ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

このプロトコルは、急速に発展している人工多能性幹細胞由来心筋細胞の技術に適した方法で、細胞電気生理学のハイスループット測定を提供できます。この技術の主な利点は、従来のパッチクランプ技術よりも複雑でなく、労働集約的ではないにもかかわらず、同等の結果を生み出すことができることです。したがって、このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を用いた大規模な毒性スクリーニングプログラムに拡張することができます。

例えば、包括的なin vitro不整脈アッセイです。実験用の人工多能性幹細胞由来心筋細胞培養物を調製するには、まず、24ウェルプレートの各ウェル内に、個々の10ミリメートル丸ガラス番号ゼロカバースリップを150マイクロリットルの1:60基底膜マトリックスでコーティングし、カバースリップを摂氏4度で4時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、カバースリップから余分なマトリックスを取り除き、各カバースリップに適切な量の細胞を塗布します。

摂氏37度で1時間後、各ウェルに慎重にめっき培地を充填し、プレートをインキュベーターに戻します。電圧に敏感な色素イメージングに備えるには、倒立落射蛍光顕微鏡に40倍の倍率の高開口レンズを装備し、透過照明ポートに高速スイッチング暖白色LEDを結合します。透過光路にシンプルな赤色の660ナノメートルフィルターを挿入し、測光記録用の高速スイッチング470ナノメートルLEDヘッドを取り付けます。

落射蛍光ポートに470/40励起フィルターを挿入してLEDによって生成された光をクリーンアップし、495ナノメートルのロングパスビームスプリッターを含む顕微鏡キューブを顕微鏡内のミラーユニットカルーセルに挿入します。調整可能なフィールドダイアフラムを含む検出アームをCマウントポートに取り付けて、関心領域を選択できるようにし、PMT検出器とUSBカメラを顕微鏡に結合します。565ナノメートルのロングパスビームスプリッターと535/50の発光フィルターが入ったフィルターキューブをPMTポートに挿入し、2つの検出器間で発光を分割します。

PMTを電源とPMTアンプに結合し、PMTアンプの出力をデータ集録システムのアナログ入力ピンに接続します。ナイキスト基準を満たし、エイリアシングを防止するために、PMTからのアナログデータを1キロヘルツ以上でフィルタリングし、アナログ信号に存在する最高周波数の少なくとも2倍の周波数でデータをデジタル化します。セルに電圧感受性色素をロードするには、5マイクロリットルの1000x FluoVoltと50マイクロリットルのパワーロード溶液を混合し、得られたローディング溶液3マイクロリットルを3ミリリットルの温めたTyrode溶液にペトリ皿で加えます。

単一の人工多能性幹細胞由来心筋細胞コーティングカバースリップを皿に加え、皿を摂氏37度で20分間置きます。加熱したライブセルイメージングチャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、チャンバーに500マイクロリットルの新鮮なTyrode溶液を充填します。次に、カバースリップを摂氏37度の新しいタイロード溶液で洗い、細かいポイントの鉗子を使用して、カバースリップを事前に温めたバスチャンバーに慎重に移します。

細胞のダイナミクスと実験パラメータを標準化するには、2つの白金電極を5mm間隔でチャンバーに挿入し、電極を外部刺激装置に接続します。刺激装置を0.5ヘルツで5ミリ秒のバイポーラフィールドパルスに設定し、細胞が収縮し始めるまで刺激を1ボルトから増加させます。次に、電圧をこのしきい値より約25%高い値に設定します。

光学的活動電位の取得には、透過光路とUSBカメラを使用して、明視野条件下での筋細胞を視覚化します。単離されたセルを選択し、フィールドダイアフラムを使用してその光路を厳密にトリミングし、目的のセルからの光のみが監視されるようにします。PMTアンプをアクティブにし、PMT電源を750ボルトに設定します。

データ収集ソフトウェアと一緒に刺激プロトコルを実行しながら、同時に470ナノメートルの励起光を活性化します。10回のスイープを記録し、安定した活動電位が検出されるようにします。最後のスイープ後、記録したまますぐに顕微鏡ステージを動かして、細胞がない領域からバックグラウンドシグナルを短時間取得し、励起光をオフにします。

活動電位データを解析するには、保存した記録を適切な解析ソフトウェアで開き、1つの細胞から刺激された活動電位を含む10回のスイープを平均化します。平均トレースから蛍光オフセットを表すベースライン信号の平均を差し引き、その式を使用して、拡張期蛍光をF0として蛍光の変化を計算します。拡張期および活動電位の関心のある領域を特定し、50%および90%の再分極での持続時間を含むがこれらに限定されない、目的の心臓活動電位パラメータを測定します。次に、この 1 つのセルからスプレッドシート プログラムにデータをエクスポートします。

この方法により、再分極メカニズムの迅速かつ正確な定量が可能になり、細胞のイオン異常に関する貴重な洞察を得ることができます。顕著な第1相の特徴は、マウス心筋細胞からの光信号で観察でき、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞のものとは形態学的に異なります。さらに、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞は、既知のL型カルシウムチャネル拮抗薬であるニフェジピンによる薬理学的操作に反応します。

継続的な薬物適用中に、90%の再分極で活動電位持続時間が41.5%減少することが観察され、蛍光電圧指標ベースのイメージングが前向きハイスループット心血管スクリーニング研究のプラットフォームとして機能することが示唆されました。この研究で使用された電圧感受性色素は他の色素よりも細胞毒性が低いものの、細胞の生存率を維持するために励起光を控えめに使用する必要があることに留意することが重要です。このプロトコルで使用される変調測光装置は、非常に汎用性が高いです。

例えば、細胞内カルシウムなどの他の電気生理学的パラメータの同時測定に使用できます。