連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

連続結晶構造解析実験は困難な場合があります。彼らの実践における重要なハードルは、微結晶サンプルの作成です。このプロトコルは、このようなサンプルを確実に作成する方法を示しています。

この方法は、エンドチアペプシンを使用して、小容量の蒸気拡散プレートで成長した大きな結晶を大量の微結晶スラリーに最適化するためのフレームワークを提供します。このプロトコルが普遍的に成功するとは言えません。しかし、ここで提案されているアイデアと方法が、他のタンパク質で採用するための実験的枠組みを他の人に与えることを願っています。

まず、Formulatrixロボットを使用して、結晶化バッファーを備えた2滴の96ウェルプレートを準備します。リキッドハンドリングロボットミックスを使用して、各ウェルで150ナノリットルの解凍したばかりのエンドチアペプシンを150ナノリットルの結晶化バッファーと混合します。プレートを密封し、フォーミュラトリックスホテル内で24時間結晶を成長させます。

24時間後、96穴結晶化プレートの5つのウェルから結晶を分解して除去した。それらをアイスバケットに入れた1.5ミリリットルの遠沈管内の250マイクロリットルの結晶化バッファーに入れます。1ミリメートルサイズのガラスビーズを10〜15個遠沈管に追加します。

結晶とビーズを1000 RPMで30秒間ボルテックスし、氷上で30秒間交換します。その後、種子はすぐに使用することも、摂氏マイナス20度で保存することもできます。モルフォグラム実験を行うには、2滴96ウェルグリッドスクリーンのプレートカラムに沿って、pH 7の1モルTris-HClと0.15モルの塩化マグネシウムを含む5〜40%濃度のPEG 6000を追加します。 0.1モル酢酸ナトリウムでのエンドチアペプシンの連続希釈を1ミリリットルあたり100〜12.5ミリグラムから8ステップで修復します。

次に、各希釈液8マイクロリットルをピペットで入れ、続いて2マイクロリットルのシードストックをリキッドハンドリングロボットプレートに入れます。リキッドハンドリングロボットを使用して、エンドチアペプシンの各希釈液150ナノリットルをスクリーンのサブウェル1および2に分注する。50ナノリットルの解凍種子ストックと100ナノリットルのウェル溶液をサブウェル2から多重吸引し、両方をタンパク質溶液に分注します。

結晶化バッファーまたは結晶化バッファーとシードミックスの添加時に溶液を3回混合する。次に、最初の週は毎日、摂氏20度で、最初の日の0、3、6、12、18、および24時間にプレートと画像を密封します。24時間後、顕微鏡でプレートを見て、各ウェル内の結晶数を推定し、結晶のサンプルを測定します。

これらの推定値を、付属のモルフォグラムジェネレータワークシートに記録します。エンドチアペプシンとPEG 6000の開始濃度を適切なボックスに入力します。ワークシートは、沈殿剤とタンパク質の濃度をそれぞれX軸とY軸にした従来の状態図形式で結果を自動的にプロットします。

ウェル条件は、シードされた液滴でのみ結晶を生じる条件は、図のメタ安定領域を示し、シードされた液滴と非シードされた液滴の両方に結晶がある条件は核生成ゾーンを示します。モルフォグラム解析から、24ウェルプレートにスケーリングするための最も有望な条件を選択します。次に、1ミリリットルあたり100ミリグラムのエンドチアペプシンと35%PEG 6000から始めます。

35%PEG 6000、pH 7の0.1モルトリス塩酸塩、および0.15モルの塩化マグネシウムを含む5ミリリットルの結晶化バッファーを調製します。次に、0.5ミリリットルの結晶化バッファーを、グリースを塗った24ウェル吊り下げドロッププレートの3つのウェルに入れます。ガラスカバースリップ上で15マイクロリットルのエンドチアペプシンを15マイクロリットルの結晶化溶液と混合する。

溶液をウェルの上に置き、プレートを24時間放置します。24時間後、顕微鏡でプレートを見て、液滴中の結晶数を推定し、それらのサイズを測定します。結晶が正しくない場合は、この手順を繰り返しますが、結晶の核形成が十分に高くない場合は、タンパク質濃度を変更するか、シードを追加します。

より高い濃度のPEG 6000で種子を添加して、24ウェルスケーリング実験を繰り返します。0.5ミリリットルの新しい結晶化バッファーを、グリースを塗った24ウェル吊り下げドロッププレートの3つのウェルに入れます。15マイクロリットルのエンドチアペプシンをガラスカバースリップに置き、5マイクロリットルのシードストックと10マイクロリットルの結晶化溶液をエンドチアペプシン溶液と混合します。

カバースリップをひっくり返し、ウェルの上に置き、24時間放置します。滴を再チェックして、結晶が小さく、濃度が高いかどうかを確認します。液滴中の結晶の数を推定し、それらのサイズを再度測定して、それらが正しいサイズになっているかどうかを確認します。

シードバッチプロトコルを実行するには、40%PEG 6000、pH 7の0.1モルTris-HCl、および0.15モルの塩化マグネシウムの結晶化バッファーを調製します。50マイクロリットルのシードストックと100マイクロリットルの結晶化溶液を事前に混合し、1.5ミリリットルの遠沈管でタンパク質溶液と混合します。チューブを10秒間ボルテックスし、摂氏20度のロッカーまたはシェーカーに置きます。

20分ごとに2.5マイクロリットルのバッチ溶液を摂取します。血球計算盤を使用して結晶のサイズと数を監視します。結晶の数を数え、顕微鏡でそのサイズを測定します。

結晶が約15ミクロンの寸法に達したら、0.5モルのTris-HCl、0.075モルの塩化マグネシウム、および20%PEG6000を添加した150マイクロリットルの0.5モル酢酸ナトリウムで反応を停止します。血球計算盤を使用して結晶のサイズと濃度を再確認します。結晶は摂氏20度で保管してください。

エンドチアペプシンモルフォグラム解析は、核形成がタンパク質濃度と沈殿剤濃度の両方に影響されることを示唆した。図のメタ安定領域、核生成領域、および降水領域は、うまく区別できます。種子の添加は、種子なしの液滴と比較して結晶数を有意に増加させた。

200〜300マイクロリットルの容量でのエンドチアペプシン微小結晶化の分析により、結晶核生成と最長寸法の経時的な変化が明らかになりました。PEG濃度を35%に上げると結晶化が著しく向上し、最終結晶濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の約3.6倍、最長の結晶寸法は42マイクロメートルでした。最終的な結晶のサイズを小さくするために、タンパク質濃度低減アプローチが適用されましたが、残念ながら結晶濃度が大幅に低下し、最終的にはさらに大きな結晶が生成されました。

しかし、PEG濃度を40%に高めるアプローチでは、1ミリリットルあたり10〜6倍の約3.1倍の結晶が得られ、サイズは約39マイクロメートルになります。さらに、種子を添加すると、結晶濃度が大幅に増加し、1ミリリットルあたり10〜8倍の約1.1倍、約4.2マイクロメートルの寸法が小さくなりました。結晶化反応で試みた急冷効果により、最終結晶濃度は1ミリリットルあたり10〜6倍の約2.6倍、サイズは約15マイクロメートルでした。

X線データからの分解能に対してプロットされたCCの半分は、10マイクロリットルから200〜300マイクロリットルの容量への結晶分解能のわずかな低下を示した。しかし、結晶は依然として1.5アングストラムに回折し、これは十分であると考えられた。エンドチアペプシンは、扱いやすいタンパク質です。

エンドチアペプシンのこのプロトコルを試すことで、他のタンパク質に役立つアイデアや方法が生まれることを願っています。特に結晶学では、書面によるプロトコルだけに従うのではなく、物事がどのように見え、感じられるかを確認することは有益です。このビデオは、うまくいけば、その感覚の一部としてあなたに与えるでしょう。