ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

このプロトコルは、遺伝的に扱いやすいショウジョウバエの幼虫の機械的侵害受容反応を正確に測定するために使用できるツールをユーザーが構築することを可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、単純な材料を使用して、サブスレッショルドから完全に応答する範囲までの機械的侵害受容を測定するために使用できるカスタムツールを構築することです。これらのツールと方法は、ベースラインの機械的侵害受容と、損傷や病気後の侵害受容感作を測定するために使用できます。

カスタムフィラメントで幼虫をプローブするには練習が必要です。ユーザーは、実験を試みる前に、対照幼虫の用量反応曲線を生成できる必要があります。機械式プローブを構成するには、小さなワイヤーカッターを使用して、各ニチノールフィラメントを長軸に垂直な指定の長さに切断します。

フィラメントには、3つの異なるプリセット直径があります。実体顕微鏡でフィラメントの先端を検査し、幼虫の皮膚に組織損傷を引き起こし、キャリブレーションを妨げる可能性のある鋭利なエッジや不規則なエッジが残っていないことを確認します。次に、砥石を使用して、鋭い凹凸が残らなくなるまでプローブのエッジを手動で滑らかにします。

次に、皮下注射針を使用して、木製のアイスキャンディースティックの先の近くに穴を開けます。1本のニチノールフィラメントに木工用ボンドを塗布し、接着剤でコーティングされたフィラメントを針スロットに挿入します。接着剤が乾いたら、プローブが曲がるまでプローブをスケールに押し付けて、グラム単位で記録できる最大力を決定します。

この式を使用して、記録された質量をミリニュートン単位の力に変換します。次に、測定した力をフィラメント先端の表面積で割って、計算された力をキロパスカルの圧力に変換します。直径と長さの異なるフィラメントを使用して複数のプローブを調製すると、ショウジョウバエの幼虫の応答範囲にわたるフルセットが生成されます。

ショウジョウバエの幼虫を実験用に準備するには、幼虫の子孫を摂氏25度のインキュベーターで標準的な食品で約96時間育てます。幼虫が第3インスター期に到達したら、幼虫がテストできるように小さなペトリ皿にフライフードのプラグを準備し、鉗子を使用して、中型の中期から第3インスターの幼虫を小さい第2および初期の第3インスター、およびより大きな後期または放浪する第3インスターの幼虫から穏やかに選別します。次に、鉗子を使用して、20〜30匹の中期第3幼虫を、室温で水で湿らせたハエの餌の小さなプラグを含む小さなペトリ皿に移します。

機械的侵害受容アッセイを行うには、鉗子を使用して、明視野実体顕微鏡の下の暗い薄いビニールパッドに中期3齢の幼虫を配置し、顕微鏡の対物レンズとパッドの間に光ファイバーライトを配置します。ペーパータオルを使用して幼虫を取り巻く余分な水分を拭き取り、パッドを動かして幼虫の頭と口を研究者の利き手でない手に向けます。機械的なプローブを選択し、プローブを幼虫の後背側、腹部セグメントA8で1〜2秒間適用し、プローブが曲がって以前に測定した圧力量を引き出すまで、プローブの接触点で幼虫を下部のパッドに慎重に圧縮します。

肯定的な侵害受容反応は、幼虫が3秒以内に体の軸に沿って360度の完全なコルク栓抜きロールを示す場合、示されます。各幼虫の行動反応を記録します。次に、試験した幼虫を廃棄し、次の幼虫をアッセイ用に準備します。

ニチノールフィラメントを使用したこれらのカスタマイズされたメカニカルプローブは、機械的に誘発される挙動を誘発し、さまざまな強度の無害な機械的プローブと有害な機械的プローブの両方を使用して完全な挙動用量反応曲線を生成するために使用できます。これらの行動アッセイの結果が示すように、200キロパスカル以下の圧力をかけるプローブは、ショウジョウバエの幼虫に嫌悪的なローリング応答を引き起こさない。予想通り、これらの閾値以下または無害な機械的プローブは、目に見えるニューロン組織の損傷を引き起こさない。

逆に、スーパースレッショルドプローブまたは有害プローブは、用量依存的に末梢感覚ニューロン自体に拡張された行動応答と組織損傷を誘発します。これらのプローブは、損傷後の機械的過敏症の測定にも使用できます。幼虫の約20%は、UV処理後2時間という早い時期に嫌悪的なローリングで反応し、50%は模擬UV照射動物と比較して4時間で反応しました。

この分析に使用したプローブは通常、閾値以下の200キロパスカルであったため、この応答は機械的異痛症と見なされました。後の時点で、UV処理された幼虫の行動反応はわずかに増加しますが、模擬照射された対照群の行動反応と統計的に異なることはありません。UV処理の4時間後、8時間後、および16時間後に462キロパスカルプローブでプローブされた幼虫は、刺激が最初に有害であったため、4時間が行動過敏症のピークであり、嫌悪ローリング応答の大幅な増加を示します。

反応は機械的痛覚過敏であると考えられていました。プローブの調製と幼虫の選択と圧縮は、プロセスの成功に不可欠です。これらのプローブを使用すると、ベースラインの侵害受容と機械的侵害受容性過敏症を損傷後に測定できます。

これらのツールとアッセイを使用して、機械的侵害受容および侵害受容過敏の分子的および遺伝的基盤を、遺伝的に扱いやすいショウジョウバエモデルで測定できます。