Name: ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の機械的結知測定法。Nitinol製プローブを用いて、傷害後の過敏性や異常性疼痛を定量的に評価する手法を解説します。神経科学と行動生物学の研究に有用です。

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プロトタイプのフォン・フレイ・フィラメントを開発してくれたトーマス・ワン、機械的プローブアッセイを改善したパトリック・J・黄、コントロール用ブルーミントン・ショウジョウバエストックセンター(w1118)、ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFPフライストック、ガルコラボのメンバーが原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。 この作業は、R21NS087360およびR35GM126929からMJGに対応しました。

1. 機械式プローブ構造
<ol><li>各ニチノールフィラメント(図1B)を、その長い軸に垂直に、小さなワイヤーカッターを使用して指定された長さに切り取ります(図1M–N)。フィラメントには、3つの異なる事前設定直径があります(図1B)。 注: ここで指定した長さは、マウントの構築に同様のプロトコルを使用して、示された近似圧力を達成するためのガイドです。最終的には、フィラメントカットの長さ、およびマウント内の穴の深さに関係なく、フィラメントを測定/キャリブレーションして正確な力/圧力値を得る必要があります。</li>
	<li>体型顕微鏡でフィラメントの先端を調べて、幼虫の皮膚に組織損傷を与え、校正を妨げる可能性があるため、鋭利または不規則なエッジが残らないようにします。</li>
	<li>シャープな凹凸が残らなくなるまで、シャープな砥石を使用して、機械プローブの鋭いエッジを手動で滑らかにします(図1D)。</li>
	<li>皮下注射針を使用して木製のポプシクルスティックの端に向かって穴を開けます (図 1E) ( 材料表を参照)。針をポプシクルスティックの高さの少なくとも途中まで挿入します(図1E)。これはニチノールフィラメントの挿入のためのチャンバを作成する。</li>
	<li>木の接着剤を単一のニチノールフィラメント(図1F)に塗布し、木製のポプシクルスティックの針スロットに接着剤でコーティングされたフィラメントを挿入します(図1G)。~5時間乾燥させます。</li>
	<li>各機械プローブをスケールに押し付けて、機械プローブが曲がるまでキャリブレーションします(図1H–L)。これはグラムで記録することができる最大力のポイントです。フィラメントの直径(事前設定)と長さ(ユーザーが決定)に応じて、全範囲の力と圧力を発生させることができます。</li>
	<li>f = ma (力は重力加速度で質量を掛けたものに等しい) を使用して、ステップ 1.6 で記録された質量をミリニュートン (mN) に強制的に変換します。f: 力;m: 質量;a: 重力加速度 (9.8 m/s2) (図 1M)</li>
	<li>最後に、測定力をフィラメント先端の表面積で割って算出力を圧力(力/面積)に変換します(図1M)。面積を計算するには、異なるニチノールフィラメントの直径をインチ(0.04"、0.06"、0.08")からセンチメートルに変換します。そして、πr2( ここで、r=ニチノールフィラメント半径)が面積を決定する( 図1Mを参照)。異なる直径と長さのフィラメントを使用して複数のプローブを準備すると、 ショウジョウバエ 幼虫の応答範囲にまたがるフルセットが生成されます( 図1Nに示すサンプルセット)。 注:少なくとも3~4週間ごとに各メカニカルプローブをチェックしてください。圧力が元の尺度から3%以上±ずれた場合、新しい機械式プローブを製造する必要があります。</li>
</ol>2. 幼虫の準備
<ol><li>25°Cインキュベーターで標準食品に対する対照株(w1118)ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFPを含む幼虫または幼虫を上昇させる。 通常、在庫は18°Cで日常的に維持されていますが、両親と幼虫の子孫の両方が実験のために標準的なコーンミール食品で25°Cで飼育されています。 注:大人のハエ(雄5匹とメス10匹、比率1:2)はハエバイアルに入れておき、産卵を可能にするため、約24時間保たれます。産卵後の時間(AEL)は、大人が取り除かれる時から始まります。</li>
	<li>3番目のインスター幼虫を集め、約96時間の産卵後、幼虫を含む柔らかいフライ食品に水道水をそっと噴出して集める。食べ物を残した、または前または後の尖塔を持ち去った放浪幼虫は、このアッセイには大きすぎる/古い。第2のインスター幼虫(長さが4mm未満)が小さすぎる。</li>
	<li>ソフトフライ食品の内容物をきれいな標準サイズのペトリ皿(100mm x 15 mm)に注ぎます。</li>
	<li>鉗子を使用して、3番目の中星、中型の幼虫( 図2Aを参照)を小さい(第2のインスターおよび初期の第3のインスター)または大きい(後期またはさまよっている第3のインスター)幼虫から分類する。幼虫への組織損傷を避けるために鉗子による穏やかな操作が推奨されます。 注:鉗子を使用して移動は、主に水張力に基づいており、鉗子のブレードで幼虫に圧力をかけることではありません。幼虫を操縦するための鉗子の使用に代わるものは柔らかいペンキのブラシである。どちらのツールを使用すると、ユーザーは行動測定を複雑にする可能性のある意図しない組織損傷を引き起こしないように、動物を転送する練習をする必要があります。</li>
	<li>鉗子を使用して、3番目の中身の幼虫を、室温で水で湿らせたフライフードの小さなプラグを含む小さなペトリ皿(30mm x 15 mm)に移します。実験が行われるまで小さなペトリ皿に幼虫を入れておいてくださいが、20分以下です。 注:一般的に、20~30本の幼虫をフードプラグに移すと、20分間の行動アッセイに十分な数が与えられます。</li>
</ol>3. 機械的なノシセプションアッセイ
<ol><li>明るいフィールドの実体顕微鏡の下で黒または暗いビニールの薄いパッドの上に中3分の1のインスター幼虫(鉗子を使用して)を置きます。暗い色は幼虫の視覚化を改善するコントラストを提供する。それはユーザーが触れたり、傷つけることなく幼虫を整列することができるので、暗いビニールの自由に移動可能な部分を持っている方が好ましいです。</li>
	<li>顕微鏡対物レンズと黒または暗いビニールパッドの間に光ファイバーライトを入れてください。これにより、幼虫を見るための十分なハイコントラスト照明が可能になります。</li>
	<li>パッドへの転写後、正常な移動を示さない幼虫を捨てます。これらは、正常な不可解な行動応答を妨げる可能性があります。通常の移動については、ビデオ 1を参照してください。</li>
	<li>洗い流し、ペーパータオルを使用して、幼虫を取り巻く余分な水が幼虫パッドに浮かぶ可能性があります。</li>
	<li>暗いビニールパッドを動かして幼虫の向きを変えます。右利きの場合は幼虫の頭/口を左を指し、左利きの場合はその逆を指す必要があります(図2A–B)。</li>
	<li>選択した機械的プローブ(通常は1~2s)を、ほぼ腹部セグメントA8の幼虫背側( 図2Bを参照)に適用し、プローブが曲がり、以前に測定された圧力量を引き出す(図2C)。プローブが幼虫の後ろ面に押し付け、プローブ接触点で幼虫を下層部のパッドに圧縮することが重要です。 注:ニチノールフィラメントの先端と後部キューティクル表皮との接触点では、2,300kPa未満のプローブは、主にキューティクルと下層の組織を貫通することなく曲がります。このようなプローブは幼虫死亡率に影響を及ぼすことはほとんどありません。より高い圧力(>5,000 kPa)でプローブは曲がり、時にはキューティクルと下層組織に浸透します。幼虫の穿刺は幼虫生存を損なう4 であり、観察された場合、これらの幼虫は典型的には行動解析から廃棄される。</li>
	<li>各幼虫の行動応答を記録します。陽性の可分化応答(ビデオ2)は、幼虫が3s以内の体の軸に沿って360°の完全なロールを示す場合に示される。他の応答(旋回、高速クロール、およびウィグリングを試みている)は、このアッセイの目的のために否定的であると考えられます。 注:下閾値機械的刺激(200 kPa)で刺激された幼虫は、典型的な可分化または圧延応答を引き出さなかった(ビデオ3)。一部の幼虫は、動きの方向の変化などの早送り応答または軽いタッチ応答を示しました。</li>
	<li>幼虫を捨て、次の幼虫をアッセイのために準備し、ステップ3.1から3.7を繰り返します。</li>
	<li>必要な数の幼虫に達するまでステップ3.1~3.7を繰り返します(各プローブに対して3~6組のn=10匹の幼虫を使用)。 注:低圧の機械プローブ(174-462 kPa)を使用する場合、このアッセイは幼虫あたりより多くの時間がかかります。これは、長いフィラメントの先端がより振動し、A8セグメントの中央に幼虫を突き刺すのが難しくなるためです。これらのプローブでは練習が必要です。</li>
</ol>4. 神経形態を評価する共焦点顕微鏡
<ol><li>以前にニチノールフィラメントで刺激された幼虫(感覚ニューロンにラベルを付ける 遺伝子型ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP) を、10mLのジエチルエーテルを浸した綿のボールを運ぶ10mLビーカーを含むコプリン瓶の中のエーテル化チャンバーに入れます。幼虫をチャンバーに座らせて~5分間おきます。 注:エーサライゼーションのための詳細なプロトコルは、私たちのグループ12によって発表された以前の研究で提供されています。</li>
	<li>幼虫をエーテル化チャンバーから小さなペトリ皿にそっと洗いす。</li>
	<li>準備準備1顕微鏡スライド、2つの小さなカバーリップ(22 x 22ミリメートル)、および1つの長いカバースリップ(22 x 54 mm)を持っています( 材料表を参照)。</li>
	<li>ether:オイル溶液の小さな滴を加える:スライドの両端に、エチルエーテルとハロカーボンオイル溶液の1:5比、 材料表を参照してください。スライドの両端に小さなカバーリップを置いてから、小さな液滴の上に小さなカバーリップを置きます。この配置は幼虫が収まる小さなスペースギャップを作り出す。 メモ:小さなカバーリップを顕微鏡スライドに押し付けて、滑りが難くなるまで押します。</li>
	<li>顕微鏡スライドの中央にエーテル:オイル溶液を追加し、その後、顕微鏡スライド(小さなカバーリップの間)の中央に、鉗子を使用して、幼虫を置きます。幼虫の後部軸がスライドの短辺と平行であり、背側が上向きであることを確認します。</li>
	<li>幼虫の上に置かれた長いカバースリップと2つの小さなカバーリップで幼虫を覆います。 注:幼虫がほぼ平らになるまで長いカバースリップを寛大に押してください。</li>
	<li>レーザー波長488(GFP)を用いた共焦点顕微鏡( 材料表参照)を用いた幼虫の画像セグメントA8。 注:エーテルを介した麻酔が急速に消え(〜5〜10分)、幼虫が目を覚まして移動するため、すぐに幼虫を画像化すると、さらなるイメージングが複雑になります。</li>
	<li>1xズームで20x数値開口(NA)0.7ドライ対物レンズ、ステップサイズ1.5μmでZスタック画像を1024 x 1024ピクセルの解像度でキャプチャします。</li>
</ol>5. 組織損傷の定量
<ol><li>セクション 4.8 から Z シリーズ スタック イメージを収集して、単一の Z 投影に変換します (異なる焦点面で撮影された複数の画像を単一の合成画像に平坦化)。これは、市販のソフトウェア(例えば、オリンパスFluoview)または同等のオープンソースプラットフォーム、例えば、フィジー/イメージJを使用して実行することができます。</li>
	<li>画像解析プログラムフィジー/イメージJを開きます。</li>
	<li>メニュー バーの [ ファイル] をクリックし、表示されたウィンドウから [ 開く ] を選択します。</li>
	<li>TIFF 形式で保存された、分析する 1 つのイメージ投影法を選択します。</li>
	<li>メニュー バーの [編集] をクリックし、表示されるウィンドウから [反転 ] オプションを選択します。</li>
	<li>メニューバーの [ イメージ] をクリックし、表示されたウィンドウから [ 調整] を 選択し、最後に [明るさ/コントラスト ] オプションを選択します。</li>
	<li>ツールバーからフリー ハンドシェイプ オプションを選択して、ギャップの面積を測定します(存在する場合)。</li>
	<li>メニュー バーの [ 分析] をクリックし、[ 測定] オプションを選択します。これにより、ギャップまたは巻きの領域が表示されます。</li>
</ol>

<ol><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
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<li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ニチノールフィラメントから作製されたカスタマイズされた機械プローブを用いて、確立された機械的アッセイ1,2,16を改変しました。この金属合金は、ショウジョウバエ幼虫の大きさに適した小径フィラメントを使用することができます。釣り糸ベースのモノフィラメントは、日付2、5、6、16にハエ機械的なノシセプションの分野を支配してきました。ニチノールフィラメントは、約〜3〜5ヶ月間(当社の経験で)その形状と測定された圧力を維持します。ニチノールフィラメントの長さと直径を変えることで、ユーザはサブしきい値からほぼ完全な圧動応答に及ぶ幅広い圧力を生成することができます。特に、サブ閾値プローブの作成は、小径のニチノールフィラメントでより簡単です。これらのプローブを用いて、圧力は力ではなく、より一貫した性防御行動応答を引き出すことがわかった4.ここでは、UV誘導性聴作性感作モデル7,10,13を用いて、これらのフィラメントが機械的過敏症(同痛症と過痛)を研究する上でも有用なツールであることを示す。
釣り糸から作られた機械プローブを用いた以前の研究は、行動応答性2、6、16、17に一定のばらつきを導いてきた。いくつかの要因がこれを説明するかもしれません。まず、圧力が重要な変数であるため、フィラメント先端のバフ処理は丸みを帯びて、鋭いエッジを持たないようにすることが重要です。第二に、同様の力を発生させる異なる機械的プローブが異なる圧力を引き出すことができるので、力だけでなく圧力値を報告することは実験の再現性にとって重要である4。第三に、このようなプローブは表皮4および感覚神経レベルで用量依存性組織損傷を生じるので、有害なプローブを使用して幼虫ごとに1つの機械的刺激のみを適用することが重要である(図2E)。第2または後の有害な機械的刺激は、組織損傷が誘発された後、影響を受けた末梢感覚ニューロンの機能を損なう可能性があり、変化した行動応答を引き出す可能性がある。別の研究では、有害な機械的プローブで2回刺激された幼虫は、主に強化された行動応答を示す5を示し、急性機械的感作(過痛)の発症を示唆し、これは最初の有害な機械的刺激によって引き起こされた組織損傷に起因する可能性がある。逆に、他の著者6は、行動応答の変化が神経組織の損傷/機能不全に起因する可能性があることを示す、混合(増加または減少)行動応答を報告した。各幼虫を一度だけ刺激すると、感作または組織損傷のいずれかから生じる行動応答の可能な差異を排除する。第4に、我々は、機械的に、以前の研究(好ましい領域A3-A4)2、5、16よりも後方であるセグメントA8を、刺激した。セグメントA2またはA8のいずれかに適用される約3,900kPaと5,300kPaの間のプローブは、行動の違いを示さなかった4.また、A8はA2-A4と比較して、幼虫が薄くなり、より容易に圧縮されるため、より低い圧力(<300 kPa)を発生する機械的プローブで刺激することが容易です。他の研究は、幼虫の後端の有害な機械的刺激(硬い昆虫ピンによって送達され、鉗子で保持される)が、主に回避的または圧延応答18ではなく前方移動を誘発することを示した。この異なる行動応答は、使用材料(曲げ可能なニチノールフィラメント対非圧縮性昆虫ピン)の特性の違い、または幼虫に送達された異なる圧力(昆虫ピンの圧力値は報告されなかった)に起因する可能性がある。
ショウジョウバエ幼虫の機械的なノシセプションアッセイの開発により、異なる機械的感覚イオンチャネルと神経回路が機械的な結び点5、6、16、17を媒介することを発見することができました。しかし、機械的過敏症(異痛症と過痛)の研究は、他の感覚モダリの感作と比較して遅れている- 熱7、8、10、13、14、冷たい9、および化学3。この遅れは、閾値を超える圧力に対するサブしきい値にまたがる完全な応答範囲を生成できる適切な機械的プローブがないことが原因である可能性があります。特に重要なのは、特に機械的アロディニアを評価するために、傷ついていない幼虫からの回避的な転がり応答を引き出さないサブ閾値プローブである。私たちの改善された機械プローブの意義は、無害な刺激(サブ閾値〜174 kPa-200 kPa)または低から高い有害度範囲(超閾値〜〜〜5,116 kPa)に成形できることです。ここでは、ショウジョウバエの幼虫がUV照射後に機械的アロディニアと機械的過痛の両方を発症することを、ニチノール・フォン・フレイ様フィラメントを用いて実証する。機械的感作は熱感作と比較していくつかの違いを示す。機械的感作の発症とピークの両方が熱(熱)感作(高痛痛の場合は〜8時間、アロディニアでは〜24時間)7と比較して早く(〜4時間)である。また、機械的なアロディニアと過敏症は、共和性である(〜4時間で両方のピーク)。さらに、熱感作(異痛症および過痛)が後の時点で完全に解決する一方で、機械的過敏症は、ベースラインをわずかに上回った長い尾を呈した。ショウジョウバエの冷感作は、コールド呼び起こされた挙動9のスイッチと、新しいコールド呼び起こされる行動の出現を伴います。発症、持続時間、および観察された行動におけるこれらの違いは、各感覚的モダリティが異なるシグナル伝達経路によって制御され得ることを示唆している。ここで説明する感作アッセイとショウジョウバエで利用可能な強力な遺伝的ツールを組み合わせることで、観察された機械的過敏症(多痛症および過痛症)の正確な遺伝的解剖を可能にするべきである。

ショウジョウバエ 幼虫は、異なる有害刺激にさらされたときに特徴的な回避的な転がり行動を示す:熱1、機械2、および化学3。この動作は、通常の移動とは明確に区別されます。ここでは、機械的な特性の評価や機械的感作を評価するために使用できる改良された機械的アッセイについて説明します。
最近の研究では、ニチノールワイヤー4を使用してフォンフレイのようなフィラメントを製造しました。異なる力と圧力を加えるプローブは、各プローブを形成するニチノール線の長さと直径を変えることによって作られました。機械プローブを較正し、測定力値(ミリニュートン、mN)を圧力(キロパスカル、kPa)に変換し、各プローブ4の先端領域に基づいて行った。機械的プローブのカスタム製造は、サブ閾値(≤200 kPa)を生成して超閾値(225 kPa〜5318 kPa)圧力を生成することを可能にし、原則として機械的過敏症の研究に有益である可能性があります。これらの改良された機械的フォンフレイ様フィラメントを用いて、我々は、以前に調べた力2、5、6とは対照的に、圧力4がショウジョウバエ幼虫における回避行動応答性とより一貫して相関することを示した。ここで説明した改善された機械的アッセイはまた、ハエおよびラット4の機械的発性を調節する経路をシグナル伝達する保存された血管内皮成長因子(VEGF)関連受容体チロシンキナーゼを同定するのにも役立った。
機械的異痛症および過痛症は、過敏症の2つのモダリティ、ショウジョウバエ幼虫において比較的研究されており、熱(熱および冷熱)および化学官能様式3、7、8、9、10と比較する。これはおそらく、無害な刺激から高い有害範囲2、5、6に及ぶ特定の機械的プローブの欠如によるものです。ショウジョウバエ幼虫が組織損傷を経験した後の典型的な非刺激性の典型的な圧延行動を引き出す通常無害な刺激を、7は異痛症と呼ばれる。典型的な有害な刺激に対する誇張された圧延応答は、過痛7として知られている。有害刺激は、組織の損傷を引き起こすものと定義され、ノシセプター11を活性化することができる。ショウジョウバエ幼虫に伝達される有害刺激は、バリア表皮、末梢切開性感覚ニューロン3、4、7、またはその両方に損傷を与える。
この記事では、ショ ウジョウバエ 幼虫に適したフォン・フレイ様機械プローブをカスタム製造および較正する方法を示します。また、ショ ウジョウバエ 幼虫の機械的な興奮性応答をアッセイするためにこれらのプローブを使用する方法を示す。最後に、これらのプローブを使用して、ショ ウジョウバエ 幼虫の組織損傷に続く、アロディニアと過痛の両方の機械的過敏症の存在を実証することによって、さらに 実証します(代表結果を参照)。

<table><tbody><tr><td>ビーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-540C</td><td>容量10mlのビーカー。同様のコンテナであれば何でもかまいません。</td></tr><tr><td>ブラック(アーカンソー州)ベンチストーン</td><td>ダン'砥石</td><td>SKU:I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>ニチノールワイヤーチップの凹凸を滑らかにするために使用されます。 https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr> <tr><td>共焦点顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1000</td>任意の<td>同等の共焦点顕微鏡は、</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>08-816</td><td>を行いますhttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E138-500</td><td>麻酔幼虫用。</td></tr><tr><td>エーテル化チャンバー</td><td></td><td></td><td>自家製のカスタマイズされたチャンバーです。その構造の詳細については、以前に公開された論文12をご覧ください。エーテル化チャンバーの目的は、ジエチルエーテルフュームの侵入を許可することですが、幼虫の脱出を防ぎます。</td></tr><tr><td>光ファイバーライトガイド</td><td>ショットAG</td><td>A08575</td>ショット<td>デュアルグースネック23インチ</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>FS-1670</td>幼<td>虫を転送するため</td></tr><tr><td>接着剤</td><td>Aleeneの</td><td>N / A</td><td>Aleene's&reg;木工用接着剤、以前は(Aleene's All-Purpose Wood Glue)と呼ばれていました https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>把持可能ホルダー</td><td>ロウ・コーネル</td><td>N/A</td><td>ロウ・コーネル・シンプリー・アート・ウッド・カラー・クラフト・スティック、500個入り。</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル700</td><td>シグマ</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射針30G 1/2 "L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1471286</td><td>BDプレシジョングライド&reg;シリンジ針、ゲージ30、L 1/2インチ。ニチノール線用の木製ホルダーに穴を開けるために使用</td></tr><tr><td>大型ペトリディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>351007</td><td>60 mm x 10 mm ポリスチレンペトリディッシュ</td></tr><tr><td>顕微鏡(ツァイス) ステミ 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>同等の顕微鏡は、</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22x22</td><td>フィッシャー</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22x40</td><td>コーニング</td><td>2980-224</td><td>ティックネス 1 1/2</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>グローブサイエンティフィック社を行います。</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>ミニ斜めカッター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S43981</td><td>ニチノールフィラメントを切断するためニ</td></tr><tr><td>チノールフィラメント、直径:0.004インチ、0.006インチ、0.008インチ</td><td>Mailin Co</td><td>N / A</td><td>12"長さの各直径の15個が注文されました. https://malinco.com/</td></tr> <tr><td>Piece of black vinyl</td><td>Office Depot</td><td>N / A</td><td>私たちはバインダーから切り取ったビニールの小さな部分を使用しています。暗い色がコントラストを提供します。小さなピースは、幼虫の向きを可能にします</td></tr><tr><td>小さなペトリディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>351008</td><td>35 mm x 10 mm ポリスチレン ペトリディッシュ</td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>21-401-10</td><td>ダブルエンド マイクロテーパー ステンレス鋼 スパチュラ。ペトリ皿ワイ</td></tr><tr><td>プ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>06-666A</td><td>キンペスKMTECH、科学ブランドに食品を置くために使用されます。余分な水分の幼虫を乾燥させるために使用されます。</td></tr><tr><td>W1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td>行動アッセイの制御株</td></tr><tr><td>ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>8749</td><td>クラス IV md ニューロンの蛍光標識のための株</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

ショウジョウバエの機械的発性に関するアッセイが発表され、行動の可変的評価が得られます。ここでは、ショウジョウバエ幼虫、カスタマイズされた金属ニッケルチタン合金(ニチノール)フィラメントとの使用のために、製造しました。これらの機械プローブは、脊椎動物で機械的な切り離しを測定するために使用されるフォン・フレイのフィラメントに似ています。ここでは、これらの機械的プローブを作って較正する方法と、サブ閾値(無害または非有害な範囲)から超閾値(低から高い有害範囲)への完全な行動線量応答を生成する方法を示す。プローブの有用性を実証するために、ショウジョウバエ幼虫における組織損傷による過敏症を調べた。ショウジョウバエ幼虫では、機械的な異痛症(通常無害な機械的刺激に対する過敏症)および過痛(有害な機械的刺激に対する誇張された応答性)がまだ確立されていない。通常は無害な機械的プローブや、通常は回避行動を引き起こすプローブを用いて、ショウジョウバエ幼虫が組織損傷後に機械的過敏症(アロディニアおよび過痛の両方)を発症することを発見した。このように、ここで説明する機械的プローブとアッセイは、機械的過敏症の基本的な分子/遺伝的メカニズムを解剖するための重要なツールとなる可能性が高い。

ニチノールフィラメント(図1A,N)を用いたカスタマイズされた機械的プローブを開発し、機械的に誘発された挙動を引き出し、様々な強度の無害な機械的プローブと有害な機械的プローブの両方を使用して完全な行動線量応答曲線を生成し、これらのプローブを(損傷がない場合)機械的ノセプションの研究に使用できることを実証しました。
我々の行動アッセイ結果は、プローブが200kPa(〜1.57mN)以下の圧力を及ぼすと判断した(図1M)、ショウジョウバエ幼虫に適用すると、回避的な転がり応答を引き起こさない(図2Dおよびビデオ3)。予想通り、これらのサブ閾値または非有害性の機械的プローブ(175 kPaまたは200 kPa)は、可視神経組織損傷を引き起こさなかった(図2E)。損傷を誘発しないため、このようなプローブは、機械的なアロディニア(通常非有害性機械的刺激に対する過敏症)を評価するのに有用である可能性があります。逆に、超閾値または有害プローブ(462 kPaから5,116 kPa)は、より強い行動応答を引き出す高圧で、用量依存的な方法で拡張行動応答(図2D)を引き出した。予想通り、超閾値機械的圧はまた、末梢感覚ニューロン自体に用量依存性組織損傷を誘発した(図2E)。各群の4匹の幼虫から採取された組織損傷の測定面積(μm2±標準偏差)は、2,051.03±703.81(462 kPa)、5,102.29±1,004.67(2,283 kPa)、12,2 ±38.833333,724.11(kPa)であった。したがって、462kPa(〜63mN)以上の圧力は、回避的な圧動応答(幼虫の25%以上)を呼び起こし、目に見える神経組織損傷(図2E)を引き起こし、機械的過敏症(通常の有害な機械的刺激に対する過敏症)を研究するのに適している可能性がある。ノシシ化機械的プローブ(≥462 kPa)は、常に組織損傷を誘発する(n = 10、定性的に評価する)が、常に回避的な圧延応答を引き起こすわけではない。
機械的過敏症(アロディニアと過痛)を評価するために、紫外線(UV)照射を用いたノシセ化感作の老舗ショウジョウバエ幼虫モデルを用いて組織損傷を誘発する7,12を用いた。このアッセイは、熱性高感受性8、9、10、13、14、15の遺伝的および細胞的メカニズムを解剖するのに役立ちました。UV治療が機械的アロディニアを引き起こすかどうかを判断するために、中第3インスターコントロール(w1118)幼虫を模擬照射またはUV照射(15〜20mJ/cm2)(図3A)とした。次いで、幼虫を、通常の閾値以下の機械的プローブ(200kPa、1.57 mN)で2時間、4時間、8時間、16時間、および24時間の後処理で行動的に試験した。幼虫の約20%はUV処理後早々に2時間反応し、50%は4時間で応答し、それぞれ6.6%と8.3%の模擬UV照射動物と比較した(図3B)。これは、UV誘発組織損傷が4時間の照射後に機械的なアロディニアを引き起こすことを示している。後の時点(8時間、16時間、 24時間)UV処理された幼虫の行動応答は、16%〜20%の応答者(それぞれ10匹の幼虫の平均平均平均値n=3〜6セット)の範囲であり、モック照射対照群(応答者の3%〜6%の範囲で、各10の平均n=3-6セット)と比較してわずかに増加した(しかし統計的に有意ではない)。
機械的過痛を調べるには、超閾値圧(462kPa,3.63mN)を、幼虫の約20%で通常回避圧応答を誘導し、神経組織損傷を引き起こす(図2E)を用いた。462 kPaプローブを、UV誘発組織損傷の有無にかかわらず幼虫の後側に塗布した(図3A)。UV治療後の4時間、8時間、16時間で調査された幼虫は、回避的な圧延応答の有意な増加を示し、4時間は行動過敏症のピーク(約60%応答性)であることがわかった。模擬UV照射動物は、回避応答の〜27%を示した(図3C)。機械的な異痛症と同様に、UV処理動物の8時間、16時間、および24時間の行動応答(36%〜42%)の範囲で非治療の幼虫(20%~26%)と統計的に区別がつかない。後半の第3インスターステージの幼虫は、中間第3のインスターステージと比較してベースライン行動応答のわずかな減少を示した。これは、幼虫のサイズが大きくなったり(図2A)、または体を覆うキューティクルの厚さの増加のいずれかであると仮定します。この事実は、開発の後の段階でUV処理がより大きな機械的感作を誘発しない理由を説明することができる。
一緒に考えてみると、ショ ウジョウバエ 幼虫は、UV誘発組織損傷後に機械的多痛症と機械的過痛の両方を発症することを示している。機械的なアロディニアと過敏症のピーク時間は同じです, 4 UV治療後の時間;しかし、機械的過痛は、機械的な多痛症に比べてベースラインに戻る方がゆっくりと、より顕著な側頭尾を有する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> 図1:ショウジョウバエ幼虫の機械的発性を評価するフォン・フレイ様工具の開発(A)ショウジョウバエ幼虫の機械的切成を研究するために用いられる機械的プローブの画像。(B)ニチノールフィラメント及びそれらの相対直径は、相対的なスケールに示される。(C)ニチノールフィラメントを切断するために使用される対角線カッターの画像。(D)切り取ったニチノールフィラメントの鋭いエッジを研ぎ石でスムージングする。(E)プローブの木製ポプシクルスティックハンドルに穴を開けるために使用される皮下注射針。針の先端は、安全なフィラメント挿入のためにハンドルスティックの少なくとも半分の高さに達する必要があります。(F –G)挿入穴付きの木製のポプシクルスティックハンドルに接着することにより、ニチノールフィラメントの取り付け。(H–L)スケールに対してそれらを押すことによって機械プローブのキャリブレーション。(M)異なる機械的プローブによって生成される力の値 (mN) と圧力 (kPa で)プローブの構築に使用される各ニチノールフィラメントの長さ(P1–P10;P:プローブ)はセンチメートル(cm)で詳述されています。(N) 174 kPaから5,116 kPaまでの機械的プローブの完全なセットの画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> 図2:機械的なノシセプションアッセイ:フォン・フレイ様フィラメントは、非回転行動の用量応答曲線を生成し、感覚ニューロンに組織損傷を引き起こす。(A)ショウジョウバエ幼虫の異なる段階(第2および第3のインスター)の写真。スケールバー:2mm(B)第3の星ショウジョウバエ幼虫の後ろ図の漫画。赤い点は、機械的プローブが適用される腹部セグメントを示します。T:胸部セグメント;A:腹部セグメント。他の解剖学的ランドマークにはラベルが付いています。(C)アッセイの漫画:幼虫の裏側に機械的プローブを塗布し、下の表面に対して曲がり、2sの間保持します。圧力が十分に高い場合、これは放出時に回避的な圧延応答を引き出す。(D) 行動用量応答;各青い点は、10匹の動物のセット内の機械的刺激に対して、回避的な転がりで応答した幼虫の割合を表します。異なる機械的プローブによって誘発される回避的な転がり行動のパーセントのバイオリンプロット。kPa: キロパスカル.箱ひげは中央値(緑)、ウィスカー(赤)は10番目と90番目の百分位数を表します。(E)組織損傷:第3のインスター幼虫(樹切知覚ニューロンを標識する遺伝子型ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFPの)を、示された圧力で背部セグメントA8でプローブした。次いで蛍光標識された対のddaCクラスIV感覚ニューロン(後側の正中線を横切る)を調べ、検査した(セクション4および5を参照)。白い部分(赤いアスタリスク)は、ギャップまたは組織の損傷を表します。スケールバー:100 μm。パネルBでは、幼虫は後方ビューに示され、Cでは横のビューである。幼虫の側部のキューティクル表皮側に押し付けられた機械的プローブは、プローブの先端とその周辺領域の接触点でうつ病のようなポケットを生み出す。腹側に向かって曲線を持つ黒い直線はポケットの上面で、破線の灰色の横線はポケットの側面と底面を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> 図3:UV損傷後の機械的過敏症。(A)感作をテストする実験計画の概略。ミッドサードインスターは、模擬処理(非UV)またはUV照射した。機械的なノシセプションアッセイは、模擬処理または照射後の異なる時点(2時間、4時間、8時間、16時間、および24時間)で行った。(B)機械的なアロディニア:通常のサブスレッショルドまたは非有害な機械的刺激(200 kPa、1.57 mN)での調査後に回避的な転がりを示す幼虫の割合は、モック処理またはUV照射後の指示された時点で。(C)機械的過痛:模擬処理またはUV照射後の示された時点で、通常の超閾値または有害な機械的刺激(462 kPa、3.63 mN)で探査した後に回避圧延を示す幼虫の割合。誤差範囲は平均 +/- SEM を示 &lt; &lt;します。ns: 重要ではありません。パネル B と C の各赤い点は、10 の幼虫の平均比率を表し、n = 時間ポイント/条件ごとに 3 ~ 6 セットです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:ショウジョウバエ幼虫の正常な移動。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>
ビデオ2:ショウジョウバエ幼虫の有害な機械的刺激。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>
ビデオ3:ショウジョウバエ幼虫のサブ閾値機械的刺激。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>

このプロトコルの目的は、 ショウジョウバエ 幼虫の機械的発性の改善アッセイを実行する方法を示すものです。ここでは、ショ ウジョウバエ 幼虫に機械的過敏症(アロディニアおよび過痛)が存在することを実証するために、このアッセイを使用します。

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

このプロトコルは、遺伝的に扱いやすいショウジョウバエの幼虫の機械的侵害受容反応を正確に測定するために使用できるツールをユーザーが構築することを可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、単純な材料を使用して、サブスレッショルドから完全に応答する範囲までの機械的侵害受容を測定するために使用できるカスタムツールを構築することです。これらのツールと方法は、ベースラインの機械的侵害受容と、損傷や病気後の侵害受容感作を測定するために使用できます。カスタムフィラメントで幼虫をプローブするには練習が必要です。ユーザーは、実験を試みる前に、対照幼虫の用量反応曲線を生成できる必要があります。機械式プローブを構成するには、小さなワイヤーカッターを使用して、各ニチノールフィラメントを長軸に垂直な指定の長さに切断します。フィラメントには、3つの異なるプリセット直径があります。実体顕微鏡でフィラメントの先端を検査し、幼虫の皮膚に組織損傷を引き起こし、キャリブレーションを妨げる可能性のある鋭利なエッジや不規則なエッジが残っていないことを確認します。次に、砥石を使用して、鋭い凹凸が残らなくなるまでプローブのエッジを手動で滑らかにします。次に、皮下注射針を使用して、木製のアイスキャンディースティックの先の近くに穴を開けます。1本のニチノールフィラメントに木工用ボンドを塗布し、接着剤でコーティングされたフィラメントを針スロットに挿入します。接着剤が乾いたら、プローブが曲がるまでプローブをスケールに押し付けて、グラム単位で記録できる最大力を決定します。この式を使用して、記録された質量をミリニュートン単位の力に変換します。次に、測定した力をフィラメント先端の表面積で割って、計算された力をキロパスカルの圧力に変換します。直径と長さの異なるフィラメントを使用して複数のプローブを調製すると、ショウジョウバエの幼虫の応答範囲にわたるフルセットが生成されます。ショウジョウバエの幼虫を実験用に準備するには、幼虫の子孫を摂氏25度のインキュベーターで標準的な食品で約96時間育てます。幼虫が第3インスター期に到達したら、幼虫がテストできるように小さなペトリ皿にフライフードのプラグを準備し、鉗子を使用して、中型の中期から第3インスターの幼虫を小さい第2および初期の第3インスター、およびより大きな後期または放浪する第3インスターの幼虫から穏やかに選別します。次に、鉗子を使用して、20〜30匹の中期第3幼虫を、室温で水で湿らせたハエの餌の小さなプラグを含む小さなペトリ皿に移します。機械的侵害受容アッセイを行うには、鉗子を使用して、明視野実体顕微鏡の下の暗い薄いビニールパッドに中期3齢の幼虫を配置し、顕微鏡の対物レンズとパッドの間に光ファイバーライトを配置します。ペーパータオルを使用して幼虫を取り巻く余分な水分を拭き取り、パッドを動かして幼虫の頭と口を研究者の利き手でない手に向けます。機械的なプローブを選択し、プローブを幼虫の後背側、腹部セグメントA8で1〜2秒間適用し、プローブが曲がって以前に測定した圧力量を引き出すまで、プローブの接触点で幼虫を下部のパッドに慎重に圧縮します。肯定的な侵害受容反応は、幼虫が3秒以内に体の軸に沿って360度の完全なコルク栓抜きロールを示す場合、示されます。各幼虫の行動反応を記録します。次に、試験した幼虫を廃棄し、次の幼虫をアッセイ用に準備します。ニチノールフィラメントを使用したこれらのカスタマイズされたメカニカルプローブは、機械的に誘発される挙動を誘発し、さまざまな強度の無害な機械的プローブと有害な機械的プローブの両方を使用して完全な挙動用量反応曲線を生成するために使用できます。これらの行動アッセイの結果が示すように、200キロパスカル以下の圧力をかけるプローブは、ショウジョウバエの幼虫に嫌悪的なローリング応答を引き起こさない。予想通り、これらの閾値以下または無害な機械的プローブは、目に見えるニューロン組織の損傷を引き起こさない。逆に、スーパースレッショルドプローブまたは有害プローブは、用量依存的に末梢感覚ニューロン自体に拡張された行動応答と組織損傷を誘発します。これらのプローブは、損傷後の機械的過敏症の測定にも使用できます。幼虫の約20%は、UV処理後2時間という早い時期に嫌悪的なローリングで反応し、50%は模擬UV照射動物と比較して4時間で反応しました。この分析に使用したプローブは通常、閾値以下の200キロパスカルであったため、この応答は機械的異痛症と見なされました。後の時点で、UV処理された幼虫の行動反応はわずかに増加しますが、模擬照射された対照群の行動反応と統計的に異なることはありません。UV処理の4時間後、8時間後、および16時間後に462キロパスカルプローブでプローブされた幼虫は、刺激が最初に有害であったため、4時間が行動過敏症のピークであり、嫌悪ローリング応答の大幅な増加を示します。反応は機械的痛覚過敏であると考えられていました。プローブの調製と幼虫の選択と圧縮は、プロセスの成功に不可欠です。これらのプローブを使用すると、ベースラインの侵害受容と機械的侵害受容性過敏症を損傷後に測定できます。これらのツールとアッセイを使用して、機械的侵害受容および侵害受容過敏の分子的および遺伝的基盤を、遺伝的に扱いやすいショウジョウバエモデルで測定できます。

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Research

JoVE Journal

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