製された細胞抽出物または再構成された翻訳機構は、鋳型mRNA、アミノ酸、およびエネルギー源と混合され、組換えタンパク質が短時間で合成されます。膜タンパク質合成に関しては、無細胞反応にリポソーム、バイセル、ナノディスク、コポリマーなどの脂質または両親媒性物質からなるある種の足場が付加される19、20、21、22、23、24。合成された膜タンパク質は足場と相互作用し、水中で安定化することができます。無細胞合成膜タンパク質は、機能研究および抗体産生において広く使用されている25、26、27、28、29、30、31。
このプロトコールでは、小麦無細胞系とリポソームを用いた効率的なプロテオリポソーム生産法を記載する。小麦無細胞タンパク質合成系は、小麦胚芽15,32,33からの抽出物を用いた強力なin vitro翻訳系である。小麦胚芽には大量の翻訳機構が含まれており、翻訳阻害剤はほとんどありません。真核生物の一員であるコムギの翻訳機構は真核生物タンパク質の翻訳に適しており、その翻訳効率は鋳型mRNAのコドン使用にほとんど影響されない。コムギ無細胞系を用いて、プロテインキナーゼ34,35、ユビキチンリガーゼ36、転写因子37、膜タンパク質など様々なタンパク質を高い成功率で合成しています。膜タンパク質の生産のために、脂質小胞リポソームを足場として翻訳混合物に加えます19,38。膜タンパク質の疎水性ドメインは脂質二重層と相互作用し、リポソームと自発的に統合されます。密度勾配遠心分離は、プロテオリポソーム20の単純な精製には翻訳反応混合物の一般的な遠心分離で十分であるにもかかわらず、内因性小麦タンパク質からプロテオリポソームを厳密に分離するために使用されます。コムギ無細胞系を用いて多くの種類の内在性膜タンパク質が合成され、様々な研究開発に応用されている25,38,39,40,41,42,43,44。さらに、大規模生産のための「二重層透析法」を開発しました45,46。この方法では、カップ型透析装置を基板供給バッファーに浸漬し、図1に示すようにカップ内に翻訳反応混合物と基質供給バッファーの2層を形成する。基質の連続供給と副生成物の除去は、反応混合物の上部と下部の両方で長時間効率的に行うことができ、優れた翻訳効率につながります(図2Aおよび図2B)45。

<table><tbody><tr><td>&times;3 SDS-PAGEサンプルバッファー</td><td></td><td></td><td>10% 2-メルカプトエタノール</td></tr><tr><td>5-20%グラジエントを含む SDS-PAGEゲル</td><td>ATTO</td><td>E-D520L</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td>超純水で希釈したエタノール。</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>タカラバイオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Nakalai tesque</td><td>02406-95</td><td>この試薬は潮解性であるため、開封後は全て水に溶かし、-30°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム</td><td>Nakalaiテスク</td><td>02739-74</td><td></td></tr><tr><td>アソレクチンリポソーム、凍結乾燥</td><td>CellFree科学</td><td>CFS-PLE-ASL</td><td>バイアルは凍結乾燥リポソームの10 mgを含んでいます。</td></tr><tr><td>BSA標準</td><td></td><td></td><td>1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng BSA / 10 & マイクロ;L&タイムズ;1 SDS-PAGEサンプル</td></tr><tr><td>バッファーCBBゲル染色目的の</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNAクローン</td><td></td><td></td><td>プラスミドcDNAクローンまたは合成DNAフラグメントを抱くプラスミド</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>ナカライテスク</td><td>08402-84</td><td></td></tr>冷却イン<tr><td>キュベーター</td><td></td><td></td><td>0〜40°Cの範囲の温度;C以上。</td></tr><tr><td>クレアチンキナーゼ</td><td>Roche Diagnostics</td><td>04524977190</td><td></td></tr><tr><td>透析カップ (0.1 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置、10K MWCO、0.1 mL</td></tr><tr><td>透析カップ (2 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88404</td><td>Slide-A-Lyzer MINI 透析装置、10K MWCO、2 mL</td></tr><tr><td>DNA ラダーマーカー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>GeneRuler 1 kb DNAはしご</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FD1703</td><td>FastDigest DpnI</td></tr><tr><td>大腸菌株 JM109</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動チャンバー</td><td>ATTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール (99.5%)</td><td>Nakalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>臭化</td><td></td><td></td><td></td></tr>エチジウム <tr><td>蒸発フラスコ、100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルスキャナー</td><td></td><td></td><td>代わりにドキュメントスキャナーとLED免疫器を使用しています。</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>関心のある脂質</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>NTP mix</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-NTP</td><td>ATP、GTP、CTP、UTP の混合物、各 25 mM</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 25 mL チューブ</td><td>IWAKI</td><td>362-025-MYP</td><td></td></tr><tr><td>ヌクリーズフリープラスチックチューブ</td><td>ワトソンバイオラボ</td><td></td><td>オートクレーブはしないでください。他の実験とは別に使用してください。</td></tr><tr><td>核なしのヒント</td><td>ワトソンバイオラボ</td><td></td><td>オートクレーブしないでください。他の実験とは別に使用してください。</td></tr><tr><td>PBSバッファーPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精製キット</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740609</td><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td></tr><tr><td>pEU-E01-MCS vector</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-11</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid prep Midi kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740410</td><td>NucleoBond Xtra Midi</td></tr><tr><td>プライマー 1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnn-3' 遺伝子特異的プライマー、フォワード。大文字は、シームレスなクローニングのために追加されるオーバーラップシーケンスを示しています。小文字の nnnn&hellip;.(20-30 bp)は遺伝子特異的な配列を示す。</td></tr><tr><td>プライマー 2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnn-3' 遺伝子特異的プライマー、リバース。大文字は、シームレスなクローニングのために追加されるオーバーラップシーケンスを示しています。小文字の nnnn&hellip;.(20-30 bp)は遺伝子特異的な配列を示す。</td></tr><tr><td>プライマー 3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATATAGAAT-3' ベクター線形化のためのフォワードプライマー。下線は、シームレスクローニングでオーバーラップとして機能します。</td></tr><tr><td>プライマー 4</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'-CTAGTGATATTCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' ベクター線形化用リバースプライマー。下線は、シームレスクローニングでオーバーラップとして機能します。</td></tr><tr><td>プライマー 5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3' シーケンシングプライマー、フォワード</td></tr><tr><td>プライマー 6</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタムオリゴ合成</td><td>5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3' シーケンシングプライマー、リバース</td></tr><tr><td>タンパク質サイズマーカー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610394</td><td>プレシジョンプラス プロテイン スタンダード</td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シームレスクローニング酵素混合物</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>E2611L</td><td>ギブソンアセンブリ マスターミックス その他のシームレスクローニング試薬もご用意しています。</td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ&RNase Inhibitor</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-ENZ</td><td></td></tr><tr><td>海底電気泳動システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAEバッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>転写バッファー LM</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-TSC-5TB-LM</td><td></td></tr><tr><td>翻訳バッファー</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-SUB-SGC</td><td>SUB-AMIX SGC (&times;40)ストックソリューション(S1、S2、S3、S4). 準備&times;ストックS1、S2、S3、S4ストックと超純水を混合して使用する前に、1つのトランスレーションバッファー。</td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td>実験を行うたびに超純水製造装置を使用して超純水を準備することをお勧めします。オートクレーブ処理をしないでください. Milli-Q ReferenceとElix10システムを使用して超純水を調製しました. 市販のヌクレアーゼフリー水(DEPC処理水ではない)を代用できます。ボトルを開けた後は汚染に注意してください。</td></tr><tr><td>超音波ホモジナイザー</td><td>ブランソン</td><td>SONIFIERモデル450D-アドバンスド</td><td>超音波洗浄機は、代替品として使用することができます。</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽抽出物</td><td>CellFree Sciences</td><td>CFS-WGE-7240</td><td>WEPRO7240</td></tr></tbody></table>

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

膜タンパク質は、さまざまな細胞プロセスにおいて重要な役割を果たし、重要な機能を果たします。膜タンパク質は、すべての薬剤の半分以上の標的であるため、創薬において医学的に重要です。膜タンパク質の生化学的、生物物理学的、構造的研究、および抗体開発を行う上での障害は、正しい立体構造と活性を有する高品質の膜タンパク質を大量に生産することの難しさでした。ここでは、小麦胚芽無細胞系、リポソーム、透析カップを用いて、膜タンパク質を効率よく合成し、精製プロテオリポソームを短時間で高成功率で調製する「二重層透析法」について述べる。膜タンパク質は、GPCR、イオンチャネル、トランスポーター、テトラスパニンなど、数ミリグラム単位で産生することができます。この無細胞法は、高品質なプロテオリポソームを調製するための時間、コスト、労力の削減に貢献し、膜タンパク質の機能解析、創薬ターゲットスクリーニング、抗体開発に適した手段を提供します。

このプロトコールを用いて、部分的に精製されたプロテオリポソームを短時間で得ることができる。代表的な結果を 図2Aに示す。クラスA、B、Cの25個のGPCRを二層透析法(小規模)で合成し、遠心分離とバッファー洗浄によって部分的に精製することに成功しました。タンパク質の種類によって合成されるタンパク質の量は異なりますが、大型の透析カップを使用すると、通常、反応ごとに50〜400μgの膜タンパク質を合成できます。小麦無細胞系の高いスケーラビリティにより、反応回数を増やすことで数ミリグラムの膜タンパク質を簡単に生成できます。二重層透析法における標的タンパク質の産生効果を判断するには、小型の透析カップを使用した事前試験で十分です。得られた生産性に応じて、大型の透析カップを用いて産生される標的タンパク質の量を推定することができる。
このプロトコルは、膜タンパク質の発現、特に複数の膜貫通ヘリックスを持つタンパク質に適しています。ほとんどの場合、3つ以上の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質は、合成後にプロテオリポソームに容易に取り込まれ...

このプロトコルは、小麦無細胞系およびリポソームを用いた二重層透析法による高品質のプロテオリポソームの効率的な無細胞生産法を記載する。この方法は、膜タンパク質の機能解析、創薬標的のスクリーニング、および抗体開発に適した手段を提供します。

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

すべての膜タンパク質は、創薬における重要なターゲットです。膜タンパク質の最大規模の生産は、生化学的、生物物理学的、および構造的な膜タンパク質研究の実施のボトルネックとなっています。この方法により、膜タンパク質をin vitroで効率的に合成し、精製されたプロテオリポソームを短時間で高い成功率で調製することができます。転写反応混合物を生成するための無細胞発現プラスミドを含む適切な試薬を添加した後、チューブ内容物を穏やかに反転またはタッピングして混合し、微量遠心分離機でクイックスピンを行います。スピン後、転写反応混合物を摂氏37度で6時間インキュベートし、続いて混合し、スピンダウンステップを行います。翻訳バッファーを調製するには、ストック溶液を新鮮な超純水で希釈します。小規模な翻訳の場合は、超純水で洗浄した100マイクロリットルの透析カップを使用して、透析膜からグリセロールを除去します。新しい1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの超純水を加え、チューブに小型の透析カップを挿入します。次に、500マイクロリットルの超純水をカップに加え、室温で30分間インキュベートします。リポソームを調製するには、50ミリグラムの脂質を含む脂質溶液を蒸発フラスコに移します。フラスコをロータリーエバポレーターに入れて、溶媒を蒸発させます。フラスコの底面に薄く均一に広がった脂質の層が生成された場合は、フラスコを陰圧下で一晩真空デシケーターに移し、溶媒を完全に除去します。翌朝、デシケーターからフラスコを取り外し、脂質の薄膜を確認します。1ミリリットルの翻訳バッファーをフラスコに加え、フラスコを回転させてバッファーを薄い脂質フィルム上に広げます。5分後、フラスコを超音波処理し、時々角度を変えて溶液が脂質フィルム表面全体に接触できるようにします。脂質がフラスコから完全に剥がされ、リポソーム懸濁液が均一になったら、超音波処理を停止します。次に、リポソーム懸濁液を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。in vitroタンパク質翻訳を行う前に、マイナス80度で保存した小麦胚芽抽出物のチューブを室温の水に数分間浮かべて、材料を迅速に解凍します。抽出物を解凍したら、すぐにチューブの内容物を穏やかに反転して混合します。次に、スピンダウンしてチューブを氷の上に置きます。コムギ胚芽抽出物mRNAとリポソームを添加して、翻訳反応混合物を生成します。チューブの内容物を穏やかに反転またはタッピングして混合し、微量遠心分離機でクイックスピンを行います。小規模な in-vitro タンパク質翻訳を行うには、小規模透析カップとチューブから水分を取り出し、チューブに 1 ミリリットルの翻訳バッファーを、カップに 300 マイクロリットルを追加します。60マイクロリットルの翻訳反応混合物を取ります。ピペットチップを透析カップのトランスレーションバッファーに挿入します。次に、混合物をゆっくりと穏やかに注入します。高密度の反応混合物は、自発的にカップの底に沈み込み、層を形成します。蒸発を防ぐためにカップに蓋をします。大規模な翻訳を行うには、25ミリリットルのチューブに22ミリリットルの翻訳バッファーを追加し、2ミリリットルの透析カップをチューブに入れます。2ミリリットルのトランスレーションバッファーを透析カップに加えます。翻訳反応混合物の500マイクロリットルを取り、ゆっくりとそして穏やかに混合物をカップの翻訳緩衝液に注入します。反応を摂氏15度で24時間インキュベートします。翌日、ピペッティングにより透析カップで反応を完全に混合し、粗いプロテオリポソーム懸濁液を新しいチューブに移します。プロテオリポソームを精製するには、プロテオリポソームを粗懸濁液中に沈殿させます。次に、適切な量の氷冷PBSバッファーに再懸濁してプロテオリポソームを洗浄します。洗浄後、プロテオリポソームペレットを少量のPBSに十分に再懸濁し、マイクロピペットを用いて懸濁量を測定する。次に、PBSを追加してサスペンションの量を調整します。各サスペンションを新しいマイクロチューブに移します。SDSページ分析を設定するには、70マイクロリットルの水と40マイクロリットルの3時間濃縮SDSページサンプルバッファーを、各プロテオリポソーム懸濁液の10マイクロリットルに加えます。電気泳動チャンバーに5〜20%グラジエントSDSページゲルをセットします。各プロテオリポソームサンプルのタンパク質サイズマーカー3、6、および12マイクロリットルの2マイクロリットルと、ウシ血清アルブミン標準物質10マイクロリットルをゲルにロードします。サンプルをロードした後、電気泳動を行い、続いてゲルをCoomassie Brilliant Blue色素で染色します。最後に、お湯で穏やかに振ってゲルを脱色し、ゲル画像をスキャンします。実証されたようにこのプロトコルを使用すると、3つ以上の膜貫通ヘリックスを持つさまざまな膜タンパク質を短時間でプロテオリポソームとして容易に生成できます。この二重層透析法では、反応混合物の上部と下部の両方で基質の連続供給と副生成物の除去を長期間にわたって効率的に行うことができ、優れた翻訳効果につながります。二層透析法は、二層透析法または透析法のみを使用する場合と比較して、生産性が4倍から10倍向上します。合成されたプロテオリポソームをセントリフィケーションにより収集し、洗浄バッファーで部分的に精製すると、膜タンパク質の精製プロセスが大幅に短縮されます。この無細胞システムは、操作が簡単で、非常にスケーラブルです。また、他の方法では発現が難しいメモリータンパク質の作製にも使用できます。この方法は、抗膜タンパク質、抗体産生、SPR、Elisa、AlphaScreenなどの膜タンパク質を使用または標的とする研究や実験に非常に役立ちます。

cell-free-production-proteoliposomes-for-functional-analysis-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV...

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

ここの postfusion 二層にこれらの膜タンパク質の洗剤無料配信するためターゲット脂質膜融合ペプチド プロテオリポソームに膜タンパク質の再構成とそのようなプロテオリポソームの融合の 2...

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids...

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroとin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ...

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。...

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ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

予め形成されたナノディスクへの共翻訳挿入により、界面活性剤と接触することなく、定義された脂質環境で無細胞合成膜タンパク質を研究することが可能になります。このプロトコルでは、必須のシステムコンポーネントの調製と、発現効率とサンプル品質を改善するための重要なパラメーターについて説明します。...

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

このプロトコルでは、市販の無細胞タンパク質発現キットを使用して、サブユニットワクチンの抗原として使用できるナノディスクに支持された膜タンパク質を産生することを説明しています。...

ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。...

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

学ぶ 小麦無細胞系を用いたプロテオリポソームの無細胞生産法。膜タンパク質の機能解析と創薬標的スクリーニング、抗体開発を効率的に支援する革新的な手法です。

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

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