Name: 連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ 連続結晶構造解析のためのエンドチアペプシン微小結晶の作製法。小容量蒸気拡散法を大容量バッチ法に変換し、液体ハンドリングロボットとモルフォグラム解析を用いて結晶成長条件を最適化する実験的枠組みを提供します。

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このプロジェクトは、マリー・スクウォドフスカ・キュリー助成契約No 701647の下で、欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムから資金提供を受けています。スイス光源ビームラインX10SA-PXIIのビームライン研究者の支援と支援に感謝します。

著者は、開示すべき利益相反はありません。

提示された方法は、スパースマトリックス96ウェルスクリーンで成長させた大きな結晶(最長寸法≥100μm)から、バッチ を介して 遠沈管(300μL容量)で成長させた微小結晶へのエンドチアペプシンの結晶化を最適化する方法を示しています。プロトコルの背後にある考え方は、エンドチアペプシンを最適化するために取られたステップを他のタンパク質にも使用できるということです。最終的には、XFELやシンクロトロンでの連続結晶学実験のために大量(>100μL)の微結晶(10〜20μm)を作成するという問題に答えます。
このプロトコルは、大量の微小結晶化のタスクを、(1)結晶形態の最適化、(2)バッチへの移行、および(3)スケーリングの3つのステップに分割します。ステップ1では、タンパク質が生成できる結晶形の範囲を蒸気拡散プレートで調査する必要があります。必要な分解能まで回折する単一の箱状の結晶を生じる条件が目標であるべきです。ステップ2では、選択した条件を蒸気拡散からバッチに変換できます。ここで、最適化基準は結晶成長時間と、24時間以内にタンパク質結晶を生じる条件を見つけることです。モルフォグラムをプロットして、実験者に溶解度線と核生成ゾーンの境界の位置を把握させることもできます。このモーフォグラムは、ステップ 3 のスケーリングで非常に役立ちます。モルフォグラムは、核生成だけでXn を増加させ、Xsを低下させることができるかどうかを示します。実験の量が増加するにつれて、Xn およびXs は、スケーリング成功の重要な基準として継続的に評価することができる。
エンドチアペプシンの場合、ステップ1は、これまで知られていなかったエンドチアペプシンの結晶形態である可能性のあるものを発掘しました。この形態は、以前に報告されたものと同じ空間群を持っていましたが、連続結晶学にとって重要なことに、より箱のような形状でした。単結晶も、他の条件で作成されたファンとは異なり、単一の核生成点から成長しているように見えました(図4)。選択した条件については、<24時間で結晶成長が発生したため、ステップ2はすでに部分的に満たされていました。このモーフォグラムは、ステップ3でスケーリングすると、ストレートまたはシードバッチプロトコルの両方が成功する可能性があることを示しました。ストレートバッチでの初期スケーリングにより、X、n、Xsの範囲がそれぞれ3.6 ± 1.2 x 106結晶・mL-1および42 ± 4.1 μmの結晶を生成する条件を作成しました。これらの結晶は、いくつかの連続結晶学実験には許容できるものの、大きすぎると見なされました。そのため、追加の最適化が実行されました。最終的なプロトコルでは、それぞれ3.1 x 106結晶・mL-1および15 ± 3.9 μmの濃度およびサイズ範囲の結晶が生成されました。これは、計画された実験にとって理想的以上のものでした。
この方法は、蒸気拡散プレートで成長させた「可溶性」タンパク質結晶のバッチへの変換に焦点を当てています。この焦点の理由は、可溶性タンパク質結晶の大部分が蒸気拡散 を介して 成長するためです26。しかしながら、提示された概念は、マイクロバッチなどの他の方法を用いて成長させた可溶性タンパク質結晶にも適用することができる。この概念は、LCPで成長させた膜タンパク質結晶にも適用できます。これもバッチ結晶化プロセスです。
プロトコルの重要な側面は、蒸気拡散板で成長させた結晶の条件をバッチで成長できるように変換する方法です。この変換のために、この方法はBealeら(2019)26によって提案された基準を使用する。バッチプロセス で 成長した結晶は、蒸気拡散板でも急速に形成されます(<24時間)。この基準は、蒸気拡散液滴平衡化の速度に基づく近似値であり、PEGベースの沈殿物条件に最も当てはまります。ただし、結晶化条件には、平衡化時間に影響を与えるさまざまな化合物が含まれます。塩ベースの結晶化条件、 例えば 高濃度塩化アンモニウムの平衡化は、1〜2日で起こり得る。したがって、24時間の基準は、塩ベースの条件には当てはまらない可能性があります。塩ベースの条件はまた、このプロトコルで提示された原型に適合しないかもしれないより複雑な状態図26、30 を有することができる。塩ベースの条件の時間基準を12時間または6時間に減らすことは、より大きなボリュームへのスケーリングが不可能であることが判明した場合に必要になる場合があります。
この方法の別の制限は、その明らかな複雑さです。エンドチアペプシンの微小結晶化を最適化するために従ったプロトコルは、実際にはスパースマトリックススクリーンから元の状態を比較的ほとんど変化させませんでした。PACTスクリーンで観察された最初のヒットは、0.1 HEPES pH 7.0、0.2 M MgCl2、および20%(w / v)PEG 6,000でした。最終的なスケーリング結晶化バッファーは、0.1 Tris-HCl pH 7.0、0.15 M MgCl2、および40%(w / v)PEG 6,000でした。HEPESからTris-HClへの緩衝液の変化、およびMgCl2 濃度の変化が、プロセスの成功にほとんど寄与しなかった可能性も非常に高いです。PEG 6,000濃度の増加を唯一の最適化のままにしておくことは、非常に簡単に達成できたはずです。
ただし、この評価も単純すぎます。スケーリング中に遭遇する問題(つまり、シードの使用とクエンチング)を軽視するだけでなく、このタンパク質が簡単であることが証明されたからといって、 次のタンパク質も証明される保証はないという事実も無視します。プロトコルでアドバイスされたステップは、タンパク質結晶化体積のスケーリングを最適化することが非常に高価なタンパク質になり得るので考案された。示されている7つのエンドチアペプシンスケーリング試験で、100 mgのタンパク質が消費されました。確かに、これらの手順のいくつかは、このプロトコルに照らして結果を示すために実行されました。それでも、100 mgのタンパク質に加えて、実験中に消費されるタンパク質にさらに50 mgを追加する可能性があります(表1)は、時間または費用の大幅な投資になる可能性があります。
幸いなことに、この大量の必要なサンプルがすべてのタンパク質に遍在しているかどうかは明らかではありません。エンドチアペプシンは溶解性が高いため、過飽和に達するには高いタンパク質濃度が必要でした。他のもの(現在最適化中)では、過飽和は10または5 mg / mLでさえ到達する可能性があります。このような変数はタンパク質特異的であり、出現時に受け入れる必要があります。
この方法のその他の制限には、スクリーンやプレートの作成のための液体処理ロボットや、必要に応じてプレートを自動的に画像化するイメージャーなどの複雑な機器への依存が含まれます。これらの機器のいくつかの必要性を制限するために代替ルーチンが提供されていますが、プロトコルはそれらなしで従うのに時間がかかります。このプロトコルは、最適化された結晶の回折をテストすることも提案しています。シンクロトロンに定期的にアクセスできない結晶学者にとって、これらのテストは困難になる可能性があります。すべてのステップでコントロールを行う必要はないかもしれませんが、ヒットが特定されたら、スケーリングの前後にこれらのテストを行うことを強くお勧めします。XFELでの非回折結晶は、残念ながら珍しいことではありません。これを考えると、結晶回折に関する仮定に関して注意を怠る方が良いでしょう。
最終的に、ここで提示されたこのプロトコルと結果は、連続結晶学実験用のサンプルの作成に苦労している人々にガイド、アイデア、および例を提供します。うまくいけば、連続結晶構造解析がさらに開発されるにつれて、このようなプロトコルの必要性が減るように、この技術のサンプル需要が減るでしょう。ただし、このイベントでも、ここで紹介する戦略は、タンパク質の結晶化空間を探索したい人にとっては依然として有用です。

室温(RT)高分子結晶構造解析は、構造生物学のコミュニティで再び人気があります。X線自由電子レーザー(XFEL)光源の開発は、RTサンプル送達アプローチ1,2,3,4の開発に拍車をかけ、これらの方法はシンクロトロン5,6,7,8に適用されています。RT法は、ポンププローブ実験の可能性を開くだけでなく、タンパク質13,14,15,16,17内の代替立体配座状態を促進するという証拠も増えています。
しかし、1990年代後半にクライオ法がRTアプローチよりも勢いを増した主な理由は、氷点下の結晶温度による放射線損傷の減速でした18。クライオ法19は、単一のタンパク質結晶から完全なデータセットの収集を可能にし始めました。XFELおよびシンクロトロンにおける最新のRT法は、高速(&gt; 100Hz)結晶送達戦略の開発によって単結晶放射損傷の問題を解決した1,2,3,4。これらの方法により、個別に露出した何千もの結晶から完全なデータセットを収集できます。したがって、これらのRT送達アプローチでは、均質な微結晶(&gt;100 μLの&lt; 50 μm結晶)を含む大量の溶液を製造する必要があります。しかし、クライオ法は単結晶のみを必要とする傾向があるため、このような微結晶スラリーを作成する方法は、現在、タンパク質結晶構造解析ラボ全体で遍在していません。
文献には、連続結晶構造解析サンプルの微小結晶化最適化手順の一部を実行する方法の例があります。ここでは、膜タンパク質と可溶性タンパク質を区別する必要があります。モノオレイン(または他の何らかの脂質)中で成長させた微小膜タンパク質結晶の成長を最適化するためのプロトコルは、脂質立方相(LCP)について、十分に記載されている20、21、22。しかしながら、非LCP条件下で増殖させた膜タンパク質を含む可溶性タンパク質の微小結晶化のための方法は一般に欠けている。以前の研究では、微結晶スクリーニング23,24、核生成の増強24、フリー界面拡散25を使用したスケーリングなど、プロセスの特定の部分に焦点を当ててきましたが、完全な方法ではありませんでした。
しかしながら、完全なプロトコルを提供しようとする方法が最近記載された26 。タンパク質結晶学の多くの側面と同様に、それは新しいものではありません。提案されたアイデアの多くは、Rayment(2002)27によってすでに説明されています。この方法は、蒸気拡散を使用して成長させた単一の結晶から、数千の微結晶を成長させるバッチ手法への変換を実行する方法を結晶学者に示すことを目的としています。この方法は、すべてのタンパク質データバンク(PDB)堆積物の95%が蒸気拡散プレート26内で成長した結晶に由来するため、共通の出発点として蒸気拡散に焦点を当てる。しかしながら、蒸気拡散は微小結晶化のための理想的な方法ではない26ので、蒸気拡散をバッチ結晶化に変換する方法論が説明される。結晶をバッチで成長させることができれば、より大きなボリュームへのスケーリングルートがより実用的になります。タンパク質の結晶化の気まぐれさを考えると、著者らは、この方法がフェイルセーフではないことを強調するだろう。ただし、プロトコルは、少なくとも、タンパク質の「結晶化空間」への洞察を提供する必要があります。
この方法は、タンパク質結晶化相図と、その図を理解することが微小結晶化の最適化中のガイドとしてどのように機能するかに依存しています。タンパク質の状態図は、通常、x軸とy軸にそれぞれ沈殿剤とタンパク質濃度を持つx/yプロットとして表されます(図1A)。純水点(左下隅-図1A)から、タンパク質と沈殿剤の両方の濃度が溶解度線に達するまで増加します。溶解度線は過飽和点を示します(紫色の線-図1A)。タンパク質が過飽和になると、溶液は熱力学的に不安定になり、「タンパク質が豊富な」溶液と安定した飽和溶液の2つの相に分離し始めます。この分離は溶解度線を超えた場所で発生する可能性があり、その速度論はタンパク質の特性と溶液の成分に依存します。
タンパク質と沈殿剤の濃度が高すぎると、タンパク質は溶液から不安定に分解し、非晶質の沈殿物を生成します(ピンク色の領域- 図1A)。しかし、規則的な相分離は核生成領域で発生する可能性があり[詳細な説明についてはGarcia-Ruiz(2003)28 を参照]、結晶核は形成される傾向があります(緑色領域- 図1A)。核生成と成長は溶液からタンパク質を除去し、溶解度線に達するまで成長を続けることができる準安定領域に液滴を移動させます[詳細な議論についてはMcPherson and Kuznetsov (2014)29 を参照]。この図は、結晶化条件の大部分について、大部分が過度に単純化されている30。ただし、これに関係なく、ダイアグラムのマッピングにより溶解度線と核生成の速度論を決定できるため、このダイアグラムはマイクロ結晶学者にとって依然として非常に有用です。
微結晶の生成に関して、最適化する必要がある結晶化中の2つの要因は、結晶の数(Xn)とそれらの平均最長寸法(Xs)です。X nは核生成イベントの数(n )に比例します(式1)。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     式 1
Xsは 、溶解度線(Ps)をXn で割った値(式2)より上の遊離タンパク質の濃度に比例する。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     式 2
完璧な状況では、すべての核生成イベントで可能な結晶が生成され、これらの結晶のすべてが溶液中の利用可能なタンパク質に等しくアクセスできます。 図2 は、Xn とXsとの関係の理想的なシナリオからのグラフ表現である。実際には、結晶学者がXn およびXs に対して有する主要な制御は、核生成の量に影響を与えること、または種結晶の添加によるものである。マイクロ結晶学者は、適切な結晶濃度と結晶サイズの両方を作成できるように、Xn を増加させる方法を判断する必要があります。
結晶化技術の大部分は「移行期間」を必要とします(図1B)。例えば、蒸気拡散実験では、タンパク質溶液と沈殿剤溶液を混合すると、液滴がウェル溶液と平衡化するにつれて、それぞれの濃度が変化します。これらの変化が、結晶化の傾向が増加する核生成ゾーンへのドロップを徐々に移行させることが期待されます。結晶が核形成して成長し始めると、溶液中のタンパク質の量が減少し始め、さらなる核形成の可能性が減少します。核生成の最終的な量は、タンパク質と条件に固有であり、核生成ゾーンへの浸透の深さにも依存します。移行段階を必要とする方法の核生成ゾーンの浸透が制限されていることを考えると、核生成のレベルは、最終的には準安定核生成領域の境界での核生成速度に制限されます。
微結晶学者にとって核生成レベルを高めることができることが重要であるため、バッチ結晶化方法論に移行することが重要です。バッチは、核生成領域全体をより有効に活用できます(図1C)。バッチ法では、タンパク質と沈殿剤を混合して、成分濃度を変更することなく過飽和溶液を作成するという考え方です。核生成は混合後すぐに可能であるはずです。したがって、バッチ法では、理論的に核生成ゾーン全体に到達することができます。準安定核生成境界を超えた核生成速度論の増加を利用することができます。
結晶核生成の基礎レベルが大きなXnを生成するのに十分でない場合は、マイクロシード法を使用することができる。マイクロシーディングでは、予め成長した結晶を分解して、新鮮な結晶成長のための足場として作用することができる結晶断片のスラリーを作成する31、32。マイクロシーディングは、結晶核生成を増加させることなくXn を増加させる方法として、連続結晶学的サンプル調製において広く使用されています(図1C)。
蒸気拡散からバッチへの遷移は、実験の開始点を非過飽和領域または準安定領域から核生成ゾーンに移動するものとして、相図上で視覚化できます。これは、タンパク質および/または沈殿剤の濃度、および/または液滴内の2つの比率を増加させ(図1D)、どの条件が急速に現れる結晶を生成するかを観察することによって行うことができます(&lt;24時間)26。完全な蒸気拡散液滴平衡化には数日または数週間かかることがあります33。したがって、急速に現れる結晶を示す条件を探すことによって、マイクロバッチ34、35、36、37などの代替結晶化スクリーニングフォーマットに移行することなく、バッチ条件を見出すことができる。
核生成ゾーンが見つかると、バッチ条件が見つかり、モルフォグラム(ここでは大まかな状態図)を作成できます。モルフォグラムは、シードバッチプロトコルとストレートバッチプロトコルのどちらを使用するかを検討するときに非常に役立ちます。Xnをタンパク質および沈殿剤濃度の関数としてプロットすることによって、核生成速度論の評価を行うことができる26。Xnが核生成領域全体にわたって低いままである場合、結晶成長を制限するのに十分な大きさのXnを作るためにシードバッチが必要となるかもしれない。この評価は、大容量(&gt; 100 μL)へのスケーリングプロセスの最初のステップです。
この方法は、標準的な蒸気拡散結晶化装置を使用して、ほとんどの結晶化実験室で実施できるように設計されています。機器が利用可能である場合、このプロセスの多くの部分を容易にする技術を説明する多くの研究も実施されています。これらには、動的光散乱(DLS)25,27、非線形イメージング20,24,25、粉末回折20,24,27、および電子顕微鏡26が含まれますが、これらに限定されません[素晴らしいレビューについては、Cheng et al. (2020)40を参照してください]。
この研究の目的は、少量(&lt; 500 nL)の蒸気拡散結晶化から大容量(&gt; 100 μL)のバッチ結晶化に移行する方法の視覚的なデモンストレーションを提供することです。 Cryphonectria parasitica 由来のエンドチアペプシンは、この翻訳を実証するためのシステム例として使用されています。微結晶が必要とされる実験のタイプおよび試料送達方法は、理想的なXs 出力26に影響を与えるであろう。ミリ秒の時間分解能41 または気体力学仮想ノズル42を必要とする混合実験のためには、5μm&lt;の最終Xsが 望ましい場合がある。この場合の目標は、光子活性化ポンププローブ実験のために、固定ターゲット送達アプローチを使用して、約1.5 Åまで回折するタンパク質結晶を生成することでした。
エンドチアペプシンを用いたこのような連続結晶学実験のサンプル要件の説明を与えるために、 表1 は、仮想実験の実験パラメータを示す。サンプル情報は、以下に説明するプロトコルに基づいていました。ヒット率とデータ収集要件に関する控えめな推定値を考えると、50 mgは実験全体の総サンプル消費量の推定値です。
図3 は、初期の小容量蒸気拡散結晶化から大規模バッチまでの完全な最適化プロセスのフローチャートを示しています。ほとんどのシリアル結晶構造解析プロジェクトでは、ターゲットタンパク質はすでに結晶化されているため、このプロトコルはステップ2「バッチへの移行」から始まります。ただし、ステップ1は、完全を期し、読者にその重要性を思い出させるために含まれています。よく回折する単一の大きな結晶を生じる条件を見つけることは、微小結晶最適化の最良の出発点です。ステップ2では、この条件を蒸気拡散からバッチまで最適化し、核生成領域と準安定領域のモルフォグラムをプロットできます。これが完了したら、バッチ条件をより大きなボリュームにスケーリングすることをステップ3で実行できます。フローチャートの終わりまでに、結晶学者はエンドチアペプシンの再現性のある大容量(&gt; 100 μL)の微量結晶化バッチプロトコルを作成します。この方法は、次いで、目的の特定のタンパク質に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>Swissci 96 ウェル 2 ドロップ プレート</td><td>分子寸法</td><td>MD11-002</td><td>96 ウェル 2 ドロップ結晶化プレート</td></tr><tr><td>Swissci 96 ウェル 3 ドロップ プレート</td><td>分子寸法</td><td>MD11-003</td><td>96 ウェル 3 ドロップ結晶化プレート</td></tr><tr><td>蚊 LCP 液体処理ロボット</td><td>sptlabtech</td><td>mosquito LCP</td><td>結晶化ロボット</td></tr><tr><td>ClearVue シート</td><td>分子寸法</td><td>MD6-015</td><td>96ウェル結晶化プレートシール</td></tr><tr><td>Safe-Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL遠心チューブ</td></tr><tr><td>Scaple</td><td>Swan and Morton</td><td>No. 3 scalple and No. 3 handle</td><td>オープンプレートシール切断用スカルプル</td></tr><tr><td>MS 3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>Vortex 溶液の混合とシードストック作成用</td></tr><tr><td>24ウェルXRLプレート</td><td>分子寸法</td><td>MD3-11</td><td>24ウェルハンギングドロッププレート</td></tr><tr><td>チューブリボルバー/ローテーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88881001</td><td>スケーリング中の混合溶液用チューブリボルバー</td></tr><tr><td>エッペンドルフリサーチプラスピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>手動ピペットの範囲、0.5-10、1-20、10-100、100-1000 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>エッペンドルフ ピペットチップ</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td></td><td>手動ピペット用チップサイズの範囲</td></tr><tr><td>スパレン 600</td><td>プロケム AG</td><td>スパレン 600</td><td>エンドチアペプシン溶液</td></tr> 酢<tr><td>酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>酢酸ナトリウム</td></tr><tr><td>トリス</td><td>メルク</td><td>8382T014</td><td>トリス</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>塩化マグネシウム</td></tr><tr><td>PEG 6,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255-1kg</td><td>PEG 6,000</td></tr><tr><td>エセリエングリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-1L</td><td>シロ保護用エセリエングリコール</td></tr><tr><td>結晶 PACT プレミア HT スクリーン</td><td>分子寸法</td><td>MD1-36</td><td>PACT プレミア 96 ウェル クリスタル スクリーン</td></tr><tr><td>DOW CORNING 高真空グリース</td><td>分子寸法</td><td>MD6-02</td><td>グリース24ウェルプレートのシーリング用</td></tr><tr><td>Hirschmann 22 x 22 mm glaser cover slides</td><td>Hirschmann</td><td>8000104</td><td>24well sitting drop platesをシーリングするためのカバースライド</td></tr><tr><td>クリスタルピン</td><td>PSI</td><td>自社製造</td><td>マイクロクリスタル用の薄膜サポート。</td></tr><tr><td>1-1.3 mm SiLibeads Type S</td><td>Faust</td><td>6239547</td><td>ミコシード株を作るためのガラスビーズ</td></tr><tr><td>Macbook Pro</td><td>Apple</td><td>Macbook Pro</td><td>データ分析を行うためのコンピュータ</td></tr><tr><td>CCP4ソフトウェアスイート</td><td>CCP4</td><td></td><td>回折パターンデータ処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td><td>状態図</td></tr><tr><td>用プロットツールハウサーサイエンティフィックブライトラインカウンティングチャンバー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィッシュ</td><td>02-671-51B</td><td>結晶濃度を計算するツール</td></tr><tr><td>PACTプレミア</td><td>分子寸法</td><td>MD1-29-ECO</td><td>スパースマトリックス結晶化スクリーン</td></tr><tr><td>ロックイメージ</td><td>ャーFormulatrix</td><td>ロックイメージャー</td><td>温度制御結晶プレートストレージとイメージャー</td></tr><tr><td>ロックメーカーWeb</td><td>フォーミュラトリックス</td><td>ロックMakerWeb</td><td>クリスタルプレート作成・画像保存用ストフトウェア</td></tr><tr><td>Formulator Formulatrix</td><td></td><td>Formulator</td><td>96ウェルクリスタルスクリーン作成 リキッドハンドリングロボット</td></tr><tr><td>ライカMZ16 顕微鏡</td><td>ライカ</td> ライ<td>カMZ16</td><td>光学顕微鏡</td></tr><tr><td>LAS V4.6</td> ライ<td>カ</td><td>LAS V4.6</td><td>ライカ顕微鏡用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Spectra/Por 3.5 kDa 透析チューブ</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 透析膜</td><td>3.5 kDa透析膜</td></tr><tr><td>透析チューブ閉鎖</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Duniversal 閉鎖</td><td>透析チューブの端をシールするクリップ</td></tr><tr><td>アミコン 10 kDa遠心濃縮器</td><td>メルク・ミリポア</td><td>アミコンウルトラ-15 10 kDa遠心濃縮器</td><td>10 kDa遠心フィルター</td></tr><tr><td>5810 Rスイングバケット遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810 R遠心分離機</td><td>スイングバケット遠心分離機</td></tr></tbody></table>

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

ここでは、シンクロトロンとXFELの両方での連続結晶学実験に適した大量(> 100 μL)の微結晶スラリーの作成を容易にするためのプロトコルが提示されています。この方法は、タンパク質結晶相図の理解と、その知識をどのように活用できるかに基づいています。この方法は、(1)結晶形態の最適化、(2)バッチへの移行、(3)スケーリングの3つの段階に分けられます。ステージ1では、うまくいけば、必ずしもそうとは限りませんが、立方体のような形態で提示される、よく回折する単結晶を見つけます。ステージ2では、ステージ1の条件は結晶成長時間によって最適化されます。この戦略は、蒸気拡散によって成長した結晶をバッチに変換できます。約24時間以内に結晶成長が起こると、タンパク質と沈殿剤混合物のモルフォグラムをプロットし、スケーリング戦略の基礎として使用できます(ステージ3)。結晶をバッチで成長させることができる場合、スケーリングを試みることができ、体積が増加するにつれて結晶サイズと濃度が最適化されます。エンドチアペプシンは、このプロトコルの実証タンパク質として使用されています。提示された決定のいくつかはエンドチアペプシンに特有のものです。しかし、それらが適用された方法が、他の人が自分のプロジェクトに適応できるこの手順についての考え方を刺激することが期待されています。

この記事の目的は、大きな単一タンパク質結晶を成長させるための少量の蒸気拡散プロトコルを、シリアル結晶学用の大量のバッチマイクロ結晶化法に変換する方法を視聴者に確実に理解させることです。

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

連続結晶構造解析実験は困難な場合があります。彼らの実践における重要なハードルは、微結晶サンプルの作成です。このプロトコルは、このようなサンプルを確実に作成する方法を示しています。この方法は、エンドチアペプシンを使用して、小容量の蒸気拡散プレートで成長した大きな結晶を大量の微結晶スラリーに最適化するためのフレームワークを提供します。このプロトコルが普遍的に成功するとは言えません。しかし、ここで提案されているアイデアと方法が、他のタンパク質で採用するための実験的枠組みを他の人に与えることを願っています。まず、Formulatrixロボットを使用して、結晶化バッファーを備えた2滴の96ウェルプレートを準備します。リキッドハンドリングロボットミックスを使用して、各ウェルで150ナノリットルの解凍したばかりのエンドチアペプシンを150ナノリットルの結晶化バッファーと混合します。プレートを密封し、フォーミュラトリックスホテル内で24時間結晶を成長させます。24時間後、96穴結晶化プレートの5つのウェルから結晶を分解して除去した。それらをアイスバケットに入れた1.5ミリリットルの遠沈管内の250マイクロリットルの結晶化バッファーに入れます。1ミリメートルサイズのガラスビーズを10〜15個遠沈管に追加します。結晶とビーズを1000 RPMで30秒間ボルテックスし、氷上で30秒間交換します。その後、種子はすぐに使用することも、摂氏マイナス20度で保存することもできます。モルフォグラム実験を行うには、2滴96ウェルグリッドスクリーンのプレートカラムに沿って、pH 7の1モルTris-HClと0.15モルの塩化マグネシウムを含む5〜40%濃度のPEG 6000を追加します。 0.1モル酢酸ナトリウムでのエンドチアペプシンの連続希釈を1ミリリットルあたり100〜12.5ミリグラムから8ステップで修復します。次に、各希釈液8マイクロリットルをピペットで入れ、続いて2マイクロリットルのシードストックをリキッドハンドリングロボットプレートに入れます。リキッドハンドリングロボットを使用して、エンドチアペプシンの各希釈液150ナノリットルをスクリーンのサブウェル1および2に分注する。50ナノリットルの解凍種子ストックと100ナノリットルのウェル溶液をサブウェル2から多重吸引し、両方をタンパク質溶液に分注します。結晶化バッファーまたは結晶化バッファーとシードミックスの添加時に溶液を3回混合する。次に、最初の週は毎日、摂氏20度で、最初の日の0、3、6、12、18、および24時間にプレートと画像を密封します。24時間後、顕微鏡でプレートを見て、各ウェル内の結晶数を推定し、結晶のサンプルを測定します。これらの推定値を、付属のモルフォグラムジェネレータワークシートに記録します。エンドチアペプシンとPEG 6000の開始濃度を適切なボックスに入力します。ワークシートは、沈殿剤とタンパク質の濃度をそれぞれX軸とY軸にした従来の状態図形式で結果を自動的にプロットします。ウェル条件は、シードされた液滴でのみ結晶を生じる条件は、図のメタ安定領域を示し、シードされた液滴と非シードされた液滴の両方に結晶がある条件は核生成ゾーンを示します。モルフォグラム解析から、24ウェルプレートにスケーリングするための最も有望な条件を選択します。次に、1ミリリットルあたり100ミリグラムのエンドチアペプシンと35%PEG 6000から始めます。35%PEG 6000、pH 7の0.1モルトリス塩酸塩、および0.15モルの塩化マグネシウムを含む5ミリリットルの結晶化バッファーを調製します。次に、0.5ミリリットルの結晶化バッファーを、グリースを塗った24ウェル吊り下げドロッププレートの3つのウェルに入れます。ガラスカバースリップ上で15マイクロリットルのエンドチアペプシンを15マイクロリットルの結晶化溶液と混合する。溶液をウェルの上に置き、プレートを24時間放置します。24時間後、顕微鏡でプレートを見て、液滴中の結晶数を推定し、それらのサイズを測定します。結晶が正しくない場合は、この手順を繰り返しますが、結晶の核形成が十分に高くない場合は、タンパク質濃度を変更するか、シードを追加します。より高い濃度のPEG 6000で種子を添加して、24ウェルスケーリング実験を繰り返します。0.5ミリリットルの新しい結晶化バッファーを、グリースを塗った24ウェル吊り下げドロッププレートの3つのウェルに入れます。15マイクロリットルのエンドチアペプシンをガラスカバースリップに置き、5マイクロリットルのシードストックと10マイクロリットルの結晶化溶液をエンドチアペプシン溶液と混合します。カバースリップをひっくり返し、ウェルの上に置き、24時間放置します。滴を再チェックして、結晶が小さく、濃度が高いかどうかを確認します。液滴中の結晶の数を推定し、それらのサイズを再度測定して、それらが正しいサイズになっているかどうかを確認します。シードバッチプロトコルを実行するには、40%PEG 6000、pH 7の0.1モルTris-HCl、および0.15モルの塩化マグネシウムの結晶化バッファーを調製します。50マイクロリットルのシードストックと100マイクロリットルの結晶化溶液を事前に混合し、1.5ミリリットルの遠沈管でタンパク質溶液と混合します。チューブを10秒間ボルテックスし、摂氏20度のロッカーまたはシェーカーに置きます。20分ごとに2.5マイクロリットルのバッチ溶液を摂取します。血球計算盤を使用して結晶のサイズと数を監視します。結晶の数を数え、顕微鏡でそのサイズを測定します。結晶が約15ミクロンの寸法に達したら、0.5モルのTris-HCl、0.075モルの塩化マグネシウム、および20%PEG6000を添加した150マイクロリットルの0.5モル酢酸ナトリウムで反応を停止します。血球計算盤を使用して結晶のサイズと濃度を再確認します。結晶は摂氏20度で保管してください。エンドチアペプシンモルフォグラム解析は、核形成がタンパク質濃度と沈殿剤濃度の両方に影響されることを示唆した。図のメタ安定領域、核生成領域、および降水領域は、うまく区別できます。種子の添加は、種子なしの液滴と比較して結晶数を有意に増加させた。200〜300マイクロリットルの容量でのエンドチアペプシン微小結晶化の分析により、結晶核生成と最長寸法の経時的な変化が明らかになりました。PEG濃度を35%に上げると結晶化が著しく向上し、最終結晶濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の約3.6倍、最長の結晶寸法は42マイクロメートルでした。最終的な結晶のサイズを小さくするために、タンパク質濃度低減アプローチが適用されましたが、残念ながら結晶濃度が大幅に低下し、最終的にはさらに大きな結晶が生成されました。しかし、PEG濃度を40%に高めるアプローチでは、1ミリリットルあたり10〜6倍の約3.1倍の結晶が得られ、サイズは約39マイクロメートルになります。さらに、種子を添加すると、結晶濃度が大幅に増加し、1ミリリットルあたり10〜8倍の約1.1倍、約4.2マイクロメートルの寸法が小さくなりました。結晶化反応で試みた急冷効果により、最終結晶濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の約2.6倍、サイズは約15マイクロメートルでした。X線データからの分解能に対してプロットされたCCの半分は、10マイクロリットルから200〜300マイクロリットルの容量への結晶分解能のわずかな低下を示した。しかし、結晶は依然として1.5アングストラムに回折し、これは十分であると考えられた。エンドチアペプシンは、扱いやすいタンパク質です。エンドチアペプシンのこのプロトコルを試すことで、他のタンパク質に役立つアイデアや方法が生まれることを願っています。特に結晶学では、書面によるプロトコルだけに従うのではなく、物事がどのように見え、感じられるかを確認することは有益です。このビデオは、うまくいけば、その感覚の一部としてあなたに与えるでしょう。

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学ぶ 連続結晶構造解析のためのエンドチアペプシン微小結晶の作製法。小容量蒸気拡散法を大容量バッチ法に変換し、液体ハンドリングロボットとモルフォグラム解析を用いて結晶成長条件を最適化する実験的枠組みを提供します。

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

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