Name: 3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ3Dスフェロイドイメージングデバイス製造と時間分解蛍光イメージングによるがん細胞浸潤のリアルタイム解析法。乳がんモデルで検証され、効率的で低コストな固形腫瘍浸潤モデリングが可能です。

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テンプルバイオエンジニアリングの会員の皆様に貴重なご意見をお寄りいただき、ありがとうございました。私たちは、フローサイトメトリーコア(ルイス・カッツ医学部)のデビッド・アンブローズが細胞選別を支援し、IDEASハブ(テンプル大学工学部)のトニー・ベームが3Dプリンティングを手伝ってくれたことに感謝します。我々はまた、我々の資金資源に感謝します:アメリカ癌学会研究学者グラント134415-RSG-20-034-01-CSM、今すぐがんを征服/若い研究者賞、国立衛生研究所、R00 CA172360とR01 CA230777、すべてBGに感謝します。

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著者らは開示するものは何もない。

3Dプリントされたスペーサーは、実験アプリケーションの要求に応じて、PDMSの様々な形状を簡単に作成するために使用できるPDMSの1mm厚いシートを作成するように設計されました。その製作のシンプルさと設計を変更する自由のために、PDMS鋳造のこの方法はSIDの初期設計のために選ばれました。大量のSIDが必要な場合、3つの等間隔の穴を持つPDMSディスクをすでに含む3Dプリント金型を作成し、プロセスを1ステップに減らすことで、生産をより効率的にすることができます。これにより、各ディスクをパンチアウトし、その後の3つの穴を開ける必要がなくなり、全体の準備時間が短縮されます。
3穴パンチは35ミリメートルガラス底皿で使用するために開発されていますが、他のサイズはより多くの穴を可能にし、したがって、より多くの回転楕円体を平行に画像化することができます。さらに、カスタムサイズのカバーガラスも市販されており、3Dプリントホルダーと組み合わせて、ハイスループットのスフェロイドアッセイを可能にします。このようなアプローチでは、制限要因はデータ取得の速度であり、例えば、我々の多色タイムラプス共焦点イ...

癌進行の間に、癌細胞は、運動性および侵襲的表現型を獲得することができ、腫瘍塊を逃れ、周囲の組織1に侵入することを可能にする。最終的には、これらの浸潤性癌細胞は、二次器官内に到達して増殖し、癌転移1と呼ばれるプロセスである。転移は癌関連死の90%以上を引き起こす2.その理由の1つは、局所的な腫瘍は臨床的に管理可能であるが、転移性広がりに一度起こった後に浸潤癌細胞を排除するための効率的な方法が存在しないことです。したがって、浸潤性癌細胞の出現と、局在性から侵襲的な疾患への移行は、大きな臨床的課題を提起している。がん細胞が侵襲的な行動をどのように開始し、維持するかを決定することは、新しい強力な治療法の開発につながる可能性があります。
3Dスフェロイドモデルは、制御下にある癌細胞の運動性挙動を調査するのに理想的なプラットフォームであり、しかも生理学的に関連する条件3.実際、このアッセイでは、癌細胞のスフェロイドが細胞外マトリックス(ECM)の内部に埋め込まれている、例えばコラーゲンIは、単純化された腫瘍を模倣する。次いで、イメージングを使用して、スフェロイドからコラーゲンマトリックスへの癌細胞の浸潤を可視化する。ただし、複数の課題によってこの手順が制限されます。
最初の課題は、液体コラーゲンマトリックスが皿表面全体に広がり、回転楕円体が皿の底に触れる埋め込みステップで起こります。その結果、回転楕円体の細胞が2次元(2D)表面に広がり、3次元(3D)回転楕円体形態を破る。コラーゲンの量を増やすことは効率的ですが、コストのかかるソリューションです。細胞が2D表面に広がるのを防ぐために、コラーゲンの最小量を維持しながら、ガラス底皿に1mmの厚さ、3穴のポリジメチルシロキサン(PDMS)インサートを囲むスフェロイドイメージング装置(SID)を開発しました。
スフェロイドアッセイの第2の課題は、抗体および蛍光色素の浸透不良によって制限されるスフェロイドにおける癌細胞の標識であり、スフェロイドサイズに伴って増大する効果である。細胞の標識に理想的なソリューションは、安定して蛍光タンパク質を発現する細胞株の確立であるが、このオプションは、ほとんどが不死化細胞株に限定され、蛍光タンパク質キメラの入手可能性によって制限される。ここでは、固定スフェロイドの免疫蛍光染色に最適化されたプロトコルと、球状体を埋め込む直前に細胞にラベルを付ける細胞質色素の効率的な使用について述べています。
スフェロイドアッセイの3番目の課題は、時間の経過に関する細胞浸潤の半自動化定量化のための単純なフィジーマクロの欠如です。この課題に対処するために、時間の経過に合ったスフェロイド領域を分析する簡単な方法論を説明します。例として4T1および67NRセルラインを用いて、このプロトコルの利点を説明する。

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>ハネウェル フルカ</td><td>60-014-44</td><td></td></tr><tr><td>10X ダルベッコ 'リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>SH30028.LS</td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368-9M</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Falcon</td><td>T1048</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>抗コルタクチン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab33333</td><td>1 to 200 希釈</td></tr><tr><td>抗E-カドヘリン抗体</td><td>Invitrogen</td><td>13-1900</td><td>1 から 100 希釈の</td></tr><tr><td>ウシ アテロコラーゲン I 溶液 (Nutragen)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>501050ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker レッド CMTPX 色素</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>円錐管</td><td>ファルコン</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て容器</td><td>ステープル</td><td></td><td>プラスチックカップ</td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>eBioscience</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht nuclear stain</td><td>Thermo Fischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fischer</td><td>S25371A</td><td></td></tr><tr><td>MatTek ディッシュ (ガラスボトムディッシュ)</td><td>MatTek株式会社</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロー</td>ス<td>シグマアルドリッチ</td><td>M6385-100G</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レコー<td>ニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペット</td><td>Gilson</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体、ユーザー専用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン I</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体、ユーザー専用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>Globe Scientific</td><td>1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコン</td><td>ダウ コーニング</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトン X100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>655204-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

3dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

原発性腫瘍から隣接する健康組織への癌細胞の侵入は、転移の初期段階である。浸潤性癌細胞は、播種が進行すると排除するための効率的な方法が存在しないため、大きな臨床的課題を提起する。がん細胞の浸潤を調節するメカニズムをよりよく理解することは、新しい強力な治療法の開発につながる可能性があります。その生理学的に腫瘍に類似しているため、コラーゲンIに埋め込まれたスフェロイドは、細胞外マトリックス(ECM)への癌細胞浸潤を支配するメカニズムを研究するために研究者によって広く利用されてきた。しかし、このアッセイは(1)ECMへのスフェロイドの埋め込みに対する制御の欠如によって制限される。(2)コラーゲンIおよびガラス底皿の高コスト、(3)信頼性の低い免疫蛍光標識、抗体および蛍光色素の非効率的な浸透及び(4)時間のかかる画像処理及びデータの定量。これらの課題に対処するために、3次元(3D)スフェロイドプロトコルを最適化し、コラーゲンIに埋め込まれた蛍光標識癌細胞を、タイムラプスビデオまたは縦断イメージングを使用して画像化し、癌細胞の浸潤を分析しました。まず、スフェロイドを確実に、かつ最小限のコラーゲンI体積に埋め込むスフェロイドイメージング装置(SID)の製造を説明し、アッセイコストを低減する。次に、生および固定スフェロイドのロバスト蛍光標識のステップを説明します。最後に、画像処理とデータ定量のための使いやすいフィジーマクロを提供します。全体として、この単純な方法論は、コラーゲンIの癌細胞浸潤を監視するための信頼性の高い、手頃な価格のプラットフォームを提供します。さらに、このプロトコルはユーザーのニーズに合わせて簡単に変更できます。

PDMSは生体適合性により、微細パターン化やマイクロ流体デバイスに革命を起こした閉じ込め井戸、スタンプ、金型の微細加工に広く使用されています。ここで説明する方法では、スフェロイド埋め込みおよびイメージング手順を最適化する、カスタマイズ可能なウェルであるSIDを作成するために使用されます。図 1は、SID の製造に使用される主要なコンポーネントを示しています。PDMSモールドを鋳造するために、厚さ1mmのスペーサを3Dプリント(図1A、B)で、2枚のガラスプレートの間に配置し、大きなクリップで密封します。プレート間のスペースにPDMSを注ぎ、焼き付け、1mm厚いPDMSを形成する。SID回路図(図1C)は、最適なデバイスの寸法を示し、しかし、バイオプシーパンチを使用して穴のパンチを手動で打ち抜くので、穴の距離にわずかな変動が生じる(図1D)。<strong class=...

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

このプロトコルは、がん細胞の細胞外マトリックスへの侵入をリアルタイムで制御するメカニズムを研究するために使用することができます。この技術の主な利点は、単純なスフェロイドイメージングデバイスを使用して、スフェロイドの侵入アッセイをセットアップしやすくし、その効率とコストを向上させることです。我々は、乳腺癌をモデル化するためにスフェロイド浸潤アッセイを使用して実証するが、このアッセイは、周囲の健康な組織への任意の固形腫瘍の侵入のための優れたモデルである。スペーサーの3Dプリント後、プラスチックカップでクロスリンカーにベースポリマーの10:1比を重み出し、使い捨てのピペットを使用して、得られたPDMS溶液をカップに完全に混合します。カップを真空チャンバーに入れ、真空圧を素早く放出して、混合物の表面に閉じ込められた空気を除去し、残りの気泡を消散させます。3Dプリントスペーサーを摂氏100度で5分間インキュベートし、柔軟性を高め、100%イソプロパノールで2枚のガラス板をきれいにします。スペーサーを置き、クリーニングした 2 つのプレートの間にフラッシュし、下端に 2 つの大きなバインダー クリップを配置し、上隅に 1 つの大きなバインダー クリップを配置して、プレートの外側の端にモールドをシールします。モールドの上部を調べて、スペーサーがガラス板でフラッシュされていることを確認し、先端から約2センチメートルカットされた使い捨てピペットを使用して、ゆっくりとPDMS混合物を金型の左上隅に連続的に追加します。金型全体が充填されたら、100°CでPDMSを1時間硬化させる前に、形成された気泡を除去するために、真空チャンバーに金型を入れます。インキュベーションの終わりに、金型を室温に置きます。タッチに冷やすときは、硬化したPDMSを含むスペーサーからバインダークリップとガラスプレートを取り出し、カミソリの刃を使用して、スペーサーとガラス板の間の金型の4つの側面すべてに作成されたシールを切断します。モールドを引き離してスペーサーのPDMSシートを明らかにし、ピンセットを使用して慎重にスペーサーのPDMSシートを剥がします。シートをカッティングマットの上に置き、生検パンチを使用して直径17.5ミリメートルのPDMSディスクをパンチアウトし、均等に分配された3つの5.5ミリメートルの穴をディスクにパンチします。テープを使用して各インサートからほこりを取り除き、洗浄したインサートを両面テープに貼り付けます。10センチメートルのペトリ皿の蓋の周りにテープを包み、開いた35ミリメートルのガラス底皿と一緒にプラズママシンに蓋を置きます。300ミリトールで1分間のプラズマ処理でインサートとガラスをアクティブにし、ピンセットを使用して各インサートの処理側を1つの処理ガラス底皿のガラス部分に素早く取り付けます。すべてのインサートが適用されたら、ポインターの指と親指を使用して各インサートに均等な圧力を加えながら、皿を回転させ、挿入物を皿にしっかりと取り付けます。すべてのインサートが固定されたら、得られたスフェロイドイメージングデバイスを摂氏60度で20分間インキュベートしてから、実証したように2回目のプラズマ処理を行う。2回目の処理の後、各挿入穴に35マイクロリットルの作製コーティング液を加えます。室温で1時間後、コーティング液を取り出し、蒸留水で装置を3回洗い流します。最後の洗浄後、各穴に35マイクロリットルの架橋液を加え、室温で30分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、示されているように、デバイスを蒸留水で3回リンスしてから、各デバイスに70%エタノールを充填してUV光下で30分間インキュベーションします。滅菌の最後に、蒸留水で装置を3回リンスし、各デバイスに2.5ミリリットルの貯蔵溶液を加えます。コラーゲンにスフェロイドを埋め込むには、洗浄ごとに3ミリリットルのPBSでデバイスを3回洗浄します。最後の洗浄の後、装置を完全に乾燥させ、30マイクロリットルの新しく準備された大学1溶液を挿入物の1つの穴に加え、タイマーを開始する。穴にスフェロイドが存在することを確認した後、示されているように他の2つの穴に回転楕円体を追加します。10 マイクロリットルのピペットチップを使用して、PDMS 境界の近くに位置するスフェロイドを再センタ化するか、複数のスフェロイドが分配されている場合はスフェロイドを分離してタイマーを停止します。コラーゲン層内のスフェロイドを垂直に中央に合わせます, 播種後, 逆さまにデバイスを反転させ、コラーゲンが重合するまで、デバイスを 37 度でインキュベート, 合計 30 分間 2 分ごとにデバイスの向きを反転, デバイスあたりの媒体の 2.5 ミリリットルを追加し、0 時間の時点で回転楕円体の画像を取得します。スフェロイド画像装置を用い、コラーゲン内または縦画像を介した癌細胞浸潤の効率的な埋め込みおよびタイムラプス記録を容易にする。このスフェロイドは、細胞質および核蛍光タンパク質の安定した発現を必要とする6日間にわたって縦方向に画像化されたが、同様の縦断イメージングは、色素標識を用いてより短い期間で行うことができる。スフェロイドはまた、固定および免疫標識することができる。例えば、これらのスフェロイドは上皮カドヘリン、コルタクチン、およびF-アクチンについて免疫標識した。これらの画像では、フィジーマクロを使用して時間の経過に伴う回転楕円体の面積を測定する画像処理手順のステップバイステップの図が観察できる。回転楕円体撮像装置の各穴に単一のスフェロイドを分配し、XY方向とZ方向の両方で孔の中心に回転楕円体を配置するようにしてください。装置の設計は高い回転楕円の効率に対応するために穴、挿入物およびガラス底の皿のサイズおよび配置を変えることによって容易に変えることができる。

time-resolved-fluorescence-imaging-analysis-cancer-cell-invasion-3d

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映...

モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp.

腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。...

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

浸潤は、がんの発生と進行における主要な生物学的現象です。このプロセスは、腫瘍微小環境の非腫瘍性細胞および成分の影響を受けます。この研究の目的は、三次元(3D)培養を使用して in vitro...

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

学ぶ3Dスフェロイドイメージングデバイス製造と時間分解蛍光イメージングによるがん細胞浸潤のリアルタイム解析法。乳がんモデルで検証され、効率的で低コストな固形腫瘍浸潤モデリングが可能です。

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

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