Name: 卵巣組織における細菌の特性評価と機能予測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ卵巣組織内細菌の特性評価と機能予測の手法。免疫組織化学染色と16S rRNAシーケンスを用いて、がん組織と非がん組織の細菌を比較・同定し、BugBaseとPICRUStで機能を解析します。

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この研究は、中国西安交通大学第一付属病院臨床研究賞(XJTU1AF-2018-017、XJTU1AF-CRF-2019-002)、陝西省科学技術部自然科学の主要基礎研究プロジェクト(2018JM7073、 2017ZDJC-11)、陝西省科学技術部の主要研究開発プロジェクト(2017ZDXM-SF-068、2019QYPY-138)、陝西省共同技術イノベーションプロジェクト(2)017XT-026、2018XT-002)、西安社会開発誘導計画の医学研究プロジェクト(2017117SF/YX011-3)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
西安交通大学第一付属病院婦人科の同僚がサンプル収集に貢献してくれたことに感謝します。

この研究は、西安交通大学第一附属病院の医療制度倫理委員会によって承認されました(No.XJTUIAF2018LSK-139)。インフォームド・コンセントは、すべての在籍患者から得られました。
1. がん群及び対照群に入る基準
<ol><li>癌群については、主に卵巣癌と診断された患者を登録し、腹腔摘出術後、病理学的所見によって漿液性卵巣癌を有することが証明される。</li>
	<li>対照群については、卵巣状態を呈さずに子宮筋腫または子宮腺筋症と主に診断された患者と、子宮摘出術およびサルピンゴ卵巣摘出術を受けた患者を登録する。 注: この標準は明確ではありません。子宮摘出術やサルピンゴ卵巣摘出術を受ける卵巣に影響を与えない疾患を有する患者も登録することができる。</li>
	<li>以下の基準の1つ以上の患者を除外する: 妊娠中または授乳中の女性。 手術の2ヶ月前に抗生物質を服用する。 発熱または炎症マーカーの上昇を有する。 あらゆる種類の炎症を有する。 ネオアジュバント化学療法を受けた。</li>
</ol>2. サンプルを収集する
<ol><li>手術中に、切除された卵巣を無菌チューブに入れ、チューブを液体窒素に入れ、輸送します。手順全体を通して他の何かに触れないようにしてください。</li>
	<li>卵巣を層流キャビネットの下に新しい滅菌ピンセットで約1cmの厚い組織サンプルに分けます。分離後、-80°Cでサンプルを保存します。 注:サンプルを収集するためのすべての手順は、卵巣を分離することを含む無菌です。</li>
</ol>3. 16S rRNA遺伝子の配列
<ol><li>DNAを抽出します。<ol>
<li>2 mL 遠心分離管に1.2 mLの阻害EXバッファーを加えます。その後、180-220 mgのサンプルをチューブに加えます。サンプルを完全に混合させてください(70°C水浴5分間、渦を15s)。</li>
		<li>600 x gで1分間チューブを遠心分離します。</li>
		<li>上清の550 μLを新しい1.5 mLチューブに、遠心分離機を600 x gで1分間配置します。</li>
		<li>30 μLのプロテナーゼKを用いて400μLの上清を別の1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>400 μLのバッファー AL を追加し、15 秒のボルテックスミキサーを使用します。</li>
		<li>70°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>96~100%のアルコールを400μL加えます。15 s のボルテックス ミキサーを使用します。</li>
		<li>600 μL の混合物を吸収カラムに移し、遠心分離機を 13700 g で 1 分間転送します。下のチューブを交換します。この手順を 11 回繰り返します。</li>
		<li>バッファーAW1を500μL、13,700 x gで1分間遠心分離機を加え、下のチューブを交換します。</li>
		<li>バッファーAW2を500μL、13,700 x gで3分間遠心分離機を加え、下のチューブを交換します。</li>
		<li>遠心分離機 13,700 x g で 3 分間</li>
		<li>混合物を新しい1.5 mLチューブに移し、200 μLのバッファーATEを加え、室温で5分間インキュベートし、遠心分離機を13,700 x gで1分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>品質テスト。1%セファロースゲル電気泳動を使用して品質をテストします。サンプル400ng、120 V、30分を加えます。理想的な結果:DNA濃度:≥10 ng/μL、DNA純度:A260/A280= 1.8-2.0、総DNA:≥300 ng。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って、16Sメダゲノムシーケンシングキットを使用してライブラリを準備します。<ol>
<li>PCR を実行します。簡単に言えば、各25 μL PCR反応には、入力として12.5ngのサンプルDNA、2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixの12.5 μL、1μMの各プライマーの5 μLが含まれています。</li>
		<li>次のプロトコルを使用して PCR を実行する: 3 分間 95°C で行われた最初の変性ステップに続いて 25 サイクルの変性 (95°C, 30 s) 、アニーリング (55°C, 30 s) および延長 (72°C, 30 s) と 72°C で 5 分の最終的な伸長.</li>
		<li>メーカーの指示を使用して、磁気ビーズとの反応ミックスからPCR製品をクリーンアップします。</li>
		<li>ステップ 3.3.1 と 3.3.2 を繰り返します。</li>
		<li>品質テスト。ステップ3.2を参照してください。</li>
		<li>ステップ 3.3.3 を繰り返します。</li>
		<li>品質テスト。1%のセファロースゲル電気泳動を使用して不純物をテストし、分光光度計を使用して純度をテストし、濃度をテストするフルオロメーター、および完全性をテストするためのRNAアッセイキットを使用します。製造元のプロトコルに従います。ライブラリを正規化してプールします。600サイクルV3標準フローセルを使用したシーケンス(2 x 300 bpペアエンドリード設定)を使用して、約100,000ペアエンド2 x 300ベース読み取りを生成します。 注:全長プライマー配列:16Sアンプリコンポリメラーゼ連鎖反応(PCR)フォワードプライマー:5' TCGTCGGCGCGTCAGATGTGTGTGTATAAGAGACAG-[CCTACGG] GNGGCWGCAG]および16SアンプリコンPCRリバースプライマー:5' GTCTCGTGGGGGCGcCGGAGATGTGTGTATAAGAGACAG-[ガクタッハVGGGTATCTAATCC]。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 16S rRNA遺伝子シーケンシングデータの解析
<ol><li>ソフトウェアパッケージQIIME 2-20180220でシーケンス品質に基づいて、すべてのサンプルの生の読み取りをフィルタリングします。<ol>
<li>ディレクトリに 3 つのファイルをコピーします: emp ペアエンドsequences_01 1 つの forward.fastq.gz ファイルには、順方向シーケンス読み取りが含まれています。 逆シーケンス読み取りを含む 1 つの reverse.fastq.gz ファイル 関連付けられたバーコード読み取りを含む 1 つのバーコード .fastq.gz ファイル</li>
		<li>実行する qiime ツールのインポート \ --タイプ EMP ペアドエンドシーケンス \ --入力パス emp ペアエンドsequences_01 \--出力パス emp ペア エンドsequences_02.qza</li>
	</ol>
</li>
	<li>プライマーとアダプターシーケンスを削除します。 qiime カットアダプトトリムペア \ --i-デマルチプレックスシーケンス逆多重化seqs_02.qza \ --p-フロントf GCTACGGGGGG \ --p-フロント-r GCTACGGGG --p エラー率 0 \ --品質カットオフ 25 \ --o トリミングシーケンストリム-seqs_03.qza \ --冗長</li>
	<li>両方のペアエンド品質が 25 より低いシーケンス読み取りを短縮します。上記を参照してください --品質カットオフ 25</li>
	<li>シーケンスデータを分析します。<ol>
<li>97%で類似性カットオフを持つ運用分類単位 (OTUs) を形成するシーケンスを収集します。 qiime vsearch デレプリケートシーケンス \ --i シーケンストリム-seqs_03.qza \ --o-レプリケート解除テーブル table_04.qza \ --o デレプリケートされたシーケンス rep-seqs_04.qza ​ qiime vsearch クラスター機能 -クローズリファレンス \ --i テーブル table_04.qza \ --i シーケンス rep-seqs_04.qza \ --i-参照シーケンス97_otus.qza \ --p-perc-ID 0.97 \ --o-クラスター化テーブルテーブル-cr-97.qza \ --o クラスター化シーケンス rep-seqs-cr-97.qza \ --o 比類のないシーケンスは一致しない-cr-97.qza</li>
		<li>OTUs の場合、各サンプルの相対的な量を計算します。豊富な情報はテーブル cr-97.qza にあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ネイティブベイジアン分類器を使用して、RDP トレーニングセット (バージョン 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) を対象とし、すべてのシーケンスを並べ替えます。マップされたタクソン情報はテーブル cr-97.qza にあります</li>
	<li>指定された OTU 内で、シーケンスの主要な一貫性を反映する分類を OTUs に割り当てます。次に、OTUs を整列します。テーブル cr-97.qza と rep-seqs-cr-97.qza を参照してください。</li>
	<li>サンプルグループ情報に基づいて、アルファ多様性(チャオ1、ACE、シャノン、シンプソン、エネス指数を含む)とUniFracベースの主座標分析(PCoA)を実行します。 qiime ツールのエクスポート \ --入力パス テーブル-cr-97.qza \ --出力パスエクスポートフィーチャーテーブル エクスポートフィーチャーテーブル qiime ダイバーシティアルファ \ --i テーブル テーブル-cr-97.qza \ --p-メートル法observed_otus \ --o-アルファ多様性observed_otus_vector.qza qiime ダイバーシティベータ \ --i テーブル テーブル-cr-97.qza \ --p メトリック ブレイカーティス \ --o-距離マトリックスunweighted_unifrac_distance_matrix.qza</li>
</ol>5. 細菌機能の予測
<ol><li>細菌の特性の関連表現を予測するには、 BugBase21を使用します。BugBase の入力 OTU テーブルは、次のコマンドを使用して作成されます。 バイオム変換 -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv バイオム変換 -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU テーブル" --to-json 注:予測は、6つの表現型カテゴリ(非公表 )(https://bugbase.cs.umn.edu/):グラム染色、酸素耐性、バイオフィルムを形成する能力、移動要素含有量、病原性、酸化ストレス耐性に基づいています。</li>
	<li>PICRUStによるメタゲノムの機能組成を、マーカー遺伝子データの利用と参照ゲノム22を含むデータベースを予測する。 make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom & normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions。L1.txt</li>
	<li>STAMP23,24の助けを借りて、各グループ間の関数の違いを分析します。ソフトウェアを操作するには、引用文献を参照してください。</li>
</ol>6. データ
<ol><li>統計ソフトウェアを使用して、調査結果の有意性を計算します。統計的有意性の指標は 、P < 0.05 として設定する必要があります。</li>
	<li>学生のt検定で年齢とパリティの違いを評価します。チア二乗試験により更年期状態、高血圧および糖尿病の歴史の違いを評価する。マン・ホイットニーU検定による卵巣細菌分類法の数の差を評価する。</li>
</ol>

<ol><li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li>
<li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li>
<li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li>
<li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875(2017).</li>
<li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li>
<li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602(2016).</li>
<li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li>
<li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li>
<li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+cancer+oncobiome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li>
<li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li>
<li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309(2019).</li>
<li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146(2019).</li>
<li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+%28ECbiome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213(2019).</li>
<li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122(2016).</li>
<li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li>
<li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814(2013).</li>
<li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAMP%3A+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123(2014).</li>
<li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BDark%26%2334%3B+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biologica+Hungarica%22%5BJournal%5D)">34;Dark&#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

卵巣癌は女性の生殖能力に顕著な影響を及ぼす 25.ほとんどの卵巣癌患者は後期段階で診断され、5年生存率は30%未満である18.肝臓、膵臓、脾臓を含む腹部固形内臓の細菌の確認が発表されている。子宮頸部が2、3、4、5を囲んでいないために、上の女性の生殖管に細菌が存在することが起こる。しかし、腹部固形内臓である卵巣が無菌か否かはまだ決定されていない。さらに、卵巣の細菌が卵巣癌に関連しているかどうかも重要な問題です。
我々が見つけた細菌の有意な違いは、異なるグループ間で比較された。上記の手順はすべて、器具、試薬、装置、およびプロトコル全体の動作を含む、厳密に無菌であった。さらに重要なことは、良性子宮疾患の患者からの卵巣を対照群として使用し、...

近年、腎臓、脾臓、肝臓、卵巣1、2などの腹部固形内臓内に細菌の存在を証明する記事が増えている。Gellerら.膵臓腫瘍に細菌が見つかり、これらの細菌は化学療法薬2であるゲムシタビンに耐性があった。S. マンフレド・ヴィエイラら. エンテロコッカスガリナルムはリンパ節、肝臓および脾臓に移植可能であり、自己免疫を駆動することができると結論付けた。
子宮頸部は防御体としての役割を果たすため、子宮、卵管、卵巣を含む上部の女性生殖管内の細菌は最小限に研究されてきた。しかし、近年、いくつかの新しい理論が確立されています。細菌は、月経周期の間に、ムチン4,5の変化により子宮腔にアクセスできる。さらに、ツェルボマノラキスらは、子宮が卵管と共に、卵巣の内分泌系によって制御される蠕動性ポンプであることを確認し、この配置により細菌が子宮内膜、卵管、および卵巣6に入ることを可能にする。
細菌検出法の開発により、上部の生殖管はもはや謎ではありません。Verstraelenら.バーコード付き対端シーケンシング法を用いて、16S RNA遺伝子7のV1-2超可変領域を標的にして子宮細菌を発見した。Fangら.子宮内膜ポリープ患者にバーコードシーケンシングを採用し、多様な子宮内細菌8の存在を明らかにした。さらに、16S RNA遺伝子を用いることによって、Miles et al.と Chenら.それぞれ5,9 サルピンゴ卵巣摘出術と子宮摘出術を受けた女性の生殖器系に細菌が見つかった。
近年、腫瘍組織の細菌が注目を集めています。Banerjeeら.マイクロバイオームシグネチャが卵巣癌患者とコントロール10の間で異なっていることを発見した。ノキシナトロナムシビリカムは腫瘍期に関連しており、卵巣癌11の診断にはメサノサルシナ・バクオラタが用いられる。卵巣癌に加えて、胃、肺、前立腺、乳房、子宮頸部、および子宮内膜などの他の癌は、細菌12、13、14、15、16、17、18と関連することが証明されている。Pooreらは、初期段階の癌スクリーニング19を予見して、微生物に基づく腫瘍学診断の新しいクラスを提案した。本プロトコルでは、これら2つの組織における細菌の組成と機能を比較することにより、癌性と正常な卵巣組織の違いを調べた。
免疫体化学染色および16S rRNA遺伝子シーケンシングを行い、卵巣内の細菌の存在を確認した。癌性および非癌性卵巣組織における卵巣細菌の差異および予測機能を研究した。結果は、卵巣組織における細菌の存在を示した。 アノキシナトロナムシビリカム と メサノサルシナ・バクオラタ は、それぞれ卵巣癌の段階および診断に関連していた。両群に存在していた46個の有意に異なるKEGG経路を比較した。

<table><tbody><tr><td>2200 TapeStation ソフトウェア</td><td>Agilgent 米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmpliSeq Illumina ライブラリの準備、インデックス、およびアクセサリ</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image-pro plus 7</td><td>メディア サイバネティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ ASP 300S</td><td>ライカ バイオシステム部門 ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ EG 1150</td><td>ライカ バイオシステムズ 部門ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ RM2235</td><td>ライカバイオシステムズ事業部 ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>LPS コアモノクローナル抗体、クローン WN1 222-5</td><td>Hycult Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RxnPure Plus 磁気ビーズ</td><td>オメガバイオテック</td><td>M1386-00</td><td></td></tr><tr><td>マグバインドユニバーサル病原体 96 キット</td><td>オメガバイオテック</td><td>M4029-01</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>イルミナ</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr>シル<tr><td>バデータベース</td><td>マックスプランク海洋微生物学研究所とジェイコブス大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クォンティフルオアdsDNAシステム</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>トリムマチック</td><td>Bj&ouml;rn Usadel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZytoChem Plus(HRP)抗ウサギ(DAB)キット</td><td>Zytomedシステム</td><td>HRP008DAB-RB</td><td></td></tr></tbody></table>

卵巣組織における細菌の特性評価と機能予測

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

「無菌」の女性の上部生殖管の理論は、細菌検出の進歩のためにますます反対に遭遇しています。しかし、卵巣に細菌が含まれているかどうかはまだ確認されていません。本明細書では、卵巣組織における細菌を検出する実験が導入された。我々は、癌群の卵巣癌患者と対照群の非癌性患者を選んだ。16S rRNA遺伝子シーケンシングは、卵巣組織の細菌を癌および対照群と区別するために使用された。さらに、BugBaseおよびPICRUStを用いて、同定された細菌の機能組成を予測した。近年、多くの臓器が細菌を収容することが証明されているので、この方法は他の内臓や組織にも使用することができます。内臓および組織における細菌の存在は、科学者が癌および正常組織を評価するのに役立ち、癌の治療に役立つ可能性がある。

患者 合計16人の有資格患者が研究に含まれていた。対照群には、良性子宮腫瘍の診断を受けた10人の女性が含まれていた(その中で、3人の患者が子宮筋腫と診断され、7人の患者が子宮腺筋症と診断された)。一方、癌群には漿液性卵巣癌の診断を受けた6人の女性が含まれていた(その中で、2人の患者がステージIIと診断され、そのうち2人がステージIIIと診断された)。以下の特徴は、対照群の患者と癌群の間に違いは見えなかった:年齢、更年期状態、パリティ、高血圧の既往歴、および糖尿病の既往歴(表1))。
表1:患者統計この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61878/Table1.xlsx" target="_blank">表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
両群の卵巣細菌種の豊かさと多様性 免疫検査染色を用いた細...

免疫組織化学染色と16SリボソームRNA遺伝子(16S rRNA遺伝子)シーケンシングを行い、癌性および非癌性卵巣組織の細菌を発見し、その場で区別した。バクテリアの組成と機能の違いは、未観測状態の再構築によるBugBaseおよび系統的なコミュニティの調査(PICRUSt)を用いて予測した。

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

このプロトコルは、卵巣組織の細菌を発見し、その機能を予測するように設計されています。免疫組織化学染色および16S rRNAシーケンシングは、その際の癌性および非癌性卵巣組織における細菌を発見および区別するために使用された。細菌の報酬と機能的な違いは、観察されていない日の再建によるコミュニティのBoPおよび細胞遺伝学的調査を用いて予測される。私たちのプロトコルは、その現場で卵巣組織から細菌を抽出することを目的としています。また、あらゆる種類の腫瘍の細菌を発見するために使用することができます。私たちのプロトコルの主な利点は、それが簡単で便利であり、ほぼすべてのラボで実現できることです。また、結果を得るのも迅速です。プロトコルの練習中に、 オフサイト腫瘍組織の細菌を除外することが重要です。したがって、このプロトコルのすべての手順は無菌である必要があります。手術中、卵巣を約1センチメートルの厚さの組織サンプルに分けて、新しい滅菌ピンセットを使用した。手順全体の間に他の何かに触れないようにしてください。分離後、サンプルを無菌チューブに取り出し、液体窒素に入れて送出します。サンプルをマイナス80°Cで保存します。ホルマリンで組織を固定し、パラフィンで埋め込みます。このプロトコルはここで一時停止することができます。組織は、より長い保存のために室温に保つことができます。さらに手順を実行するために、サンプルを5マイクロメートルシリアルセクションに切ります。その後、サンプルを乾燥させます。サンプルに対して、パラフィン脱水を行います。抗原を取り出すためには、EDTAバッファーでの10分間のマイクロ波処理が必要です。0.3%の水素を含むPBSにサンプルを浸します。内因性ペルオキシダーゼ活性を停止するために20分間パーオキシド化する。LPSコアで抗体EMAを、1以上300の濃度で行う。そして、摂氏4度で一晩それを維持します。細菌を発見するために、DAP基質キットを用い、HRPの存在を検出する。メーカーの指示に基づいて、HRPポリマー、抗ウサギ抗体を使用してください。テーブルコンセントレータを使用して、抗体を完全に組み合わせます。PBSを使用して、結合されていない抗体を排除します。メーカーの指示に従って化学染色を行い、サンプルを水中に流します。サンプルに脱水を行います。署名によるスーツのサンプル。そして、メーカーのプロトコルに基づいてイメージングプロプラス準備ライブラリを使用してサンプルとして入力します。遺伝子特異的配列とイルミナアダプターのオーバーハングヌクレオチド配列からなるプライマーパターンを練習する。rRNA遺伝子配列上の細菌16sのV4領域の出生率を増幅するために、アンプリコンPCRを用いて入力されたDNAサンプルから鋳型を増幅する。Mag-Bind RxNPure Plus 磁気ビーズを使用して、PCR産物から反応ミックスを除去します。インデックス付き PCR 増幅を 2 度目に実行します。ライブラリをチェックするには、Agilent 2200 TapeStationを使用します。量子フルーター dsDNA システムを使用して、ライブラリを定量化します。600サイクルのv3標準フローセルは、約100,000個のペアエンドを生成します。2回300ベース3。ライブラリは非正規化され、プールされ、順序付けられます。すべてのサンプルの生のレートは、Trimmomaticによるシーケンシング品質に基づいてフィルトレートされます。プライマーとアダプターのシーケンスは両方とも削除する必要があります。ペアと 25 未満の品質の両方を持つシーケンス読み取りは短縮する必要があります。ソフトウェアパッケージQIIMEで16s rRNAを分析します。類似性カットオフが 97% の OTUS を形成する配列を集める OTUs の場合、各サンプルで相対的な量を計算する必要があります。すべてのシーケンスを並べ替える RDP トレーニング セットに含まれるベイジアン分類子を使用します。OTU を指定すると、シーケンスの主要な一貫性を持つ分類が OTUs に割り当てられます。OTUs は、サンプル グループ情報に基づいて、Silva データベースに配置されます。アルファ多様性と UniFrac ベースの主座標系の解析を実行します。細菌の特性の関連のプレゼンテーションを予測するには、BugBaseを使用します。PICRUStでのメタゲノムの機能組成を予測します。モニタリングデータと参照ゲノムを含むデータベースを用いて、STAMPソフトウェアの助けを借りて、各グループ間の異なる機能を分析します。1 つの統計ソフトウェアを使用して結果を計算します。統計的有意性の指標は、pを0.05未満に設定する必要があります。学生のt検定で、年齢とパリティを含む交点因子を計算します。Chi-square検定により更年期状態、高血圧および糖尿病の歴史を計算します。マン・ホイットニーU検定で卵巣細菌分類法の数を計算します。16人の患者がこの研究に登録された。BugBaseは、予測されたメタゲノムの分析を実践するために使用されました。抗菌LPS抗体を用いた卵巣の病原性および免疫体化学の可能性この図は、がんおよび対照群における細菌の豊かさと多様性を示しています。16S rRNAシーケンシングによって明らかにされる。この数字は観測種指数である。Chao1指数、ACE指数、シャノン指数、偶数指数、シンプソン指数それぞれ。この図では、フィラの相対的な存在量と、卵巣サンプル中の12種の最も豊富な細菌種が示されている。図A、B、CおよびD.は、対照群および卵巣癌群における患者の卵巣におけるパネルの相対的な存在量を意味する。対照患者および卵巣癌群の卵巣における12種の最も豊富な細菌種の相対的な存在量。これは最も一般的です, PCoAとアノキシナトロナムシビリカムとメサノサルシナバクオレータの相対的な豊富を使用してクラスター化.図 A は、PCoA を使用してクラスタ化された一般的な一般的な値を示しています。PC1 と PC2 は x 軸と y 軸にプロットされます。赤いブロックは卵巣癌群のサンプルと等しい。青い円は、対照群のサンプルと等しくなります。卵巣癌群からのサンプルは、対照群の他のサンプルから分離することができる。図Bは、PCoAを使用してクラスタ化された一般的な一般的な値を示しています。PC1 と PC2 は、x 軸と y 軸にプロットされます。赤いブロックは卵巣癌群のサンプルと等しい。青い固体円は、子宮筋腫を有する患者からのサンプルに等しい。そして、青い中空円は、子宮内筋症の患者のサンプルに等しい。図Cは、アノキシナトロナムシビリカムの相対的な存在量を示す。図Dはメサノサルシナ・バクオラタである。この図は、予測されたメタゲノミクスのBugBase分析です。癌群における卵巣の潜在的に病因的および酸化的ストレス耐性表現型は、対照群のそれよりも強かった。この図は、PICRUSt分析による癌と対照群の間のKEGG経路空間が有意に異なる。我々は我々のサンプルを取得するとき、新しい滅菌ピンセットのペアが必要です。サンプルへの潜在的な汚染に注意してください。その細菌のオフサイト腫瘍組織は、解決に大きな影響を与える可能性があります。制御グループをすべてのステップに設定することが好ましい。潜在的な汚染の影響を減らすために。

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Cancer Research

がん研究

我々は、確立するための方法論を記述する...

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卵巣組織における細菌の特性評価と機能予測

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