マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化
2021年4月14日
本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。
本研究は、マイクロ流体系における直流パルス刺激によってのみ誘導される神経前駆細胞の分化に関するプロトコルを提示する。この手法は、実験の段取り時間、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。さらに、MOEチップは共焦点顕微鏡観察に適しています。
単純な直流パルス治療は、マウス神経前駆細胞の運命を制御することができ、神経系障害の治療戦略を開発するために使用することができます。まず、個々の PMMA 層と、適切なソフトウェアを使用して両面テープのパターンを描画します。炭酸ガスレーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。
ソフトウェアを使用して、設計されたパターンファイルを開きます。レーザースクリバーのプラットフォーム上にPMMAシートまたは両面テープを置き、オートフォーカスツールを使用してPMMAシートまたは両面テープの表面にレーザーを焦点を合わせます。レーザースクリバをプリンタとして選択し、レーザースクリバを使用してPMMAシートまたは両面テープで直接アブレーションを開始します。
PMMAシートから保護フィルムを取り出し、窒素ガスを使用して表面を洗浄します。PMMAシートの複数の層を結合するには、1ミリメートルPMMAシートの3枚を積み重ね、110°Cで30分間熱ボンダーで平方センチメートル当たり5キログラムの圧力で結合し、流れまたは電気刺激チャネルアセンブリを形成します。高速作用シアノアクリル接着剤とMOEチップアセンブリの層1の個々の開口部に12個のアダプタを付着させます。
チップを組み立てる前に、1ミリメートルPMMA基板、両面テープ、3ミリ光学グレードPMMAを30分間紫外線照射で消毒します。3ミリメートル光学グレードPMMAに1ミリメートルのPMMA基板を両面テープで貼り付け、PMMAアセンブリを完成させます。洗浄したカバーグラスを、両面テープでPMMAアセンブリに貼り付けます。
寒天ブリッジアダプターの開口部を白い指密プラグでシールします。フラットボトムコネクタを中型の入口アダプタとコンセントアダプタを介してMOEチップアセンブリに接続し、コーンLuerアダプタを3ウェイストップコックに接続します。0.01%PLL溶液の2ミリリットルを培地入口の3ウェイストップコックに接続する3ミリリットルのシリンジを使用して追加し、空の3ミリリットルのシリンジを媒体出口の3ウェイストップコックに接続します。
PLL溶液で細胞培養領域を充填し、ゆっくりとコーティング溶液を前後にポンピングします。2つの三方ストップコックを閉じて、培養地域内の溶液を密封します。5%の二酸化炭素雰囲気で満たされたインキュベーターで一晩摂氏37度でMOEチップをインキュベートします。
2つの三方向ストップコックを開き、2つの注射器を使用してチャネル内でコーティング溶液を前後に手動でポンピングすることで、チャネル内の気泡を洗い流します。完全な培地を3ミリリットルのシリンジに3ミリリットル引き込み、培地入口の3ウェイストップコックに接続し、それを加えて細胞培養領域のコーティング溶液を交換します。白い指密プラグをLuerアダプタに交換し、3%ホットアガロースを注入してアダプタを充填します。
LuerロックシリンジをLuerアダプタに接続し、黒いゴムボンを通して3%のホットアガロースを注入してLuerロックシリンジを充填します。アガロースが冷めて固めるのに10~20分かかります。セルシードのMOEチップを、摂氏37度に維持されたプログラム可能なXYZ電動ステージに取り付けられている透明なITOヒーターに取り付けます。
MNPCを手動で媒体出口を介してMOEチップに送り込み、ITOヒーターのセルシードMOEチップを4時間インキュベートします。電線を使用して、EF マルチプレクサをチップの電極を介して MOE チップに接続します。EF マルチプレクサとファンクション ジェネレータをアンプに接続して、直角波 DC パルスを出力します。
MOEチップのフラットボトムコネクタとアダプタをすべて取り外し、アダプタにPBSを充填し、アダプタの開口部をパラフィルムで密封します。免疫染色後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する。DCパルス刺激により、幹細胞維持培地中のニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに同時に分化するmNPCが生まれた。
コントロール群および刺激群におけるニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの割合をここに示す。DCパルス処理後、mNpcはDIV 7で有意に高い数のニューロン、DIV 3でアストロサイト、DIV 7とDIV 14のオリゴデンドロサイトが対照群よりも刺激群において比較的高いレベルで存在した。30〜40細胞によって形成される神経球は、mNPC分化を開始するために好ましい。
mNPCの過剰増殖は分化プロセス中の細胞生存を損なう。
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概要
本研究では、マイクロ流体システムにおける直流パルス刺激によって誘導される神経前駆細胞の分化プロトコルを提示します。この手法は、実験のセットアップ時間、サンプル量、および試薬量を削減できるため、研究への応用において効率的です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- マイクロフルイディクス
背景
- 神経前駆細胞（NPCs）は、神経発達を理解する上で極めて重要です。
- 直流パルス刺激は、細胞の運命に影響を与える可能性があります。
- マイクロ流体システムにより、実験条件の精密な制御が可能になります。
- このアプローチは、神経系疾患の治療法開発に寄与すると考えられます。
研究の目的
- NPC分化のための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- 細胞運命を制御する方法として直流刺激を利用すること。
- 神経科学研究におけるマイクロ流体システムの有効性を実証すること。
使用した手法
- PMMA層および両面テープのパターン設計。
- 二酸化炭素レーザースクライバーを用いた作製。
- NPCsに対する直流パルス刺激の実施。
- 解析のための共焦点顕微鏡観察の実施。
主な結果
- 提案したプロトコルを用いたNPCの分化の成功。
- 実験セットアップ時間およびリソース使用量の削減。
- 顕微鏡観察におけるMOEチップ使用の実現可能性。
- 神経系疾患の治療戦略への応用の可能性。
結論
- 本プロトコルは、NPC分化のための効率的なアプローチを提供します。
- 直流刺激は、細胞運命の制御に有効です。
- マイクロ流体システムは、神経科学における実験効率を向上させます。
よくある質問
産業界における重要性
このマイクロ流体プラットフォームは、直流パルス刺激を用いることで神経前駆細胞の分化を精密に制御することを可能にし、神経変性疾患研究におけるターゲットバリデーションのための、拡張性とリソース効率に優れたモデルを提供します。実験の複雑さと試薬消費量を削減することで、初期段階におけるメカニズムのデリスキング（リスク低減）と、細胞運命調節戦略における予測信頼性をサポートします。本システムは長期刺激および自動イメージングとの互換性を備えており、神経系治療薬に焦点を当てた創薬ワークフローへの統合に適しています。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 電気的信号が神経前駆細胞の運命決定の調節因子であるかを検証することを可能にし、神経発達経路における標的仮説の検証を支援します。
- 運用の価値： マイクロ流体による封じ込めを通じてサンプル量と試薬量を削減し、初期の標的スクリーニングキャンペーンにおけるコストを低減します。
- 予測的価値： 神経細胞、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトへの分化に関する定量的なリードアウトを提供し、調節標的に対するデータに基づいたGO/NO-GO判断を可能にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：制御された電場パラメータの下で、標準化され再現性のある分化アウトプットを生成し、アッセイの最適化に適しています。
- 運用上の価値：チャネルベースの設計により、マルチプレックスな条件試験を容易にし、化合物や刺激の評価におけるスループットを向上させます。
- アッセイへの適用性：長期培養とタイムラプスイメージングをサポートし、アッセイ検証のための分化ダイナミクスのキネティックプロファイリングを可能にします。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 翻訳の連続性： 定義された微小環境でマウス神経前駆細胞を使用することで、in vivo の神経分化プロセスへの関連性を高めています。
- 前臨床モデリング： 共通の前駆細胞からグリア系およびニューロン系への分化を促進し、神経系疾患のモデリングに有用です。
- リスク調整後の前進： 刺激下での分化バイアスの評価を可能にし、メカニズムに基づく安全性および有効性のプロファイリングに寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、特に細胞運命決定因子のメカニズム的理解が極めて重要となるターゲットバリデーションおよびリード同定段階などの、初期創薬のプロセスに適合します。また、電気的または薬理学的モジュレーターの生物学的活性を評価するための、制御可能で定量化可能なシステムを提供することで、スクリーニングキャンペーンを支援します。本プラットフォームの出力である系統特異的な分化指標は、神経修復メカニズムにおける予測信頼性の高いターゲットを優先順位付けするために使用される解析パイプラインに組み込まれます。
- 探索生物学：神経前駆細胞におけるバイオエレクトリック・シグナリング経路の仮説検証をサポートし、ターゲットとなるメカニズムの曖昧さを低減します。
- スクリーニング：規定の電気刺激下での再現可能かつ定量的な分化アッセイを可能にし、アッセイの信頼性を向上させます。
- 分析：条件間の比較分析に向けた測定可能なエンドポイント（例：% neurons, astrocytes, oligodendrocytes）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：神経系疾患に関連する分化ダイナミクスをモデル化し、前臨床段階の連続性をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数の実験条件にわたる繰り返し使用を想定して設計されており、標準化とプロジェクト間の整合性を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞運命決定における規定変数として電気刺激を単離することで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：マイクロ流体デバイスの精度により分化プロトコルを標準化し、施設間およびチーム間での再現性を向上させる。
- 戦略的価値：系統決定に関する早期のメカニズム的なリードアウトを提供することで、go/no-go判断を加速させ、後期段階での失敗リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：神経分化を調節するターゲットのリスク調整後の優先順位付けを可能にし、神経科学ポートフォリオにおける資本効率を向上させる。
実施上の考慮事項
- マイクロ流体デバイスの組み立て、電気生理学、および神経幹細胞培養に関する専門知識が必要です。
- レーザー加工装置、ITOヒーター、EFマルチプレクサ、および倒立顕微鏡システムの利用が前提となります。
- 再現性のある結果を得るためには、実験全体を通じて電気的パラメータ（パルス幅、周波数、振幅）の標準化が必要です。
- ヒト由来神経前駆細胞に適用する場合、刺激パラメータおよび培養条件の最適化が必要になる場合があります。
- 慢性刺激研究における電極の長期的な安定性とバイオファウリングは、考慮すべき実用上の制限となります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
