微細藻類のモデル改良のための高スループット代謝プロファイリング
December 4th, 2021
このプロトコルは、表現型マイクロアレイ(PM)技術プラットフォームを使用して、緑の微細藻類 であるクラミドモナス・レインハルトイ の代謝要件を定義し、既存の代謝ネットワークモデルを改良することを実証しています。
表現型マイクロアレイ技術は、幅広いエントリ代謝産物に応答して細胞代謝活動を機能的に決定する効果的なハイスループット法です。この技術の利用は、テトラゾリウム系酸化還元色素のNADH還元によって生成される発色量によって決定される細胞呼吸の形で測定される。本研究では、モデル種クラミドモラス・レインハルトを用いた微藻類の文脈における表現型マイクロアレイアッセイの利用について紹介する。
本研究の目的は、既存の藻類代謝ネットワークモデルの拡大や新モデルの再構築を導くために使用できる、微細藻類の代謝型のフェノタイピングを特徴付けるための信頼できる方法を確立することです。クラミドモナス・レインハルトティ菌株CC-503は、米国ミネソタ大学クラミドモラス・リソースセンターから入手できます。新鮮なトリス酢酸リン酸脂肪培地中の細胞を中ログ相に成長させます。
顕微鏡の下の細胞をチェックして、良好な状態で汚染が発生していないことを確認します。2000 Gフォースで10分間培養をスピンダウンします。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
0.1%テトラゾリウムバイオレット色素を含む新鮮なタップ培地を準備D"細菌の増殖を阻害するために、インチュンチン、アンピシリン、カナマイシンを含む異なる抗生物質を培地に加えます。脂肪培地とこのステップは、各プレートの種類に応じて、栄養素から省略する必要があります。ペレットと新鮮なタップメディアを1ミリリットル当たり100万細胞の最終濃度まで再懸濁する。
炭素源、窒素源、リン、硫黄源プレート、ペプチド窒素源などの化学化合物アレイアッセイプレートを使用します。エッセイプレートの各ウェルに自己含有媒体の十分な100マイクロリットルを接種する。アッセイを複製してください。
この段階では、細胞は、細菌汚染を監視するために、アッセイの前後にグラム陰性染色で試験されるべきであることを留意すべきである。化学化合物領域アッセイプレートをマイクロプレートリーダーシステムに挿入します。すべてのプレートを最大7日間30度でインキュベートし、15分ごとに色素の色の変化を読み取るようにマイクロプレートリーダーシステムをプログラムします。
ほとんどのマイクロプレートリーダーは、インキュベーション中に連続光の源を提供しなくてはなりませんので、藻類は、ヘテロトロピー性呼吸を行うことができるはずです。マイクロプレートリーダーから生のキネティックデータをCSVファイルとしてエクスポートし、その後、表現型マイクロアレイソフトウェアパッケージと当社のソフトウェアへの入力として使用されます。表現型マイクロアレイデータ解析を実行するには、Rソフトウェア環境内で動作するOmniLog表現型マイクロエリックOPMソフトウェアパッケージを使用します。
R studio で、R のグラフィカル ユーザー インターフェイスを使用して、原稿に詳細なコマンドを使用して OPM パッケージとその依存関係をインストールします。キネティックデータの CSV ファイルを含むディレクトリに移動し、読み取り OPM 関数を使用してデータをインポートします。キネティックデータは、pref パラメータ推定を使用して集計および分離することができます。
関数XYプロットを使用すると、呼吸または成長測定をアッセイ96ウェルプレートの時間の関数としてマッピングすることができます。このデータは、機能レベルプロットを使用してヒートマップとして視覚化され、動態データの迅速な比較概要を可能にします。次のステップは、新しい代謝産物に関連する反応と遺伝子を同定することです。
藻類の既存のモデルが存在する場合、表現型マイクロアレイシステムからのデータ解析を使用して、このモデルを改良することができます。ここでは、表現型マイクロアレイデータを用いたクラミドモナスモデルのゲノムスケール代謝ネットワーク改良に使用したパイプラインを紹介します。新しい化合物が陽性の使用率を検定すると、化合物の関連する反応プロファイルが代謝知識ベースを使用して定義され、関連する酵素手数料数が提供されます。
最初のステップは、ケッグとMetaCycを検索して、化学化合物アレイから見つかった代謝を使用した反応について、酵素手数料数であるECを同定することです。次に、同定されたEC番号を、共同ゲノム研究所、JGI、フィトゾーム、ピアレビュー出版物など、複数の利用可能な藻類注釈リソースの検索基準として使用します。反応および代謝物は、COBRAベースのクラミドモナス・reinhardtii代謝ネットワークモデルiRC1080に添加され、モデルを拡大および改良する。
EC番号を支持する遺伝子証拠が見つからない場合、NCBI位置特異的反復性、NCBI PSI-BLASTなどのプロファイルベースの検索を行い、反応に関連する候補遺伝子を同定することができる。その結果は手動で評価されます。検索 EC 番号との関連性に関して、E 値が 0.05 未満のこの QC ステップを渡した場合は、メトリック モデルに追加されます。
このプロトコルの最後のステップは、モデルの改良、モデルの評価と比較です。最新の COBRA ツールボックス バージョン 3.0 と MATLAB プラットフォームを使用して、モデルの改良の手順を実行します。コブラツールボックスをインストールした後、iRC1080モデルをダウンロードできます。
MATLAB では、まず参照モデル iRC1080 を含むフォルダに移動します。コブラツールボックス機能を使用して、関連遺伝子と同定された反応を代謝モデル(iRC1080など)に追加します。反応を追加し、遺伝子の関連を変更します。
iRC1080 モデルが含まれているディレクトリーにナビゲートし、モデルをロードするためのコマンドを実行します。名前を変更し、新しい反応とそれに関連する遺伝子を追加します。代謝産物が細胞内で産生されない場合、媒体から取り出される場合、新しい代謝産物の輸送反応は、追加/交換反応機能を使用して、代謝産物を細胞外媒体に入力または出力する必要があります。
新しい結果およびモデルの挙動をテストし、例えば、iBD1106は、フラックスバランス解析を行うことにより、FBA、光・暗条件下でのCBモデルを最適化し、バイオマスを最大限に活用する機能を利用して、その物体関数として最大限に活用する。とりわけ、FBA溶液は反応流束、代謝物の影の価格、および反応がコストを削減した3つのベクトルを出力する。ここでは、iRC1080モデルを精製版iBD1106と比較する例を提供し、各モデルで占める変化及び代謝物に対するバイオマス目的関数の感度を表す影価格を求める。
ここでは、炭素源と窒素源の呼吸XYプロットと窒素源アッセイプレートの呼吸を示し、それぞれティールカラーと紫でCC-503を測定します。各井戸内では、呼吸曲線は時間の関数としての減少による染料変換を表します。パネルAでハイライトされたピークは、クラミドメナス文献と一致するこのプレートからの唯一の炭素源としてのアセテートの検出を表す。
3つの異なる方法を使用して同定された代謝産物の数の比較は、よくキュレーションされたクラミドミナ代謝モデルであるiRC1080、GC-TOF飛行のガスクロマトグラフィー時間、および表現型マイクロアレイエッセイでは、3つのセット間で6つの代謝産物だけが重複し、149はiRC1080とpheno型マイクロタイプの間で共通であった。これは、各技術が代謝プロファイリング研究に向けて強みを持っている一方で、表現型マイクロアレイアッセイセットが新しい代謝情報の重要な源となり得ことを示しています。得られた情報を、代謝ネットワークモデルiRC1080を拡大・改良するために用いた。
ここでは、iRC1080モデルの含有量と拡大モデルiBD1106を比較し、反応数、代謝物の数、遺伝子数を含む。我々は、我々のモデルの精製が新しい結果のネットワークに254以上の反応を加えることを示す。これらの反応は、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドおよび輸送反応に分類される。
新たに同定された代謝産物は、既存のクラミドマナス・reinhardtii代謝モデルの代謝ネットワーク拡張および精製に使用された。この表現型マイクロアレイアッセイは、既存および新規に単離された株の代謝表現型を特徴付けるために使用できます。さらに、微細藻類の文脈で使用したプロトコルは、他の種の代謝モデルの改良を導くことができます。
概要
この研究では、緑色微細藻であるモデル生物であるChlamydomonas reinhardtiiの代謝要件を評価するために表現型マイクロアレイ技術を採用しています。この調査は、微細藻の代謝フェノタイピングを特徴づけることで、既存の代謝ネットワークモデルを改善することを目的としています。
主要な研究構成要素
研究分野
- 代謝プロファイリング
- 微細藻の生理学
- モデルネットワークの改良
背景
- Chlamydomonas reinhardtiiの生物学的研究における重要性
- 高スループット法としての表現型マイクロアレイ技術
- 藻類生物学における代謝ネットワークの応用
使用された方法
- 表現型マイクロアレイアッセイ
- モデル生物としてのChlamydomonas reinhardtii
- データ収集のためのレドックス染料とマイクロプレートリーダーの使用
主要な結果
- 様々な入力代謝物に対する代謝反応を特徴づけました
- Chlamydomonas reinhardtiiの代謝モデルを改良しました
- 新しい反応と関連する酵素プロファイルを特定しました
結論
- このプロトコルは、微細藻の代謝ネットワーク改良のための体系的なアプローチを提供します。
- この調査結果は、藻類生物学における代謝モデリングの進歩に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput metabolic profiling using phenotype microarray technology enables rapid refinement of genome-scale metabolic models for microalgae, addressing gaps in genomic annotation with functional biochemical evidence. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early-stage discovery by providing quantitative phenotypic data that improves model predictive confidence. The methodology is directly applicable to biopharma R&D workflows focused on algal-based bioproduction systems and metabolic engineering initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of metabolic hypotheses by linking metabolite utilization to specific reactions and genes.
- Operational Value: Provides high-throughput phenotypic data to de-risk target selection in algal metabolic engineering.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in pathway validation through experimental evidence for over 254 reactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative respiration-based readouts across diverse metabolite arrays to assess metabolic capabilities.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using NADH-dependent tetrazolium dye reduction for reproducible metabolic phenotyping.
- Strategic Value: Creates scalable, reusable platforms for screening algal strains under defined chemical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges genomic predictions with functional metabolic activity to improve model-to-phenotype translation.
- Operational Value: Enables iterative model refinement using phenotype microarray data to enhance predictive accuracy.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by identifying metabolic bottlenecks and auxotrophies in engineered strains.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional data that informs metabolic model reconstruction, guiding strain optimization and pathway validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating metabolite utilization with specific enzymatic reactions and gene associations.
- Screening: Delivers standardized, quantitative phenotypic outputs for assessing metabolic fitness across compound libraries.
- Analytics: Generates kinetic data suitable for flux balance analysis and shadow price calculations to identify metabolic sensitivities.
- Translational Research: Enhances model-to-phenotype continuity by incorporating experimental evidence into constraint-based models.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable protocol for metabolic profiling applicable to diverse microalgal species and mutants.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic models by expanding iRC1080 with over 254 experimentally supported reactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized inoculation, incubation, and kinetic reading protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing metabolic capabilities that inform strain suitability for bioproduction.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of engineering targets based on validated metabolic network expansions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, metabolic modeling, and bioinformatics for EC number annotation and model integration.
- Dependent on microplate reader systems capable of kinetic absorbance measurements and anaerobic incubation compatibility.
- Necessitates cross-team standardization between wet-lab phenotyping and computational modeling groups.
- Involves adaptation considerations for varying algal species due to differences in cell wall permeability and metabolite uptake.
- Limited by the requirement for heterotrophic respiration capability during assay incubation in the absence of continuous light.
