ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配
October 20th, 2020
我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。
Thermobia domesticaは基底昆虫であるため、この種の遺伝学的研究により、動力飛行や変態など、昆虫の主要なイノベーションの進化の根底にあるメカニズムが明らかになります。このプロトコルは、培養の維持から、実験室モデル種としてThermobiaを実装するための卵マイクロインジェクションまで、基本的な技術をカバーしています。この方法は、RNIを介した遺伝子ノックダウンやサーモビアにおけるトランスジェネシスなど、他の遺伝ツールの適用にも使用できます。
野生型と突然変異体の個体群を、通常の人工魚の餌、上部に通気孔のあるプラスチックカップの水、昆虫を隠すための折りたたまれた紙、卵を産むための層状の綿が入った大きなプラスチック容器に保持します。すべてのT.domestica培養物を摂氏37度のインキュベーター内に保管し、各容器内の相対湿度を60〜80%に設定する卵収集コロニーを準備するには、約20人のオスと20人のメスの成虫を、食物、水道、折りたたまれた紙、および産卵用の層状の綿の小片が入った中型の容器に移します。いくつかのコロニーを設置して、短期間で多数の段階的な胚を取得します。
注射当日は、容器内の綿を新しい綿と交換してください。8時間後、鉗子を使用して層を分離することにより、層状の綿から卵を収集します。卵と卵の間に2mmの距離を保ちながら、濡れたペイントブラシを使用して、両面テープに卵を合わせます。
すべての卵子は、卵子の縦軸が注入側を向くように向きを変える必要があります。注入中にしっかりと保持するために、絵筆で卵をそっと押し下げます。2マイクロリットルのgRNA CAS9溶液をマイクロローダーでガラス注入キャピラリーにロードします。
注入する前に、溶液中に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、針を軽くたたいて気泡を取り除きます。針先を鉗子でわずかに折って形状を最適化し、目詰まりを防ぎ、一連の注射全体で耐久性を向上させます。
卵子の縦軸の中点に針を挿入し、少量の溶液を注入します。注射中の電子マイクロインジェクターの構成は、針先の形状に応じて調整してください。注入した卵は、相対湿度60〜80%、摂氏37度の適切なサイズの容器に保管してください。
注入した卵子を定期的にチェックし、傷んだ卵子は廃棄して真菌の増殖を防ぎます。卵の上で菌が繁殖しすぎている場合は、卵の表面を70%エタノールできれいにします。孵化する前に、注入された卵が入ったスライドガラスをタルカムパウダーに浸して、両面テープの表面をコーティングします。
これにより、ハッチングされたニンフの積み重ねが防止されます。粉体塗装されたスライドガラスを、食品、水、折りたたんだ紙を入れた中型の容器に移します。G1ニンフをアスピレーターまたはペイントブラシで24ウェルプレートに分離します。
人工的な定期的な魚の餌の供給を維持します。湿度60〜80%の給水を備えた大きな容器に24ウェルプレートを置きますピンチし、鉗子を使用してニンフまたは成虫からセルカスを引き出し、エタノールの50マイクロリットルを含む0.2ミリリットルのチューブに収集します。採取したサンプルはマイナス20°Cで保管し、長期保存してください。
蓋を開けた状態でサンプルチューブをサーマルブロックに70°Cで15分間置き、エタノールを蒸発させます。産卵後8時間以内にgRNA CAS9リボ核タンパク質複合体を胚に注入すると、gRNA標的部位にインデルが生じます。これにより、注入された世代の一部の細胞に両対立遺伝子変異が生じ、通常、変異型モザイク表現型が得られます。
このプロトコルを使用して、白色遺伝子を標的とするように設計されたgRNAを注入すると、G0ニンフの32.6%が複眼と背部の色素沈着が部分的に失われました。G0 成人および変異 G1 個体の生殖細胞系形質転換の評価は、ゲノム PCR とそれに続くヘテロ二重移動度アッセイによって行われました。G1サンプルでは、野生型サンプルと変異型サンプルの間の差動バンドパターンが明確に区別できます。
Thermobiaのゲノム編集は、昆虫の未熟な形質の根底にある遺伝的メカニズムを解析するための堅実なアプローチを提供します。それは、彼らの卓越した成功と私たちの成功の背後にある秘密を探るのに役立ちます。
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概要
この記事では、ヒメバチ科のThermobia domesticaの卵を育て、マイクロインジェクションを行うための包括的なプロトコルを提示し、ゲノム編集を通じて変異株の生成と維持を可能にします。説明された方法は、遺伝学的研究のための実験室モデル種としてのThermobiaの使用を強化します。
主要な研究要素
科学の分野
- 遺伝学
- 昆虫生物学
- 実験室プロトコル
背景
- Thermobia domesticaは基礎的な昆虫種です。
- この種に関する遺伝学的研究は、昆虫の進化に関する洞察を明らかにすることができます。
- 昆虫における重要な革新には、飛行能力と変態が含まれます。
- このプロトコルは、Thermobiaにおける遺伝子工学ツールの応用をサポートします。
研究目的
- Thermobia domesticaを遺伝学研究のためのモデル生物として確立すること。
- 卵のマイクロインジェクションの詳細な方法論を提供すること。
- 野生型と変異体集団の維持を容易にすること。
使用された方法
- 大きなプラスチック容器での培養維持。
- ゲノム編集のための卵のマイクロインジェクション。
- 人工魚餌による定期的な給餌。
- 37°Cと60-80%の湿度での環境条件の設定。
主要な結果
- 卵収集のための繁殖コロニーの成功的な確立。
- 研究のための段階的な胚の効率的な生成。
- 野生型と変異体の両方の株の維持。
- さらなる研究のための遺伝子工学ツールの応用。
結論
- Thermobia domesticaは遺伝学的研究の有望なモデルです。
- 説明されたプロトコルは遺伝子操作の実現可能性を高めます。
- 将来の研究はこれらの方法を進化の洞察のために活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Genome editing in Thermobia domestica enables functional genetic interrogation in a basal insect model, supporting evolutionary and developmental biology pipelines. The protocol's robust microinjection and colony management steps facilitate reproducible generation of mutant strains, expanding the toolkit for non-traditional model systems. This capability strengthens early discovery and target validation for insect biology and comparative genomics portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function in a basal insect lineage.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-phenotype relationships.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of evolutionary innovations.
- Provides a platform for functional target validation in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized protocols for embryo microinjection and mutant generation.
- Delivers reproducible, quantitative phenotypic outputs for downstream analysis.
- Prepares validated biological systems for genetic screening workflows.
- Enables scalable colony management for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with comparative studies of gene function across insect taxa.
- Supports continuity from genetic manipulation to phenotypic assessment.
- Provides a foundation for translational biomarker discovery in evolutionary contexts.
- De-risks preclinical model selection by expanding available genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early genetic manipulation to phenotypic screening and comparative analysis in insect models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in a basal insect system.
- Screening: Provides reproducible mutant phenotypes for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of gene editing outcomes via PCR and mobility assays.
- Translational Research: Facilitates cross-species genetic comparisons relevant to evolutionary biology.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other non-traditional insect models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function studies and evolutionary hypotheses.
- Operational Value: Standardizes microinjection and colony management for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions in comparative genomics and model selection.
- Portfolio Impact: Expands the range of genetically tractable insect models for R&D prioritization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection and insect colony management.
- Needs access to controlled incubators and humidity regulation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible mutant generation.
- Adaptation may be necessary for other insect species with differing biology.
- Limitations include species-specific handling and environmental requirements.
