膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

すべての膜タンパク質は、創薬における重要なターゲットです。膜タンパク質の最大規模の生産は、生化学的、生物物理学的、および構造的な膜タンパク質研究の実施のボトルネックとなっています。この方法により、膜タンパク質をin vitroで効率的に合成し、精製されたプロテオリポソームを短時間で高い成功率で調製することができます。

転写反応混合物を生成するための無細胞発現プラスミドを含む適切な試薬を添加した後、チューブ内容物を穏やかに反転またはタッピングして混合し、微量遠心分離機でクイックスピンを行います。スピン後、転写反応混合物を摂氏37度で6時間インキュベートし、続いて混合し、スピンダウンステップを行います。翻訳バッファーを調製するには、ストック溶液を新鮮な超純水で希釈します。

小規模な翻訳の場合は、超純水で洗浄した100マイクロリットルの透析カップを使用して、透析膜からグリセロールを除去します。新しい1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの超純水を加え、チューブに小型の透析カップを挿入します。次に、500マイクロリットルの超純水をカップに加え、室温で30分間インキュベートします。

リポソームを調製するには、50ミリグラムの脂質を含む脂質溶液を蒸発フラスコに移します。フラスコをロータリーエバポレーターに入れて、溶媒を蒸発させます。フラスコの底面に薄く均一に広がった脂質の層が生成された場合は、フラスコを陰圧下で一晩真空デシケーターに移し、溶媒を完全に除去します。

翌朝、デシケーターからフラスコを取り外し、脂質の薄膜を確認します。1ミリリットルの翻訳バッファーをフラスコに加え、フラスコを回転させてバッファーを薄い脂質フィルム上に広げます。5分後、フラスコを超音波処理し、時々角度を変えて溶液が脂質フィルム表面全体に接触できるようにします。

脂質がフラスコから完全に剥がされ、リポソーム懸濁液が均一になったら、超音波処理を停止します。次に、リポソーム懸濁液を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。in vitroタンパク質翻訳を行う前に、マイナス80度で保存した小麦胚芽抽出物のチューブを室温の水に数分間浮かべて、材料を迅速に解凍します。

抽出物を解凍したら、すぐにチューブの内容物を穏やかに反転して混合します。次に、スピンダウンしてチューブを氷の上に置きます。コムギ胚芽抽出物mRNAとリポソームを添加して、翻訳反応混合物を生成します。

チューブの内容物を穏やかに反転またはタッピングして混合し、微量遠心分離機でクイックスピンを行います。小規模な in-vitro タンパク質翻訳を行うには、小規模透析カップとチューブから水分を取り出し、チューブに 1 ミリリットルの翻訳バッファーを、カップに 300 マイクロリットルを追加します。60マイクロリットルの翻訳反応混合物を取ります。

ピペットチップを透析カップのトランスレーションバッファーに挿入します。次に、混合物をゆっくりと穏やかに注入します。高密度の反応混合物は、自発的にカップの底に沈み込み、層を形成します。

蒸発を防ぐためにカップに蓋をします。大規模な翻訳を行うには、25ミリリットルのチューブに22ミリリットルの翻訳バッファーを追加し、2ミリリットルの透析カップをチューブに入れます。2ミリリットルのトランスレーションバッファーを透析カップに加えます。

翻訳反応混合物の500マイクロリットルを取り、ゆっくりとそして穏やかに混合物をカップの翻訳緩衝液に注入します。反応を摂氏15度で24時間インキュベートします。翌日、ピペッティングにより透析カップで反応を完全に混合し、粗いプロテオリポソーム懸濁液を新しいチューブに移します。

プロテオリポソームを精製するには、プロテオリポソームを粗懸濁液中に沈殿させます。次に、適切な量の氷冷PBSバッファーに再懸濁してプロテオリポソームを洗浄します。洗浄後、プロテオリポソームペレットを少量のPBSに十分に再懸濁し、マイクロピペットを用いて懸濁量を測定する。

次に、PBSを追加してサスペンションの量を調整します。各サスペンションを新しいマイクロチューブに移します。SDSページ分析を設定するには、70マイクロリットルの水と40マイクロリットルの3時間濃縮SDSページサンプルバッファーを、各プロテオリポソーム懸濁液の10マイクロリットルに加えます。

電気泳動チャンバーに5〜20%グラジエントSDSページゲルをセットします。各プロテオリポソームサンプルのタンパク質サイズマーカー3、6、および12マイクロリットルの2マイクロリットルと、ウシ血清アルブミン標準物質10マイクロリットルをゲルにロードします。サンプルをロードした後、電気泳動を行い、続いてゲルをCoomassie Brilliant Blue色素で染色します。

最後に、お湯で穏やかに振ってゲルを脱色し、ゲル画像をスキャンします。実証されたようにこのプロトコルを使用すると、3つ以上の膜貫通ヘリックスを持つさまざまな膜タンパク質を短時間でプロテオリポソームとして容易に生成できます。この二重層透析法では、反応混合物の上部と下部の両方で基質の連続供給と副生成物の除去を長期間にわたって効率的に行うことができ、優れた翻訳効果につながります。

二層透析法は、二層透析法または透析法のみを使用する場合と比較して、生産性が4倍から10倍向上します。合成されたプロテオリポソームをセントリフィケーションにより収集し、洗浄バッファーで部分的に精製すると、膜タンパク質の精製プロセスが大幅に短縮されます。この無細胞システムは、操作が簡単で、非常にスケーラブルです。

また、他の方法では発現が難しいメモリータンパク質の作製にも使用できます。この方法は、抗膜タンパク質、抗体産生、SPR、Elisa、AlphaScreenなどの膜タンパク質を使用または標的とする研究や実験に非常に役立ちます。