ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

Thermobia domesticaは基底昆虫であるため、この種の遺伝学的研究により、動力飛行や変態など、昆虫の主要なイノベーションの進化の根底にあるメカニズムが明らかになります。このプロトコルは、培養の維持から、実験室モデル種としてThermobiaを実装するための卵マイクロインジェクションまで、基本的な技術をカバーしています。この方法は、RNIを介した遺伝子ノックダウンやサーモビアにおけるトランスジェネシスなど、他の遺伝ツールの適用にも使用できます。

野生型と突然変異体の個体群を、通常の人工魚の餌、上部に通気孔のあるプラスチックカップの水、昆虫を隠すための折りたたまれた紙、卵を産むための層状の綿が入った大きなプラスチック容器に保持します。すべてのT.domestica培養物を摂氏37度のインキュベーター内に保管し、各容器内の相対湿度を60〜80%に設定する卵収集コロニーを準備するには、約20人のオスと20人のメスの成虫を、食物、水道、折りたたまれた紙、および産卵用の層状の綿の小片が入った中型の容器に移します。いくつかのコロニーを設置して、短期間で多数の段階的な胚を取得します。

注射当日は、容器内の綿を新しい綿と交換してください。8時間後、鉗子を使用して層を分離することにより、層状の綿から卵を収集します。卵と卵の間に2mmの距離を保ちながら、濡れたペイントブラシを使用して、両面テープに卵を合わせます。

すべての卵子は、卵子の縦軸が注入側を向くように向きを変える必要があります。注入中にしっかりと保持するために、絵筆で卵をそっと押し下げます。2マイクロリットルのgRNA CAS9溶液をマイクロローダーでガラス注入キャピラリーにロードします。

注入する前に、溶液中に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、針を軽くたたいて気泡を取り除きます。針先を鉗子でわずかに折って形状を最適化し、目詰まりを防ぎ、一連の注射全体で耐久性を向上させます。

縦軸の中点に針を挿入し、少量の溶液を注入します。注射中の電子マイクロインジェクターの構成は、針先の形状に応じて調整してください。注入した卵は、相対湿度60〜80%、摂氏37度の適切なサイズの容器に保管してください。

注入した卵子を定期的にチェックし、傷んだ卵子は廃棄して真菌の増殖を防ぎます。卵の上で菌が繁殖しすぎている場合は、卵の表面を70%エタノールできれいにします。孵化する前に、注入された卵が入ったスライドガラスをタルカムパウダーに浸して、両面テープの表面をコーティングします。

これにより、ハッチングされたニンフの積み重ねが防止されます。粉体塗装されたスライドガラスを、食品、水、折りたたんだ紙を入れた中型の容器に移します。G1ニンフをアスピレーターまたはペイントブラシで24ウェルプレートに分離します。

人工的な定期的な魚の餌の供給を維持します。湿度60〜80%の給水を備えた大きな容器に24ウェルプレートを置きますピンチし、鉗子を使用してニンフまたは成虫からセルカスを引き出し、エタノールの50マイクロリットルを含む0.2ミリリットルのチューブに収集します。採取したサンプルはマイナス20°Cで保管し、長期保存してください。

蓋を開けた状態でサンプルチューブをサーマルブロックに70°Cで15分間置き、エタノールを蒸発させます。産卵後8時間以内にgRNA CAS9リボ核タンパク質複合体を胚に注入すると、gRNA標的部位にインデルが生じます。これにより、注入された世代の一部の細胞に両対立遺伝子変異が生じ、通常、変異型モザイク表現型が得られます。

このプロトコルを使用して、白色遺伝子を標的とするように設計されたgRNAを注入すると、G0ニンフの32.6%が複眼と背部の色素沈着が部分的に失われました。G0 成人および変異 G1 個体の生殖細胞系形質転換の評価は、ゲノム PCR とそれに続くヘテロ二重移動度アッセイによって行われました。G1サンプルでは、野生型サンプルと変異型サンプルの間の差動バンドパターンが明確に区別できます。

Thermobiaのゲノム編集は、昆虫の未熟な形質の根底にある遺伝的メカニズムを解析するための堅実なアプローチを提供します。それは、彼らの卓越した成功と私たちの成功の背後にある秘密を探るのに役立ちます。