Name: マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた神経前駆細胞の電界誘発分化法。直流パルス刺激で細胞運命を制御し、神経系疾患治療戦略の開発に応用可能な効率的な実験プロトコルを解説します。

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著者らは、シンニカ医教アカデミー生物医学研究所の唐K.唐教授に対し、マウス神経幹細胞および前駆細胞(mNPC)の提供に協力してくれたことに感謝している。著者らはまた、mNCCの差別化に関する貴重な議論をした唐K.唐教授とインシャン・リー氏に感謝する。

1. MOEチップの設計と製作
<ol><li>適切なソフトウェアを使用して、個々のポリメチルメタクリレート(PMMA)層と両面テープのパターンを描画します(図1A、材料表)。PMMAシートと両面テープの両方をCO2レーザーマシンスクライバで切ります(図1B)。<ol>
<li>CO2レーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。ソフトウェアを使用して、設計されたパターンファイルを開きます。</li>
		<li>レーザースクライバのプラットフォーム上にPMMAシート(275mm x 400 mm)または両面テープ(210mm x 297 mm)を置きます(図2A)。オートフォーカスツールを使用して、レーザーをPMMAシートまたは両面テープの表面に焦点を合わせます。</li>
		<li>レーザースクリバをプリンタとして選択し、レーザースクリバを使用してPMMAシートまたは両面テープ上で直接切り捨てを開始し、PMMAシートまたはテープ上の個々のパターンを取得するパターンを「印刷」します(図2B)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMMAシートから保護フィルムを取り出し、窒素ガスを使用して表面を洗浄します。 注:PMMAパターンの描画とPMMAシートの直接加工は、前のレポート17に従って行われました。</li>
	<li>PMMAシートの複数の層を結合する場合は、1mm PMMAシート(層1、2、および3)の3枚を積み重ね、110°Cで30分間熱ボンダーで5kg/cm2の圧力で結合し、流れ/電気刺激チャネルアセンブリを形成する(図2C)。 注:市販のPMMAシートの異なるバッチは、わずかに異なるガラス転移温度(Tg)を有する。最適なボンディング温度は、Tgに近い5°Cの増分でテストする必要があります。</li>
	<li>MOEチップアセンブリのレイヤ1の個々の開口部に、高速作用のシアノアクリレート接着剤で12個のアダプタを貼付します。 注: アダプターは射出成形によって PMMA で作られています。底面の平らな面はMOEチップに接続するための。1/4W-28メスねじねじを持つアダプターは、白い指密栓、平底コネクタ、またはLuerアダプタを接続するためのものです。速効性シアノアクリル酸接着剤を使用する場合は注意してください。目に飛び散らないように。</li>
	<li>チップを組み立てる前に30分間紫外線(UV)照射を用いて、1mmPMMA基板(層1~3)、両面テープ(層4)、3mm光学グレードPMMA(UV)照射を用いて消毒する(図1A)。</li>
	<li>3 mm の光学グレード PMMA (レイヤー 5) に 1 mm の PMMA 基板 (レイヤ 1~3) を両面テープ (レイヤ 4) に付着して PMMA アセンブリを完成させます (図1A)。</li>
	<li>チップのアセンブリ用に清潔なカバーガラスを用意します。<ol>
<li>汚れた瓶に洗剤の10倍の希釈を充填し( 材料のテーブルを参照)、15分間超音波洗浄機を使用して、この洗剤のカバーガラスをきれいにします。</li>
		<li>水道水の下で染色瓶を十分に洗い流し、洗剤の痕跡をすべて取り除きます。</li>
		<li>蒸留水ですすい続け、水道水の痕跡をすべて取り除き、ステップ1.7.2を2回繰り返します。</li>
		<li>洗浄したカバーガラスを窒素ガスで吹き付けて乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMMAアセンブリ(層1~5)、両面テープ(層6)、およびカバーガラス(レイヤ7)をバイオセーフティキャビネット内で30分間UV照射して、チップを組み立てる前に消毒する(図1A)。</li>
	<li>洗浄されたカバーガラス(レイヤ7)を、両面テープ(レイヤ6)でPMMAアセンブリ(レイヤ1~5)に貼り付けます(図1A)。</li>
	<li>MOEチップを真空チャンバーに一晩インキュベートします。後の手順には MOE チップ アセンブリを使用します (図 3)。</li>
</ol>2. 細胞培養領域の基質にポリL-リジン(PLL)をコーティング
<ol><li>ポリテトラフルオロエチレンチューブ、フラットボトムコネクタ、コーンコネクタ、コーンルエルアダプタ、白指密プラグ(ストッパーとも呼ばれる)、ルアーアダプタ、ルアーロックシリンジ、ブラックラバーバン(図4A、材料表)を準備します。121°Cでオートクレーブ内の上記のコンポーネントをすべて30分間殺菌します。</li>
	<li>寒天ブリッジアダプター(図1A)の開口部を白い指密プラグでシールします。フラットボトムコネクタを、中型の入口アダプタとコンセントアダプタを介してMOEチップアセンブリに接続します(図4B)。コーン-ルアーアダプターを3ウェイストップコックに接続します。</li>
	<li>0.01% PLL溶液の2 mLを加え、3 mLのシリンジを使用して、媒体の入口の3方向のストップコックに接続します(図4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> )。</li>
	<li>空の3 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> )。</li>
	<li>PLL溶液で細胞培養領域を充填します。手動でコーティング溶液をゆっくりと前後にポンプで送ります。2つの三方ストップコックを閉じて、培養地域内の溶液を密封します。</li>
	<li>MOEチップを5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターで一晩37°Cでインキュベートします。</li>
</ol>3. 塩橋網の整備
<ol><li>ステップ2.6に続いて、2つの3ウェイストップコックを開き、2つのスポイジを使用してチャネル内でコーティング溶液を前後に手動でポンピングすることによって、チャネル内の気泡を洗い流します。</li>
	<li>完全な培地(ダルベックの修飾イーグルの培地/ハムの栄養素混合物F-12(DMEM/ F12)からなる幹細胞維持培地)の3 mLを、2%B-27サプリメント、20 ng/mL EGF、および20 ng/mL bFGFを3mLのシンジに引き込み、中型図4B(4B)の3ウェイストップコックに接続する。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;"></li>
	<li>完全培地の3 mLを加えて、細胞培養領域のコーティング溶液を交換します。空の5 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B- <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;"> )。</li>
	<li>ソルトブリッジネットワークを準備します(図5)。<ol>
<li>黒いゴムバンを切ってギャップを作り出し、銀(Ag)/塩化銀(AgCl)電極を黒いゴム製のバンを通してルアーロックシリンジに挿入します(図4A)。</li>
		<li>白い指密プラグをLuerアダプタに交換し、3%の熱いアガロースを注入してLuerアダプタを充填します。 注:熱いアガロースの調製のために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の100 mLにアガロース粉末の3gを溶解し、30分間121°Cでオートクレーブで殺菌します。</li>
		<li>ルアーロックシリンジをLuerアダプタに接続します。黒いゴム製のバンを通して3%の熱いアガロースを注入し、注射器を針で使用してルアーロックシリンジを充填します。アガロースが冷めて固めるのに10〜20分を許します。 メモ: アガロースのボリューム容量を増やすために、Luerロックシリンジは Luer アダプタに取り付けられています(図 4 および 図 5)。次いで、大きな電極をルアーロックシリンジに挿入する。電極は、長期実験に安定した電気刺激を提供することができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mNPCの準備
<ol><li>mNPC1を完全培地で37°Cで25T細胞培養フラスコで培養し、5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターに培養する。細胞を3〜4日ごとにサブ培養し、元のソースから3〜8回の通過を受けた細胞を用いて全ての実験を行う。</li>
	<li>細胞懸濁液を15 mL円錐状チューブに移し、5分間100×gで神経球をスピンダウンします。上清を吸引し、1xダルベッコのPBS(DPBS)で神経球を洗う。神経球を100×gで5分間スピンダウンします。</li>
	<li>1x DPBSを吸引し、その後、完全な培地中の神経球を再中断します。よくやさしく混ぜます。</li>
	<li>出口の3方向の停止コックに接続する1 mLのシリンジを使用して、神経圏懸濁液の1 mLを加える(図4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> )。</li>
</ol>DCパルス刺激用マイクロ流体システムのセットアップ (図6)
<ol><li>プログラム可能な X-Y-Z の電動ステージに取り付けられている透明な ITO ヒーターにセルシード MOE チップを取り付けます。 メモ:ITO表面温度は、比例積分誘導制御装置によって制御され、37°Cに維持されます。 K型熱電対は、チップとITOヒーターの間にクランプされ、チップ内の細胞培養領域の温度を監視します。MOEチップはプログラム可能なX-Y-Zのモーター化された段階で取付けられ、個々のチャネルセクションの自動タイムラプス画像獲得のために適している。ITOヒーターの製造と細胞培養加熱システムの設定については、前に18,19を説明した。</li>
	<li>MNPCを、媒体出口を介してMOEチップに手動でポンピングして注入します。セルシードの MOE チップを 37 °C ITO ヒーターに 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>4時間経過後、シリンジポンプを使用して、20 μL/hの流量で媒体入口を介してMOEチップを介して完全な媒体をポンプします。 注: mNPC は、細胞の取り付けと増殖を可能にする EF 刺激の前に、さらに 24 時間、チップ内で成長および維持されます。廃液は、出口の3方向停止コックに接続された空の5mLシリンジに集め、 図6Aの「廃棄物」として示す。MOE マイクロ流体システム構成を 図 6に示します。このマイクロ流体システムは、細胞に栄養の連続的な供給を提供します。完全な新鮮な媒体は連続的に一定のpH値を維持するためにMOEチップにポンプで送られます。したがって、細胞はCO2 インキュベーターの外側で培養することができる。</li>
	<li>電線を使用して、EF マルチプレクサをチップの Ag/AgCl 電極を介して MOE チップに接続します。EF マルチプレクサとファンクション ジェネレータをアンプに接続して、50% デューティ サイクルで 100 Hz の周波数で 300 mV/mm の大波 DC パルスを出力します (50% タイムオンと 50% のタイムアウト) (図 6B)。<ol>
<li>電線をEFマルチプレクサに接続します。Ag/AgCl電極を介して電気線をMOEチップに接続します。</li>
		<li>EF マルチプレクサを電気線でアンプに接続します。ファンクション・ジェネレータをアンプとデジタル・オシロスコープに接続します。 メモ:EFマルチプレクサは、回路内の培養チャンバのインピーダンスを含み、並列電子ネットワーク内のすべての個々のチャンバーを接続する回路です。3つの培養チャンバのそれぞれは、マルチプレクサ内の可変抵抗(Vr)とアンメクタ(図6AでμAとして示す)に直列で電気的に接続されています。各培養チャンバーを通る電流はVrを制御することによって変化し、電流は対応する電流計に示される。各細胞培養領域の電界強度はオームの法則によって計算され、I=σEAは電流、σ(DMEM/F122用1.38S・m-1に設定)は、培養媒体の電気伝導率、Eは電界、Aは電気戦術室の断面積である。図1に示す細胞培養領域寸法の場合、電流は、DCおよびDCパルスの場合、それぞれ50%デューティサイクルで〜87mA、〜44mAである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>mNPC を 48h の 100 Hz の周波数で 300 mV/mm のマグニチュードで正方形 DC パルスにします。完全な培地を10 μL/hの速度で連続的にポンプで送り、細胞に十分な栄養を供給し、培地中で一定のpH値を維持します。</li>
</ol>6. パルスDC刺激後のmNPCの免疫蛍光アッセイ
注:このステップでは、すべての試薬は、注射器ポンプを使用して媒体の入口を介してポンプされます。
<ol><li>1を播種した後、3、7、または14日間のインビトロ(DIV)培養後、25μL/minの流量で細胞を20分間洗浄します。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。20分間、25 μL/minの流量で4%PFAをチップに送り込み、1x PBSを交換します。4%のPFAを交換するには、25μL/minの流量で20分間、細胞を1x PBSで洗浄します。</li>
	<li>0.1%トリトンX-100を50μL/minの流量でチップに送り込み、細胞を透過させます。さらに30分間細胞と反応するために流量を50 μL/hに減らします。0.1%トリトンX-100を交換するには、50μL/minの流量で1x PBSで細胞を6分間洗浄します。</li>
	<li>1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで細胞をブロックし、非特異的抗体結合を低減する。50 μL/min の流量で 1% BSA をチップに 6 分間ポンプで送ります。流量を100μL/hに下げ、ポンプを1時間下げます。</li>
	<li>2重免疫染色用の抗体を50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送り込み、4°Cで18時間インキュベートします。 50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。</li>
	<li>Alexa Fluor結合二次抗体を、50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送ります。流量を50μL/hに下げ、暗い温度で1時間抗体をポンプで送ります。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。</li>
	<li>核染色の場合、Hoechst 33342を20 μL/minの流量で、暗闇の中で室温で10分間チップに送り込みます。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。</li>
	<li>免疫染色後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する。</li>
</ol>7. 画像解析とデータ処理
<ol><li>測定ツールを内蔵したソフトウェアを使用して蛍光画像を分析します( 材料表を参照)。</li>
	<li>コントロール群と治療群におけるHoechstカウンタード核(細胞の総数)を比較し、各表現型マーカーを発現する細胞の割合を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+DC+electric+field-induced+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).</li>
<li>Li, S., Li, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+spiral+ganglion+neurite+extension+in+electrical+fields+of+charge-balanced+biphasic+pulses+and+direct+current+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro.</a> Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).</li>
<li>Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+neurite+growth+in+a+weak+DC+electric+field+depends+on+the+substratum%3A+contributions+of+adhesivity+and+net+surface+charge%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge.</a> Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proliferation+and+differentiation+in+neural+precursor+cells+by+the+Jak+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway.</a> Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).</li>
<li>Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directs+migration%2C+enhances+and+orients+cell+division+and+upregulates+the+chemokine+receptors+CXCR4+and+CXCR2+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).</li>
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<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).</li>
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<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

MOEチップの製造中、アダプターは高速作用性シアノアクリレート接着剤でMOEチップのレイヤ1に取り付けられます。接着剤は、アダプターの4つのコーナーに適用され、その後、圧力は、アダプターの上に均等に適用されます。接着剤の完全な重合を確実にするために接着剤の過剰な量を避ける必要があります。さらに、完成したMOEチップアセンブリは真空チャンバ内でインキュベートされます。このステップはPMMA層、両面テープおよびカバーガラス間の気泡を取り除くのに役立つ。
電極材料の選択は、培地中に豊富に存在する塩化物イオンが細胞培養領域を流れる電解物であるという事実に基づいている。EF刺激実験の間、電極の周囲のpHは一定のままでした。電極材料として白金(Pt)を用いたより簡単な構成は、水を電解し、正極と負極で水素イオン(H+)および水酸化物イオン(OH-)を生成し、それぞれ培養領域におけるpH変化を誘発する。Pt電極の使用を避けることは、EF刺激実験中のpH変化の問題を回避する。
塩橋網の準備中に、熱いア...

神経前駆細胞(NPC、神経幹および前駆細胞とも呼ばれる)は、神経変性治療戦略1の有望な候補となり得る。未分化NPCは自己再生能力、多効力、増殖能力2,3を有する。以前の研究では、細胞外マトリックスと分子メディエーターがNPCの分化を調節することが報告されています。表皮成長因子(EGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はNPC増殖を促進し、従って未分化状態を維持する4。
これまでの研究では、電気刺激は、除算5、移動6、7、8、分化1、9、10、および細胞死11のような細胞生理学的活動を調節することができるという報告がある。電気分野(EF)は、中枢神経系の発達12,13,14の発達と再生において重要な役割を果たす。2009年から2019年にかけて、この研究室は、マイクロ流体システム1、6、7、8、15、16、17におけるEFの適用に対する細胞応答を調査した。マルチチャネル、光学的に透明な電気戦術(MOE)チップは、共焦点顕微鏡用の免疫蛍光染色に適するように設計された。このチップは、高い光学透過性と耐久性を有し、1回の研究で3つの独立した刺激実験といくつかの免疫染色条件の同時実施を可能にした。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。本論文では、長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムの開発について述べた。

<table><tbody><tr><td>1 mm PMMA基板(レイヤー1-3)</td><td>BHT</td><td>K2R20</td>ポリ<td>メチルメタクリレート(PMMA)、http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td></tr><tr><td>15 mLプラスチックチューブ</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>キャップ付き円錐底チューブ、組み立て済み、滅菌済み</td></tr><tr><td>3 mLシリンジ</td><td>テルモ</td><td>DVR-3413</td><td>3mL経口注射器 針なし</td></tr><tr><td>3mm 光学グレード PMMA(レイヤー5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY PMMAシート</td><td>光学グレードPMMA</td></tr><tr><td>3方向ストップコック</td><td>ニプロ</td><td>NCN-3L</td><td>滅菌使い捨て3方向ストップコック</td></tr><tr><td>5mL注射器</td><td>テルモ</td><td>DVR-3410</td><td>5mL 注射器・針なし</td></tr> アダプター <tr><td></td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>カスタマイズされた</td><td>PMMAアダプター</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>アガロース、低ゲル化温度</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>A.A. Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>高電圧アンプ</td></tr><tr><td>AutoCAD ソフトウェア</td><td>Autodesk</td><td>教育版</td><td>製図</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B-27 サプリメント (50x)、ビタミン A</td></tr> <tr><td>を差し引いたもの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>また、組換えヒトFGFと呼ばれる-塩基性</td></tr><tr><td>ブラックラバー栓</td><td>テルモ</td><td>DVR-3413</td><td>3 mL 経口注射器から、針なし</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>ブロッキング試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>CO2 レーザー スクライバー</td><td>Laser Tools and Technics Corp.&nbsp;</td><td>ILS-II</td><td>http://www.lttcorp.com/index.htm</td></tr><tr><td>コーンコネクタ</td>から購入 <td>IDEX Health &科学</td><td>F-120X</td><td>ワンピースフィンガータイト10-32コーン、1/16 "ODナチュラル</td></tr><tr><td>コーンルアー</td><td>アダプターIDEX健康&用Science</td><td>P-659</td><td>ルアーアダプター 10-32 メス - メス ルアー、PEEK</td></tr><tr><td>共焦点蛍光顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>TCS SP5</td><td>ライカ TCS SP5 ユーザーマニュアル、http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>自動タイムラプス画像取得</td></tr><tr><td>デジタルオシロスコープ</td><td>テクトロニクス</td><td>TDS2024</td><td>電子回路またはコンポーネント内の電圧または電流信号を経時的に測定し、振幅と周波数を表示します。</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td></td></tr> <tr><td>http://en.thd.com.tw/ Dulbecco' から購入修正されたイーグル」S medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM/F-12, powder, HEPES</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, powder, no calcium, no magnesium</td></tr><tr><td>EF multiplexer</td><td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td>カスタマイズ</td><td>個々のチャネルの電流をモニターし、制御する</td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>また、組換えの人間EGF</td></tr><tr><td>と呼ばれる 速効性シアノアクリレート接着剤</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>強度瞬間接着剤 (液体)</td></tr> <tr><td>フラットボトム コネクタ</td><td>IDEX Health &科学</td><td>P-206</td><td>フランジレスオスナットデルリン、1 / 4-28平底、1/16 "ODブルー</td></tr><tr><td>機能発電機</td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A</td><td>高性能15MHz合成&nbsp;関数ジェネレータ&nbsp;任意波形機能内蔵</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>ヤギ抗マウス IgG H&L(Alexa Fluor 488)は、</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG H&を事前に吸着しました。L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>ウサギIgGに対するヤギポリクローナル二次抗体 - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>核染色</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>蛍光画像の解析&nbsp;</td></tr><tr><td>インジウム&ndash;錫&ndash;酸化物(ITO)ガラス</td><td>メルク</td><td>300739</td><td>ITOヒーター用</td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td>細胞形態観察用</td></tr><tr><td>K型熱電対</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>温度&nbsp;熱電対</td></tr><tr><td>ルアーアダプター</td><td>IDEX Health &Science</td><td>P618-01</td><td>ルアーアダプター メス ルアー - 1/4-28 オス ポリプロピレン</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td>テルモ</td><td>DVR-3413</td><td>寒天塩ブリッジ用</td></tr><tr><td>マウス 抗 GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>アストロサイトマーカー</td></tr><tr><td>オリゴデンドロサイト &nbsp;マーカー&nbsp;O4&nbsp;抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>MAB1326</td><td>オリゴデンドロサイトマーカー</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>固定&nbsp;薬剤</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ベーシックライフ</td><td>BL2651</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン(PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>コーティング液</td></tr><tr><td>精密カバーガラス 厚さ No.1.5H</td><td>マリエンフェルド</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>プログラマブルX-Y-Z電動ステージ</td><td>タンリアンInc</td><td>Customized</td>は <td>http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>Proportionalから購入しました。積分&ndash;デリバティブ(PID)コントローラ</td><td>東邦電子</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>温度コントローラ&nbsp;</td></tr><tr><td>PTFEチューブ</td><td>Professional Plastics Inc. 台湾支店</td><td>外径 1/16インチ</td><td>白半透明 PTFEチューブ</td></tr><tr><td>ウサギ anti-Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>ニューロンマーカー</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 NE-1000 プログラム可能なシングルシリンジポンプ</td></tr><tr><td>TFD4洗剤</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>カバーガラスクリーナー</td></tr><tr><td>サーマルボンダー</td><td>クアンミンテック株式会社</td><td>カスタマイズ</td><td></td></tr> <tr><td>http://kmtco.com.tw/ Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>透過処理溶液</td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>超音波洗浄</td></tr><tr><td>機 真空チャンバー</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., LTD.</td><td>DOV-30</td><td>真空乾燥オーブン</td></tr><tr><td>ホワイトフィンガータイトプラグ</td><td>IDEXヘルス&サイエンス</td><td>P-316</td><td>1/4-28 平底 https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

生理的電界(EF)は、細胞の移動、分化、分裂、死に重要な役割を果たしています。本論文では、顕微鏡を用いた長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムについて述べている。マイクロ流体システムは、光学的に透明な電気戦術チップ、透明なインジウムスズ酸化物(ITO)ヒーター、培養メディア充填ポンプ、電力供給、高周波パワーアンプ、EFマルチプレクサ、プログラマブルX-Y-Z電動ステージ、およびデジタルカメラを搭載した逆位相対向顕微鏡の主要コンポーネントで構成されています。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。この研究は、直流(DC)パルス刺激によって誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化を伴う。幹細胞維持培地では、マウスNPC(mNPC)は、DCパルス刺激後にニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化した。この結果は、単純なDCパルス治療がmNPCの運命を制御し、神経系障害の治療戦略を開発するために使用できることを示唆している。このシステムは、複数のチャネルでの細胞培養、長期EF刺激、細胞形態観察、および自動タイムラプス画像取得に使用できます。このマイクロ流体システムは、必要な実験時間を短縮するだけでなく、微小環境の制御精度を向上させます。

MOE チップの詳細な構成を図 1に示します。マイクロ流体チップは、実験用セットアップサイズ、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。MOEチップは、単独の研究で3つの独立したEF刺激実験と複数の免疫染色条件を同時に行うよう設計された(図3)。また、高い光学透過性を有するMOEチップは、共焦点顕微鏡検査に適しています。MOEチップはまた、異なる細胞培養条件(例えば、複数のEF刺激、複数の薬物、異なるコーティング基材、複数の一連の細胞)の効果を1回の実験で同時に調査するように設計されている。
mNPCは、方形波DCパルス(100Hzの周波数でマグニチュード300mV/mm)にさらされた。DCパルス刺激を48時間行った。分化した細胞を、Tuj1(ニューロン特異的III型βチューブリン)、グリア性フィブリリン酸性タン...

本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

本研究は、マイクロ流体系における直流パルス刺激によってのみ誘導される神経前駆細胞の分化に関するプロトコルを提示する。この手法は、実験の段取り時間、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。さらに、MOEチップは共焦点顕微鏡観察に適しています。単純な直流パルス治療は、マウス神経前駆細胞の運命を制御することができ、神経系障害の治療戦略を開発するために使用することができます。まず、個々の PMMA 層と、適切なソフトウェアを使用して両面テープのパターンを描画します。炭酸ガスレーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。ソフトウェアを使用して、設計されたパターンファイルを開きます。レーザースクリバーのプラットフォーム上にPMMAシートまたは両面テープを置き、オートフォーカスツールを使用してPMMAシートまたは両面テープの表面にレーザーを焦点を合わせます。レーザースクリバをプリンタとして選択し、レーザースクリバを使用してPMMAシートまたは両面テープで直接アブレーションを開始します。PMMAシートから保護フィルムを取り出し、窒素ガスを使用して表面を洗浄します。PMMAシートの複数の層を結合するには、1ミリメートルPMMAシートの3枚を積み重ね、110°Cで30分間熱ボンダーで平方センチメートル当たり5キログラムの圧力で結合し、流れまたは電気刺激チャネルアセンブリを形成します。高速作用シアノアクリル接着剤とMOEチップアセンブリの層1の個々の開口部に12個のアダプタを付着させます。チップを組み立てる前に、1ミリメートルPMMA基板、両面テープ、3ミリ光学グレードPMMAを30分間紫外線照射で消毒します。3ミリメートル光学グレードPMMAに1ミリメートルのPMMA基板を両面テープで貼り付け、PMMAアセンブリを完成させます。洗浄したカバーグラスを、両面テープでPMMAアセンブリに貼り付けます。寒天ブリッジアダプターの開口部を白い指密プラグでシールします。フラットボトムコネクタを中型の入口アダプタとコンセントアダプタを介してMOEチップアセンブリに接続し、コーンLuerアダプタを3ウェイストップコックに接続します。0.01%PLL溶液の2ミリリットルを培地入口の3ウェイストップコックに接続する3ミリリットルのシリンジを使用して追加し、空の3ミリリットルのシリンジを媒体出口の3ウェイストップコックに接続します。PLL溶液で細胞培養領域を充填し、ゆっくりとコーティング溶液を前後にポンピングします。2つの三方ストップコックを閉じて、培養地域内の溶液を密封します。5%の二酸化炭素雰囲気で満たされたインキュベーターで一晩摂氏37度でMOEチップをインキュベートします。2つの三方向ストップコックを開き、2つの注射器を使用してチャネル内でコーティング溶液を前後に手動でポンピングすることで、チャネル内の気泡を洗い流します。完全な培地を3ミリリットルのシリンジに3ミリリットル引き込み、培地入口の3ウェイストップコックに接続し、それを加えて細胞培養領域のコーティング溶液を交換します。白い指密プラグをLuerアダプタに交換し、3%ホットアガロースを注入してアダプタを充填します。LuerロックシリンジをLuerアダプタに接続し、黒いゴムボンを通して3%のホットアガロースを注入してLuerロックシリンジを充填します。アガロースが冷めて固めるのに10~20分かかります。セルシードのMOEチップを、摂氏37度に維持されたプログラム可能なXYZ電動ステージに取り付けられている透明なITOヒーターに取り付けます。MNPCを手動で媒体出口を介してMOEチップに送り込み、ITOヒーターのセルシードMOEチップを4時間インキュベートします。電線を使用して、EF マルチプレクサをチップの電極を介して MOE チップに接続します。EF マルチプレクサとファンクション ジェネレータをアンプに接続して、直角波 DC パルスを出力します。MOEチップのフラットボトムコネクタとアダプタをすべて取り外し、アダプタにPBSを充填し、アダプタの開口部をパラフィルムで密封します。免疫染色後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する。DCパルス刺激により、幹細胞維持培地中のニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに同時に分化するmNPCが生まれた。コントロール群および刺激群におけるニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの割合をここに示す。DCパルス処理後、mNpcはDIV 7で有意に高い数のニューロン、DIV 3でアストロサイト、DIV 7とDIV 14のオリゴデンドロサイトが対照群よりも刺激群において比較的高いレベルで存在した。30〜40細胞によって形成される神経球は、mNPC分化を開始するために好ましい。mNPCの過剰増殖は分化プロセス中の細胞生存を損なう。

electric-field-induced-neural-precursor-cell-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。...

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。...

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

このビデオは、細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロ流体チップを使用して、電気刺激を通じて神経幹細胞と前駆細胞またはNPCを区別する方法を示しています。コーティングされた領域に播種して付着した後、NPCは成長し、直流を印加するとニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへの分化が引き起こされます。...

電気刺激による神経幹細胞と前駆細胞の分化

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。...

マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

このビデオは、マイクログルーブバリアによって分離された体細胞と軸索コンパートメントで構成されるマイクロ流体デバイスを使用して、神経幹細胞(NSC)の分化を示しています。NSCは体細胞コンパートメントに導入され、接着することができます。NSCは体細胞コンパートメント内でニューロンに分化し、微小溝バリアを介して軸索コンパートメントに軸索を伸ばします。...

コンパートメント化されたマイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞のニューロンへの分化

生体材料コーティングのチップ内のプラズマパターニングのための単一ニューロンマイクロ流体アレイ化と水のマスキングのためのプロトコルが記載されている。高度に相互接続された共培養細胞は、最小限の入力を用いて調製することができる。...

単セルの精度で神経共培養の調製

このプロトコルは、コンパートメント化されたマイクロ流体チップの使用を示し、環状オレフィン共重合体で成形された注射をヒト幹細胞から分化した培養ニューロンに対して行う。これらのチップは、従来のコンパートメント化ポリ(ジメチルシロキサン)デバイスよりも組み立て済みで使いやすいです。ウイルス標識、流体単離、軸除染、免疫染色など、複数の一般的な実験パラダイムがここに記載されています。...

組み立て済みプラスチックマイクロ流体チップ内のヒト幹細胞由来ニューロンの区分化

1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。...

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。...

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

乳がん細胞は、非腫瘍乳房上皮細胞とは異なる誘電特性を示します。この誘電特性の違いに基づいて、免疫療法の目的で2つの集団を分離できるという仮説が立てられています。これをサポートするために、MCF-7およびMCF-10A細胞を分類するマイクロ流体デバイスをモデル化します。...

AC誘電泳動を用いた非転移性(MCF-7)および非腫瘍(MCF-10A)乳癌細胞の分離のためのマイクロ流体デバイス

学ぶマイクロ流体デバイスを用いた神経前駆細胞の電界誘発分化法。直流パルス刺激で細胞運命を制御し、神経系疾患治療戦略の開発に応用可能な効率的な実験プロトコルを解説します。

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

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