光遺伝学的実験のための簡便で汎用性の高い照明システムの構築
2021年1月12日
このプロトコルは、PhyBおよびPIF3を使用して赤色および遠赤色光で遺伝子発現を制御するための光遺伝学的実験を実行する方法について説明しています。コンピュータで遺伝子発現やその他の光遺伝学の制御を可能にするシンプルで柔軟な照明システムを構築するためのステップバイステップの説明が含まれています。
このシステムにより、研究者は光遺伝学的実験用の安価で汎用性の高い照明システムを簡単に構築できます。この技術の利点には、可視近赤外スペクトルにまたがる利用可能な波長でLED照明タイミングをプログラムできること、およびLEDをさまざまな状況で使用できることが含まれます電気回路を構築するには、プリント回路基板を補助の手にクリップし、ジャンパー線を挿入し、それらを接続してA1およびA3ピンホールをアースに形成します。 D2ジャンパー線をD6ピンホールに接続し、電源と7番のジャンパー線をA7ピンホールに接続します。端子を45度曲げて、磁束を追加します。
はんだ付け後、ワイヤーの裏側をトリミングします。はんだ付けされたメス線の一方の端をワイヤコネクタにA5穴に挿入します。次に、抵抗器の一端をA5穴に接続します。
コネクタのもう一方の端をアースに接続します。次に、抵抗器のもう一方の端をグランドに接続し、接続をはんだ付けします。Arduinoコネクタの場合は、ワイヤの端をワイヤコネクタに圧着し、圧着された端を長方形のコネクタに押し込みます。
LEDを設定するには、上からはんだを加えながら、下から加熱してワイヤーを錫メッキします。大きなはんだ付けチップの上にたっぷりのはんだを置き、チップを使用してフラックスを含む接点のLEDベースを加熱します。数秒後、各接点にはんだを個別にドラッグし、ヘアクリップを使用して黒いワイヤーをカソードに固定します。
大きなはんだ付けチップにたっぷりのはんだを置き、LEDベースのはんだが溶けるまでチップをワイヤーに押し付けます。ワイヤーを所定の位置に保持しながら、ワイヤーを押したままはんだごてを取り外します。LED接続用のパッドに少量のはんだペーストを置き、鉗子を使用してLEDをパッドの上に置きます。
事前に錫メッキされた赤いワイヤーをアノードに保持し、ヘアクリップを使用してワイヤーをクリップします。示されているように大きな先端にはんだを追加し、LEDベースのはんだが溶けてはんだペーストが溶けて銀色になるまで、先端を接続に押し付けます。LEDワイヤーを作成するには、長さにカットされたワイヤーの上に4.76ミリメートルのシュリンクチューブを配置し、ワイヤー対ワイヤコネクタの上に3.18ミリメートルのシュリンクチューブを配置します。
ワイヤの端を剥がしてフラックスを追加します。助け手を使ってワイヤをワイヤにクリップし、コネクタの端を1本のワイヤの端でねじります。材料をはんだ付けし、もう一方のワイヤを同じ方法でセットアップに取り付けてはんだ付けします。
次に、LEDベースの下にテープでLEDワイヤーを補助手にクリップします。次に、製造元の指示に従ってエポキシを混合し、はんだ付けされたLEDの上部にエポキシを広げます。スペードドリルビットを使用して、LEDを配置するボックスの上部に1.5センチメートルの穴を開け、高速回転ツールを使用して穴の片側にノッチを作り、LEDワイヤー用のスペースを作ります。
LEDが照らす穴を覆うブラックボックスに25〜30ミリメートルのプライバシーフィルムをテープで留め、ブラックボックスの外側のLEDを穴の上にテープで留めます。4つのLED制御システムの場合、ボックスの蓋に3.81センチメートル離して0.83センチメートルの穴を4つ開け、高速回転ツールを使用して、左上隅に1.19 x 1.90センチメートルの長方形の穴を開けます。スペードドリルビットを使用して、ボックスの背面に1.5センチメートルの穴を開け、グロメットを穴に挿入します。
コンピュータ制御のLEDの場合、ボックス内のマイクロコントローラが接着される領域とマイクロコントローラホルダの底面をサンドペーパーで表します。マイクロコントローラをホルダにスナップし、ホルダとボックスを一緒にエポキシ化してから、ホルダをブラックボックスに固定します。次に、クリップに両面テープを置き、クリップをボックス内に固定します。
フィコシアニンビリンを発現するがフィコシアニンBを発現しないようにトランスフェクトされたサンプルでは、レポーターDNAの量が増えるにつれて漏れが増加します。さらに、フィコシアニンビリンクロモファー産生プラスミドを含むフィトクロムB遺伝子スイッチ全体を遠赤色光で照射すると、トランスフェクションミックス内のレポーター構築物の量の増加とともにルシフェラーゼ発現も増加します。同様に、光感受性細胞が赤色光で照らされると、ルシフェラーゼ発現もレポーター量の増加とともに増加する。
赤色光処理細胞の誘導レベルを遠赤色光処理細胞と比較すると、レポーターの量の増加に伴ってフォールド活性化のわずかな減少が見出される。電気回路を構築するときは、各ステップを注意深く実行し、各コンポーネントをはんだ付けする前に、ピンホール番号を行ごとに再確認することが不可欠です。このプロトコルは、さまざまな波長を使用した多くの種類のサンプルまたは光遺伝学的ツールの光刺激に使用でき、照明スケジュールのプログラミングを可能にします。
概要
このプロトコルは、オプトジェネティクス実験のための多目的照明システムの構築を説明し、赤色および遠赤色光で遺伝子発現を制御することを可能にします。システムの構築とLED照明のプログラミングの段階的な説明が提供されます。
主要な研究要素
科学の分野
- オプトジェネティクス
- 遺伝子発現制御
- 照明システム
背景
- オプトジェネティクスは、光を使用して細胞機能を正確に制御することを可能にします。
- PhyBとPIF3は、光応答性遺伝子調節の重要な要素です。
- LEDは様々な照明スケジュールでプログラムできます。
- このシステムは、異なる実験設定に適応できるよう、コスト効果の高いものとして設計されています。
研究の目的
- オプトジェネティクス照明システムを構築するための詳細なプロトコルを提供すること。
- 特定の波長の光を使用して遺伝子発現を制御できるように研究者に提供すること。
- 多様な実験的文脈でオプトジェネティクスツールの使用を促進すること。
使用された方法
- LED制御のための電気回路の構築。
- LED照明のタイミングと波長のプログラミング。
- 自動制御のためのマイクロコントローラーの組み立て。
- 様々なレポーター構築を用いたシステムのテスト。
主な結果
- 柔軟な照明システムの成功的な構築。
- レポーターDNA量の増加に伴うルシフェラーゼ発現の増加。
- 赤色および遠赤色光を用いた遺伝子発現の制御の証明。
- システムは異なるサンプルタイプにわたる光学的刺激を可能にします。
結論
- このプロトコルは、オプトジェネティクス実験のための信頼性の高い方法を提供します。
- 研究者は、遺伝子調節の様々な応用にこのシステムを利用できます。
- プロトコルを注意深く守ることで、成功的な結果を確保できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
