3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

このプロトコルは、がん細胞の細胞外マトリックスへの侵入をリアルタイムで制御するメカニズムを研究するために使用することができます。この技術の主な利点は、単純なスフェロイドイメージングデバイスを使用して、スフェロイドの侵入アッセイをセットアップしやすくし、その効率とコストを向上させることです。我々は、乳腺癌をモデル化するためにスフェロイド浸潤アッセイを使用して実証するが、このアッセイは、周囲の健康な組織への任意の固形腫瘍の侵入のための優れたモデルである。

スペーサーの3Dプリント後、プラスチックカップでクロスリンカーにベースポリマーの10:1比を重み出し、使い捨てのピペットを使用して、得られたPDMS溶液をカップに完全に混合します。カップを真空チャンバーに入れ、真空圧を素早く放出して、混合物の表面に閉じ込められた空気を除去し、残りの気泡を消散させます。3Dプリントスペーサーを摂氏100度で5分間インキュベートし、柔軟性を高め、100%イソプロパノールで2枚のガラス板をきれいにします。

スペーサーを置き、クリーニングした 2 つのプレートの間にフラッシュし、下端に 2 つの大きなバインダー クリップを配置し、上隅に 1 つの大きなバインダー クリップを配置して、プレートの外側の端にモールドをシールします。モールドの上部を調べて、スペーサーがガラス板でフラッシュされていることを確認し、先端から約2センチメートルカットされた使い捨てピペットを使用して、ゆっくりとPDMS混合物を金型の左上隅に連続的に追加します。金型全体が充填されたら、100°CでPDMSを1時間硬化させる前に、形成された気泡を除去するために、真空チャンバーに金型を入れます。

インキュベーションの終わりに、金型を室温に置きます。タッチに冷やすときは、硬化したPDMSを含むスペーサーからバインダークリップとガラスプレートを取り出し、カミソリの刃を使用して、スペーサーとガラス板の間の金型の4つの側面すべてに作成されたシールを切断します。モールドを引き離してスペーサーのPDMSシートを明らかにし、ピンセットを使用して慎重にスペーサーのPDMSシートを剥がします。

シートをカッティングマットの上に置き、生検パンチを使用して直径17.5ミリメートルのPDMSディスクをパンチアウトし、均等に分配された3つの5.5ミリメートルの穴をディスクにパンチします。テープを使用して各インサートからほこりを取り除き、洗浄したインサートを両面テープに貼り付けます。10センチメートルのペトリ皿の蓋の周りにテープを包み、開いた35ミリメートルのガラス底皿と一緒にプラズママシンに蓋を置きます。

300ミリトールで1分間のプラズマ処理でインサートとガラスをアクティブにし、ピンセットを使用して各インサートの処理側を1つの処理ガラス底皿のガラス部分に素早く取り付けます。すべてのインサートが適用されたら、ポインターの指と親指を使用して各インサートに均等な圧力を加えながら、皿を回転させ、挿入物を皿にしっかりと取り付けます。すべてのインサートが固定されたら、得られたスフェロイドイメージングデバイスを摂氏60度で20分間インキュベートしてから、実証したように2回目のプラズマ処理を行う。

2回目の処理の後、各挿入穴に35マイクロリットルの作製コーティング液を加えます。室温で1時間後、コーティング液を取り出し、蒸留水で装置を3回洗い流します。最後の洗浄後、各穴に35マイクロリットルの架橋液を加え、室温で30分間のインキュベーションを行います。

インキュベーションの最後に、示されているように、デバイスを蒸留水で3回リンスしてから、各デバイスに70%エタノールを充填してUV光下で30分間インキュベーションします。滅菌の最後に、蒸留水で装置を3回リンスし、各デバイスに2.5ミリリットルの貯蔵溶液を加えます。コラーゲンにスフェロイドを埋め込むには、洗浄ごとに3ミリリットルのPBSでデバイスを3回洗浄します。

最後の洗浄の後、装置を完全に乾燥させ、30マイクロリットルの新しく準備された大学1溶液を挿入物の1つの穴に加え、タイマーを開始する。穴にスフェロイドが存在することを確認した後、示されているように他の2つの穴に回転楕円体を追加します。10 マイクロリットルのピペットチップを使用して、PDMS 境界の近くに位置するスフェロイドを再センタ化するか、複数のスフェロイドが分配されている場合はスフェロイドを分離してタイマーを停止します。

コラーゲン層内のスフェロイドを垂直に中央に合わせます, 播種後, 逆さまにデバイスを反転させ、コラーゲンが重合するまで、デバイスを 37 度でインキュベート, 合計 30 分間 2 分ごとにデバイスの向きを反転, デバイスあたりの媒体の 2.5 ミリリットルを追加し、0 時間の時点で回転楕円体の画像を取得します。スフェロイド画像装置を用い、コラーゲン内または縦画像を介した癌細胞浸潤の効率的な埋め込みおよびタイムラプス記録を容易にする。このスフェロイドは、細胞質および核蛍光タンパク質の安定した発現を必要とする6日間にわたって縦方向に画像化されたが、同様の縦断イメージングは、色素標識を用いてより短い期間で行うことができる。

スフェロイドはまた、固定および免疫標識することができる。例えば、これらのスフェロイドは上皮カドヘリン、コルタクチン、およびF-アクチンについて免疫標識した。これらの画像では、フィジーマクロを使用して時間の経過に伴う回転楕円体の面積を測定する画像処理手順のステップバイステップの図が観察できる。

回転楕円体撮像装置の各穴に単一のスフェロイドを分配し、XY方向とZ方向の両方で孔の中心に回転楕円体を配置するようにしてください。装置の設計は高い回転楕円の効率に対応するために穴、挿入物およびガラス底の皿のサイズおよび配置を変えることによって容易に変えることができる。