Name: ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶ 高速フォトメトリー系を用いたヒトiPS細胞由来心筋細胞の単細胞光学作用電位測定法。従来のパッチクランプ法より簡便で高スループットな電気生理学測定が可能となり、創薬毒性スクリーニングや不整脈評価に応用できます。

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著者らは、この出版物の生産コストをカバーする彼らの種類の財政的貢献のためにケアンリサーチ株式会社を認めたいと思います。さらに、イネス・ミューラー氏とステファニー・ケステル氏の優れた技術サポートに感謝します。
著者らの研究は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK)、ドイツフォルシュングスゲミンシャフト(DFG、 ドイツ研究財団、VO 1568/3-1、IRTG1816 RP12、SFB1002 TPA13、ドイツのエクセレンス戦略の下で - EXC 2067/1- 390729940)とエルゼ・クレナー・フレゼニウス・スティフトゥン(EKFS)2016_A20 FS)。

1. 細胞製剤
注:このプロトコルで使用されるヒトiPSCは、健康なドナーから誘導され、前述の12、13、14のように、WNTシグナルおよび乳酸精製技術の完全に定義された小分子変調を使用して単層で区別された。iPSC-CMは、以下に概説する培養培地で2〜3日ごとに維持された。
<ol><li>基礎培地(RPMI 1640)および2%サプリメント(B27)の培地を調製する。4 °Cで保管。 室温(RT)で使用してください。</li>
	<li>基底培地(RPMI 1640)、2%サプリメント(B27)および1:2000 ROCK阻害剤のめっき培地を調製します。4 °Cで保管。 RT で使用します。</li>
	<li>コートは10 mmの丸いガラス#0のカバースリップを1:60の1:60の気に入った基膜マトリックスの150のmmと4の4時間の4°Cでインキュベートする。 注:カバースリップの体積の最適化は、こぼれを防ぐために十分な表面張力を維持しながら、ガラス全体が覆われていることを確認するために必要です。150 μL は、10 mm の丸いカバーリップに推奨されます。バッチサイズ、カバースリップタイプ、カバースリップ容積および培養プレートタイプは、実験者のニーズに適することができる。</li>
	<li>EDTAベースの細胞解離試薬とのiPSC-CM解離を開始します。1,000 μL ピペットで静かに洗い流して、単層が完全に切り離されていることを確認します。</li>
	<li>細胞懸濁液を15mLチューブに移し、二重容積メッキ媒体を加えます。遠心分離機 10分 100 x g.</li>
	<li>ペレットを、メッキ媒体の所望の容積(再懸濁液量)で再懸濁する。手動または電子的にセルをカウントします。</li>
	<li>カバースリップ当たりの最適密度(15,000)を選択し、後で単離された細胞分析を可能にします。</li>
	<li>この望ましい密度ですべてのカバーリップをプレートするために必要な「アクティブ」細胞懸濁液(A)の体積を計算します。次の式を適用し、別のチューブに引き出します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>各カバースリップを所望のボリュームに収めるために必要な追加めっき媒体(B)の体積を計算します。次の式を適用し、結果のボリュームをアクティブサスペンションのチューブに追加します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>カバースリップからマトリックスを取り外し、セルサスペンション(A+B)の「カバースリップボリューム」を各カバースリップに適用します。細胞の分布を確保するためにチューブ内で定期的に再中断します。</li>
	<li>37°Cで1時間インキュベートする。めっき培地でウェルを軽く充填します。</li>
	<li>24時間後、培地を通常の培養培地と交換し、2~3日毎に維持する。</li>
</ol>2. 実験的なセットアップ
<ol><li>反転した蛍光顕微鏡に40倍の拡大率、高い開口レンズ(N.A:&gt;0.75)を装備して実験を行います。</li>
	<li>高速切り替え暖かい白色LEDを顕微鏡の送信された照明ポートに結合する。透過光路にシンプルな赤色660 nmフィルタを挿入します。 注:この光は、緑色の蛍光信号を汚染することなくサンプルを観察するために、光測定実験を通して活性化することができます。</li>
	<li>フォトメトリー記録用の高速スイッチング470 nm LEDヘッドを取り付けます。470/40励起フィルターを顕微鏡の蛍光ポートに挿入して、LEDによって発生する光をクリーンアップします。 メモ:最適な信号定量を行うため、光出力の高速フィードバック制御を備えた照明システムを推奨します。</li>
	<li>顕微鏡内の鏡ユニットカルーセルに495nmのロングパスビームスプリッターを含む顕微鏡キューブを挿入します。</li>
	<li>可変フィールドダイヤフラムを含む検出アームを顕微鏡Cマウントポートに装着し、対象領域を選択できるようにします。</li>
	<li>別に顕微鏡に光増倍検出器(PMT)とUSBカメラを組み合わせる。これは、排出ガス検出システムの基礎を形成します。</li>
	<li>565 nmのロングパスビームスプリッターと535/50のエミッションフィルタを含むフィルタキューブをPMTポートに挿入します。これは2つの探知器間の放出の光を割る。 注:発光検出システムの送信ポートに取り付けられたカメラは、すべての実験を通して明視野下で透過光を検出することができます。</li>
	<li>PMT を電源装置と PMT アンプに結合します。PMTアンプ出力をデータ収集システムのアナログ入力ピンに接続します。</li>
	<li>PMTからのアナログデータを1kHz以上でフィルタリングします。</li>
	<li>ナイキスト基準を満たし、エイリアスを防ぐために、アナログ信号(2 kHz以上)に存在する最も高い周波数の2倍以上の周波数でデータをデジタル化します。</li>
</ol>VF2.1Cl によるセルラーローディング
注:この染料を含むすべてのステップは、低照度条件で行う必要があります。
<ol><li>タイロードの浴液(mM)を準備する:140 NaCl、10 HEPES、10グルコース、4KCl、1 MgCl2、2CaCl2、pH= 7.35、37°Cに暖かい。</li>
	<li>1,000x VF2.1Clの5 μLと20%可溶化ポロクサマー溶液の50 μLを混合して、マイクロ遠心チューブに溶液をローディングするアリコートを用意します。</li>
	<li>20 mm ペトリ皿に 5 μL の加温タイローデ溶液(合計0.1x染料濃度)を5 mL塗布します。 注意: 最終染料濃度は0.1倍です。これはメーカーが提案した1/10thです 。これにより、リソースを節約し、ごくわずかな細胞毒性を保証し、重要なことに、高い信号対雑音比を持つロードされた細胞からの明確な光信号を保持します。</li>
	<li>iPSC-CMカバースリップを1枚皿に加え、37°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>加熱された生細胞イメージングチャンバーを組み立てます。顕微鏡の段階に取付け、500 μL の新鮮なタイローデの溶液で満たします。</li>
	<li>37 °Cで新鮮なタイロードの溶液でカバースリップを洗います。</li>
	<li>iPSC-CMカバースリップを、細かいポイント鉗子を使用して、あらかじめ温めた浴室に慎重に塗布してください。 注:チャンバーとその内容物が常に生理学的温度で加熱されていることを確認してください。必要に応じて、温めたタイローデの溶液の連続灌流から始めます。</li>
</ol>4. 電界刺激
注: iPSC-CM の外部トリガーはオプションですが、セルラーダイナミクスと実験パラメータの標準化に役立ちます。分析の容易さを高め、周波数依存効果の調査を可能にします。
<ol><li>5 mm離れた場所に2つの白金電極を付けて、刺激インサートを記録チャンバーに取り付けます。</li>
	<li>外部刺激装置を刺激インサートに接続します。0.5 Hz の 5 ms バイポーラ フィールド パルスに設定します。</li>
	<li>1 Vから上向きの刺激を増加させることにより、最適な刺激電圧を決定します。閾値刺激は、セルが収縮し始める最も低い電圧として定義されます。このしきい値を約25%上回る電圧を適用します。通常の範囲は1 V~30Vです。</li>
	<li>外部刺激器で刺激周波数を固定するか、取得ソフトウェアでトリガーします。</li>
</ol>5. 光学的なアクションポテンシャル獲得
注: このプロトコルは、取得および分析に商用ソフトウェアを使用します。
<ol><li>透過光路とUSBカメラを使用して、明視野ビューで筋細胞を可視化します。</li>
	<li>孤立した細胞を選択し、対象の細胞からの光のみを監視することを保証するフィールドダイヤフラムで光学路をしっかりと切り取ります。</li>
	<li>PMTアンプを起動し、PMT電源を750Vに設定します。</li>
	<li>刺激プロトコル(ステップ4を参照)を取得ソフトウェアと一緒に実行し、同時に470 nm励起光をアクティブにします。後者はリモートパネルを介して行うか、固定強度(TTL信号)で自動化することができます。</li>
	<li>PMTアンプのゲインとオフセットを調整して、信号が飽和せず、記録システムの検出範囲に最適化されていることを確認します。</li>
	<li>安定したアクション電位を確実に検出する、10のスイープを記録します。</li>
	<li>記録を続け、すぐに顕微鏡ステージを動かして、細胞を欠いた領域からバックグラウンド信号を短時間取得します。励起ライトをオフにします。 注: この背景値 (Fオフセット ) は、任意のバックグラウンド蛍光を考慮するために使用されます。</li>
	<li>所望ならば、1μMニフェジピンなどの参照薬を局所的にパーフューズし、薬理学的操作に対する細胞応答を同定する。</li>
	<li>順次的に、新しいセルを選択するたびに、ステップ 5.2 ~ 5.7 を繰り返します。必要に応じてカバーリップを交換して、1座って高い実験回転率を確保します。 注 : 読み込みおよびイメージ取得のプロトコルについては 、図 2を参照してください。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>解析ソフトウェアで保存された記録を開き、1つのセルから刺激されたアクション電位を含む平均10スイープを開きます。</li>
	<li>Fオフセット を表すベースライン信号の平均を取り、平均されたトレースからこれを減算します。</li>
	<li>次の式∆F/F0を計算します(Fは蛍光を測定し、F0は拡張蛍光です)。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>トレースベースライン(拡張期)と対象領域(AP)を特定し、所望の心臓行動電位パラメータを測定する。これには、50%(APD50)および90%(APD90)の再分極の減衰時間が含まれますが、これらに限定されません。</li>
	<li>この単一のセルからスプレッドシート ソフトウェアにデータをエクスポートします。</li>
	<li>すべての録画について、手順 6.1 ~ 6.5 を繰り返します。適切な不対検定または分散分析で結果を評価します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> 図2:読み込みおよび画像取得プロトコル(A) iPSC-CM およびネイティブ心筋細胞用の完全な VF2.1Cl 負荷プロトコルのフローチャート。(B) ビームスプリッタ(BS)と、このプロトコルで使用されるフィルタ構成の簡略化された概略で、膜貫通電圧の変化に応じてVF2.1Cl発光の励起および検出を行う。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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</ol>

ケアンリサーチ社は、ビデオファイルの制作コストをカバーすることにより、この出版物をサポートしました。

電気生理学的モデリングや心臓薬スクリーニングに適した単離されたiPSC-CMから詳細なAPプロファイルを容易に取得するための基本的なプロトコルについて説明する。私たちは、インジケーター機能と方法論的忠実性の両方を示唆する、まばらなシードのiPSC-CMから定期的で堅牢なAPを検出します。
iPSCリプログラミングのための商業的方法論の広いスペクトルと心臓分化プロトコルのための標準化の欠如のために、iPSCベースのモデルは、その機能と形態16に大きなばらつきを示すことができます。これはまた、心毒性の研究の有効性を妨げることができます。.我々は、低励起光強度での最小の指標誘発細胞毒性を用いて、拡張実験調査に対する一般的に堅牢な応答を報告する。iPSC-CM製剤の一貫した品質を確保するには、基本的な解離およびカバースリップシードの標準化が重要です。イメージングプラットフォーム内に簡単に挿入して交換できる緩いカバーリップは、単一の心筋細胞の迅速なデータ取得と特性評価に非常に有用です。しかし、ガラスカバーリップ上のまばらな培養の長期間(すなわち...

心筋細胞の電気生理学的モデリングと心臓薬物スクリーニングのための効率的なプラットフォームの構築は、様々な不整脈障害の治療戦略の開発に不可欠です。誘導多能性幹細胞(iPSC)技術の急速な拡大は、単離患者由来心筋細胞(iPSC-CM)を用いたヒト疾患モデリングおよび薬理学的調査への有望な進出を生み出した。パッチクランプ(電流クランプ)を介してこれらの細胞の電気生理学的特徴付けのための「ゴールドスタンダード」技術は、作用電位(AP)形態および持続時間を定量化することができるが、この方法は非常に複雑で遅く、高スループットデータ取得1に適していない。iPSC-CMは、成人の天然心筋細胞2と比較して、拡張期膜電位が増加し、リーク電流が増加すると定期的に報告されている。iPSC-CMで観察される小さな細胞サイズおよび減少した膜容量は、電流クランプ技術を使用する際に系統的な誤差を生じさせる可能性があり、これらの偏差を説明する可能性が示唆される3。iPSC-CMプラットフォームの有用性を最大限に高めるためには、iPSC-CMで膜貫通電圧変化を単一のセルレベルで特性化する際のスループットとデータ精度を高めるため、追加の方法が重要です。
電圧感受性色素(VSD)は、従来の技術4と比較して、心臓AP動態のより速く、非侵襲的かつ同等の分析を提供する方法として提案されてきた。最近の研究では、レシオメトリック電圧感受性プローブフォトメトリーの適合性が、心臓AP5を正確に定量化することが実証されました。さらに、光学的な光測定のアプローチを容易にスケールアップする能力は、治療薬の開発に重要な大規模な心毒性スクリーン(例えば、CiPA)にこの技術を貸す。微小電極アレイと電圧感知光学技術を用いたブラインドマルチサイト研究における標準化された心毒性プロトコルの開発は、このアプローチの重要な価値を実証した6。
多くのポテンショメトリック色素は市販されており、新しいプローブの継続的な合成開発は、様々な心臓および神経構造にわたってその有効性を合理化するためのエキサイティングな可能性を示しています。理想的なVSDは、容量性負荷、光漂白および細胞毒性の低下を示しながら、運動および感受性を増強する。最近合成されたVF2.1Cl(FluoVolt)は、新しい電圧蛍光(VF)ファミリー7の他のメンバーが共有する、その新しいワイヤベースの分子構造に大きく起因するこれらの有益な特性の多くを表す。単純なプローブが分子的および電気的に化学接合する一般的なエレクトロクロミックVSDとは対照的に、この色素は、電子リッチドナーと修飾フルオロフォア(FITC)を組み合わせた受動的に挿入された膜スパン合成ワイヤーで構成されています。機械の詳細は 図 1に示されています。この色素は、膜電圧変動に対する優れた感度を示し、同等の速度で他の一般的なプローブに見られる〜10%とは対照的に、100mV当たりの発光強度の27%の変化を示す7。さらに、ワイヤベースのPeTシステムは、最小限の電気的干渉と細胞容量負荷のわずかな変化を生じるセルラー電界と直接相互作用しません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> 図1:VF2.1Cl色素の化学的、スペクトル的および機械的なパラメータ。(A)VF2.1Clの化学的構造. 注意すべき分子的特徴は、フェニレンビニレン分子線内の複数のアルキル基を含み、この細胞膜への挿入を容易にする。FITCプローブに結合した負の帯電スルホン酸基は、細胞外表面のフッ素酸安定化を保証し、脂質二重層の電界に対する垂直挿入に近い助けとなります。(B)標的細胞の細胞膜に埋め込む垂直VF2.1Clの簡略図である。(C)VF2.1Cl色素の吸収および発光スペクトル。スペクトルは、標準的なFITCおよびGFPプローブのそれと同じです。(D) VF2.1Clの作用の機械モードの描写。安静状態(過分極)では、負の細胞内電圧は、rostralフルオロフォアに向かって自由電子を駆動します。電子の存在量は光励起後の励起状態から外れる経路として光誘導電子移動(PeT)が好ましいこと、蛍光を効果的に消光することを保証する。これに対して、脱分極膜電位は、光学励起時に蛍光を好む下向きの電子移動に影響を与える。得られた蛍光応答は膜電圧に直線的に関連しており、細胞電生理学的運動に関する詳細な時間情報を収集するために正確に利用することができる。(E)VF2.1Clを搭載したレポリン心筋細胞の470nm(下)画像における代表的な明視野(上)および蛍光(F)単一の装填された心筋細胞のZスタック。矢印は、細胞膜へのVF2.1Clの明確な局在の領域を示す。画像は、50 μmのピンホールパターンを持つX-lightv3回転ディスク共焦点ヘッドからなる回転ディスク共焦点システムで取得されました。LDI-7イルミエーター;Prime95BカメラとPlanApoラムダ100xの目的。スケールバー:20 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
VF2.1Clに結合したFITCプローブは、標準フィルタ構成およびGFPフィルタ構成下で効果的に使用できることを保証し、単一のチャネル取得システムのみが必要であり、どちらも蛍光イメージングプラットフォームの共通の特徴です。この色素を用いた高密度ヒトiPSC-CM単層の解析は、最近8、9、10、11と報告されている。我々のプロトコルは、緻密な一層の電気的およびパラクリンの影響によって妨げられない単一の孤立したiPSC-CMの調査と、複雑な共焦点または広視野イメージングの取り決めとは対照的に、手頃でカスタマイズ可能なフォトメトリーシステムの使用のために、これらの研究とは異なる。
ここでは、孤立したヒトiPSC由来の心筋細胞およびネイティブ心筋細胞からの堅牢な光学APの迅速な取得と分析のためのプロトコルについて説明 します(補足ファイルを参照)。我々は、単一細胞のフォトメトリー測定のための最先端のプラットフォームのカスタマイズ可能な状態と結合されたVF2.1Clを使用する。これらの実験プロトコルは、大学医療センターゲッティンゲン(No. 10/9/15)の倫理委員会によって承認されています。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25トリプシンEDTA&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>B27 増補&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>カール・ロス&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース無水&nbsp;BioChemica</td><td>ITW試薬</td><td>A1422</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt膜電位キット&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>カール・ロス&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>ニフェジピン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤 Y27632</td><td>Stemolecule</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>61870010 Versene EDTA&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>装備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LPダイクロイックビームスプリッター&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200Bアンプ&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circle Coverslips, Thickness 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual OptoLED Power Supply&nbsp;</td><td>ケアン・リサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET470/40x励磁フィルタ&nbsp;</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッチング ノイバウアー血球計算計</td><td>ハウサー サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ&nbsp;</td><td>ケアン・リサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoLED</td><td>ケアン研究所&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチポートアダプタ&nbsp;</td><td>ケアン・リサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myopacer細胞刺激装置&nbsp;</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オプトマスクシャッター&nbsp;</td><td>ケアン・リサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optoscanシステム</td><td>コントローラーCairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-1 温調プラットフォーム&nbsp;&nbsp;</td><td>ワーナー・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管検出器&nbsp;</td><td>ケアン・リサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMTアンプインサート</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMTサプライインサート</td><td>ケアンリサーチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G オープンバスチャンバー&nbsp;</td><td>ワーナー・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SA-OLY/2ALステージアダプター&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr ダイクロイックビームスプリッター&nbsp;</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr ダイクロイックビームスプリッター</td><td>クロマテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 デュアルチャンネル温度コントローラー&nbsp;</td><td>npi Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Objective</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0カラーカメラ&nbsp;</td><td>イメージングソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>分子デバイス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICキャプチャー2.4&nbsp;</td><td>イメージングソース&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プリズム8</td><td>グラフパッド</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

従来の細胞内微小電極技術は、心筋細胞電気生理学を定量する、極めて複雑で、労働集約的であり、典型的には低スループットで行われる。誘導多能性幹細胞(iPSC)技術の急速かつ継続的な拡大は、心血管研究における新しい標準を提示し、単一細胞レベルでの電気生理学的データのスループットを向上させるために代替方法が必要になりました。VF2.1Clは、膜電位の変動に対する急速な単一チャネル、高い強度応答を提供する最近得られた電圧感受性色素です。他の既存の電圧指標よりも優れた運動学を有し、従来の微小電極技術と同等の機能データを利用できます。ここでは、モジュール式で手頃な価格のフォトメトリーシステムを用いて、外部ペースのヒトiPSC由来心筋細胞における、単純化された非侵襲的作用電機の特性を実証する。

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> 図3:単離した天然型心筋細胞およびヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)の光学作用電位(AP)プロファイル。(A)APD50およびAPD90の平均±SEMを有する単一のマウス心筋細胞(中央)の代表的な光学AP(n = 7、右)。(B) APD50およびAPD90の平均±SEMを有する単一のヒトiPSC由来心筋細胞(中央)の代表的な光AP(n = 48、右)。(C) 1 μM ニフェジピンを用いた iPSC-CM AP (中央) の薬理学的操作。ニフェジピン塗布後のAPD90変更の平均±SEM(n=5)。**p &lt; 0.01.<a...

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

このプロトコルは、急速に発展している人工多能性幹細胞由来心筋細胞の技術に適した方法で、細胞電気生理学のハイスループット測定を提供できます。この技術の主な利点は、従来のパッチクランプ技術よりも複雑でなく、労働集約的ではないにもかかわらず、同等の結果を生み出すことができることです。したがって、このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を用いた大規模な毒性スクリーニングプログラムに拡張することができます。例えば、包括的なin vitro不整脈アッセイです。実験用の人工多能性幹細胞由来心筋細胞培養物を調製するには、まず、24ウェルプレートの各ウェル内に、個々の10ミリメートル丸ガラス番号ゼロカバースリップを150マイクロリットルの1:60基底膜マトリックスでコーティングし、カバースリップを摂氏4度で4時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、カバースリップから余分なマトリックスを取り除き、各カバースリップに適切な量の細胞を塗布します。摂氏37度で1時間後、各ウェルに慎重にめっき培地を充填し、プレートをインキュベーターに戻します。電圧に敏感な色素イメージングに備えるには、倒立落射蛍光顕微鏡に40倍の倍率の高開口レンズを装備し、透過照明ポートに高速スイッチング暖白色LEDを結合します。透過光路にシンプルな赤色の660ナノメートルフィルターを挿入し、測光記録用の高速スイッチング470ナノメートルLEDヘッドを取り付けます。落射蛍光ポートに470/40励起フィルターを挿入してLEDによって生成された光をクリーンアップし、495ナノメートルのロングパスビームスプリッターを含む顕微鏡キューブを顕微鏡内のミラーユニットカルーセルに挿入します。調整可能なフィールドダイアフラムを含む検出アームをCマウントポートに取り付けて、関心領域を選択できるようにし、PMT検出器とUSBカメラを顕微鏡に結合します。565ナノメートルのロングパスビームスプリッターと535/50の発光フィルターが入ったフィルターキューブをPMTポートに挿入し、2つの検出器間で発光を分割します。PMTを電源とPMTアンプに結合し、PMTアンプの出力をデータ集録システムのアナログ入力ピンに接続します。ナイキスト基準を満たし、エイリアシングを防止するために、PMTからのアナログデータを1キロヘルツ以上でフィルタリングし、アナログ信号に存在する最高周波数の少なくとも2倍の周波数でデータをデジタル化します。セルに電圧感受性色素をロードするには、5マイクロリットルの1000x FluoVoltと50マイクロリットルのパワーロード溶液を混合し、得られたローディング溶液3マイクロリットルを3ミリリットルの温めたTyrode溶液にペトリ皿で加えます。単一の人工多能性幹細胞由来心筋細胞コーティングカバースリップを皿に加え、皿を摂氏37度で20分間置きます。加熱したライブセルイメージングチャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、チャンバーに500マイクロリットルの新鮮なTyrode溶液を充填します。次に、カバースリップを摂氏37度の新しいタイロード溶液で洗い、細かいポイントの鉗子を使用して、カバースリップを事前に温めたバスチャンバーに慎重に移します。細胞のダイナミクスと実験パラメータを標準化するには、2つの白金電極を5mm間隔でチャンバーに挿入し、電極を外部刺激装置に接続します。刺激装置を0.5ヘルツで5ミリ秒のバイポーラフィールドパルスに設定し、細胞が収縮し始めるまで刺激を1ボルトから増加させます。次に、電圧をこのしきい値より約25%高い値に設定します。光学的活動電位の取得には、透過光路とUSBカメラを使用して、明視野条件下での筋細胞を視覚化します。単離されたセルを選択し、フィールドダイアフラムを使用してその光路を厳密にトリミングし、目的のセルからの光のみが監視されるようにします。PMTアンプをアクティブにし、PMT電源を750ボルトに設定します。データ収集ソフトウェアと一緒に刺激プロトコルを実行しながら、同時に470ナノメートルの励起光を活性化します。10回のスイープを記録し、安定した活動電位が検出されるようにします。最後のスイープ後、記録したまますぐに顕微鏡ステージを動かして、細胞がない領域からバックグラウンドシグナルを短時間取得し、励起光をオフにします。活動電位データを解析するには、保存した記録を適切な解析ソフトウェアで開き、1つの細胞から刺激された活動電位を含む10回のスイープを平均化します。平均トレースから蛍光オフセットを表すベースライン信号の平均を差し引き、その式を使用して、拡張期蛍光をF0として蛍光の変化を計算します。拡張期および活動電位の関心のある領域を特定し、50%および90%の再分極での持続時間を含むがこれらに限定されない、目的の心臓活動電位パラメータを測定します。次に、この 1 つのセルからスプレッドシート プログラムにデータをエクスポートします。この方法により、再分極メカニズムの迅速かつ正確な定量が可能になり、細胞のイオン異常に関する貴重な洞察を得ることができます。顕著な第1相の特徴は、マウス心筋細胞からの光信号で観察でき、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞のものとは形態学的に異なります。さらに、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞は、既知のL型カルシウムチャネル拮抗薬であるニフェジピンによる薬理学的操作に反応します。継続的な薬物適用中に、90%の再分極で活動電位持続時間が41.5%減少することが観察され、蛍光電圧指標ベースのイメージングが前向きハイスループット心血管スクリーニング研究のプラットフォームとして機能することが示唆されました。この研究で使用された電圧感受性色素は他の色素よりも細胞毒性が低いものの、細胞の生存率を維持するために励起光を控えめに使用する必要があることに留意することが重要です。このプロトコルで使用される変調測光装置は、非常に汎用性が高いです。例えば、細胞内カルシウムなどの他の電気生理学的パラメータの同時測定に使用できます。

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。...

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

ここで具体的には心室のような誘導多能性幹細胞由来心筋細胞イメージ活動電位光学的方法を提案する.メソッドは、電位感受性蛍光タンパク質のプロモーターに駆動される式に基づいています。...

人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞

本稿では、マルチウェルMEAプレート上で培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)ネットワークの開発のためのプロトコルのセットを含み、作用電位測定のために細胞膜を可逆的に電気ポレートする。ハイスループットの記録は、同じセルサイトから何日も繰り返し取得されます。...

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

レーザーポレーションと微小電極アレイ(MEA)の組み合わせにより、培養された初代および幹細胞由来の心筋細胞の活動電位のような記録が可能になります。波形形状は、標準的な記録よりもテスト化合物の作用モードに関する優れた洞察を提供します。パッチクランプとMEA読み出しをリンクして、将来の心臓安全性研究をさらに最適化します。...

安全性薬理学の予測性を高めるための微小電極アレイ上の心筋細胞のレーザー誘起活動電位様測定

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、前臨床心毒性スクリーニングに動物を使用する代替手段を提供します。前臨床毒性スクリーニングにおけるhiPSC-CMの広範な採用に対する制限は、細胞の未熟な胎児様表現型です。ここでは、hiPSC-CMを堅牢かつ迅速に成熟させるためのプロトコルを紹介します。...

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro...

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

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非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

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三次元光学分解能光音響顕微鏡

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

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