Name: 分子解析のための小脳局所解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ マウス小脳の局所解剖法。半球、虫部前後領域、深部小脳核を迅速かつ再現性良く分離し、領域特異的な遺伝子発現解析を可能にする神経科学研究手法です。

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クヴェタノビッチ研究所のオースティン・フェロとジュアオ・ギルヘルメ・ローザは、分節のトラブルシューティングやRNA抽出とRTqPCRに協力してくれたことに感謝しています。この研究はM.クヴェタナノビッチ、R01 NS197387によって資金提供されています。HHS |国立衛生研究所(NIH)。

1. セットアップ
<ol><li>切断ハサミ、鈍い鉗子、解剖はさみ、血管はさみ、マイクロスタッラ、矢状マウス脳マトリックス、カミソリの刃、200 μLピペット先端、ガラスシャー、ガラススライド、およびアイスバケツを含む必要な機器を収集します。吸収パッド上のすべての機器をレイアウトします。</li>
	<li>シャーレ、ガラス板、脳マトリックスを氷の上に置きます。</li>
	<li>カミソリの刃を垂直な角度で使用し、1つの200 μLピペットチップの先端から約5mmを切ります。これにより、先端の端部の開口部のサイズは約1mm幅になります。これは DCN をパンチアウトするのに十分なはずです。しかし、これはまた、解剖に応じて必要に応じて調整することができます。簡単に交換と調整のための準備ができて多くのヒントを持っています。</li>
	<li>動物の同一証明および小脳領域(動物ごとの4つの管)が付いているラベル1.5 mLマイクロフュージ管。</li>
	<li>抽出後に凍結組織をフラッシュするために液体窒素で凍結安全な容器を充填します。</li>
</ol>2. 脳の抽出と解剖
すべての実験は、ミネソタ大学動物ケア委員会のガイドラインに従って行われました。
<ol><li>5%のCO2 露光を使用してマウスを安楽死させます。呼吸が止まったら、子宮頸部脱臼を行う。切断ハサミでマウスの首を切り落とし、適切なレセプタクルに死体を捨てます。</li>
	<li>鼻から始まり、戻って続ける頭の内側矢状ラインに沿ってカミソリの刃で切開を行います。皮膚を分離し、正中線の両側に別れる。カミソリの刃を使用して両側の筋肉を切り取り、外耳道を通り過ぎます。</li>
	<li>解剖ハサミを使用して、脳幹が小脳と出会う場所まで、脊髄領域をトリミングし、小脳に損傷を与えないように注意する。</li>
	<li>脳幹と椎骨柱の間のスペースに血管シザーブレードの1つを挿入し、外耳道に向かって切断し、はさみを持ち上げて骨をきれいにカットしますが、組織への損傷を制限します。</li>
	<li>頭蓋骨の端に沿って嗅球に向かって切断し続け、脳組織への損傷を制限するために切断しながら持ち上げ続ける。</li>
	<li>鈍い鉗子を使用して、脳と小脳の後部領域を明らかにする頭蓋骨の後ろを静かに剥がします。</li>
	<li>ちょうど切断された頭蓋骨の端に沿って鈍い鉗子を使用して、頭蓋骨の残りの部分を脳の上と上に剥がします。このステップは、頭蓋骨のキャップの大部分を削除する必要があります, 脳を明らかに.</li>
	<li>頭蓋骨の残りの部分を血管はさみと鈍い鉗子でトリミングし、頭蓋骨のほとんどを脳の上から取り除きます。</li>
	<li>マイクロスパチュラを使用して、脳をわずかに持ち上げ、下にすくい上げ、スライドして残りの頭蓋骨から嗅球を取り除き、光路繊維を切断します。脳は、この時点で簡単に自由に来る必要があります。</li>
	<li>氷の上に座っているシャーレに脳を置き、残りの頭蓋骨や他の破片を取り除きます。</li>
	<li>マイクロスパチュラを使用して、脳を優しく脳のマトリックスに置き、後側を上にします。行列の中線が中心になるように、マトリックスのレベルが設定されていることを確認する時間をとってください。このマトリックスは、成人マウスの脳組織のために設計されています, 若いまたは病気の動物からの組織は、マトリックスの下に休む可能性がありますが、それでも、サンプル全体で再現可能な結果を達成することが可能である必要があります.</li>
	<li>矢状の正中線に沿って1つのカミソリの刃を置き、ブレードがマトリックスの底まで押し出されることを確認します(図1B)。</li>
	<li>1つ目の刃の側面に別のカミソリの刃を1mm置く(図1B)。さらに2枚の刃を1mm離して配置します。最終的な結果は、脳の片側に配置された3つのブレード、すべて1mm離れている必要があります。反対側にも同じことをしてください。合計で、7枚のブレードが1mm離れて配置されます(図1C)。</li>
	<li>慎重に、カミソリの刃の前部と後端をつかみ、マトリックスからまっすぐ持ち上げます。カミソリの刃の外側のティッシュは捨てることができる。</li>
	<li>ゆっくりと、一度に1つのカミソリの刃を他の刃から分離し、組織の切片を損傷しないように注意する。</li>
	<li>カミソリの刃から慎重に組織セクションをスライドさせ、マイクロスパチュラでガラススライドにスライドさせます。合計で6つの矢状脳セクションがあります(図1D)。</li>
	<li>4つの最も横のセクションはDCNを表示する(紫の箱、 図1D)。DCNを分離するには、トリミングされた200 μLピペットチップをDCNの上に垂直に保持し、組織をしっかりと押し下げ、すべての方向に揺れ動き、DCNを周囲の組織から完全に解剖します。まっすぐに持ち上げてDCNをきれいに取り除き、先端に組織の存在を視覚的に確認します。</li>
	<li>先端の上部に1本の指を置いて押し下げ、組織が膨らみます。チップを正しくラベル付けされたマイクロフュージチューブに入れ、ティッシュパンチがチューブの底に置かれていることを確認します。残りの 3 つのセクションに対して 2.17 を繰り返し、同じチューブに DCN パンチを配置します。チューブを液体窒素に入れ、フリーズします。 図1Eでの各パンチのサイズの表現。</li>
	<li>DCNを抽出したセクションは、小脳半球として適格です。これらのセクションで小脳の周りの脳組織の残りの部分を押しのけます.鈍い鉗子を使用し、穏やかにこれらの半球小脳皮質セクションをピックアップし、それぞれのマイクロフュージチューブに配置します。フラッシュフリーズ。</li>
	<li>最後の2つのバーマルセクション(水色のボックス、 図1D)については、小脳だけを残して周囲の脳組織を押し出します。カミソリの刃を使用して、後部小葉から前葉を分離するカットを行います。カットは、小葉6の形成直後にあるべきであり、小葉10(図1F)を含んではなりません。</li>
	<li>鈍い鉗子を使用して、慎重に前小脳皮質セクションと後小脳皮質セクションをそれぞれのマイクロフュージチューブに入れ、チューブを液体窒素に5分間放置してフラッシュフリーズします。ここからRNA抽出に進み、チューブを−80°Cで保存してもよい。</li>
</ol>3. RNA抽出 
注:このプロトコルは、TRIzol20を使用したRNA抽出のためのコールドスプリングハーバープロトコルから変更されています。TRIzolは生体物質を可溶化し、RNAを抽出することを可能にします。
<ol><li>ミクロフュージチューブを氷の中に入れ、組織が解凍しすぎないようにし、マイクロフュージチューブに150 μLのコールドTRIzolを塗布します。殺菌された害虫で均質化する。組織が均質化されたら、溶液を上下にパイプして、残りの組織がそのままにならないようにします。さらに、インスリン注射器に数回引き上げて小さな組織片を分解します。</li>
	<li>TRIzolを350μL追加し、上下にパイプを入れて完全に混合します。部屋の温度に5分間座りましょう。</li>
	<li>150 μLのクロロホルムをチューブに加え、激しく振ってから2~3分ほど休ませます。クロロホルムは、均質化された組織溶液を相(RNA、DNA、タンパク質)に分離します。</li>
	<li>12,000 x gで遠心分離機, 15°Cで, 10分間.すべてのチューブが同じ向きであることを確認します。</li>
	<li>慎重にチューブを取り外し、遠心分離機の温度を4°Cに設定します。透明な水相のみを新しいチューブ(これはRNA)に取り出し、不透明なインターフェーズ(DNA)を破壊しないように注意してください。 最も低い相は赤で、タンパク質が含まれています。チューブ内の残りの溶液は保存または廃棄することができます。</li>
	<li>1:2比で100%イソプロピルアルコールを加えます(水相の200ulを除去した場合は、100μLのイソプロピルアルコールを加えます)。上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。室温で10分間休ませてください。イソプロピルアルコールは溶液からRNAを沈殿させる。</li>
	<li>遠心分離機は12,000 x gで、4°Cで、10分間。ペレットを見やすくするために、すべてのチューブを同じ向きに配置してください。得られたペレットは、抽出されたRNAになります。</li>
	<li>慎重にチューブを取り外し、ペレットを破壊しないように注意してパイプで上清を除去します。ペレットはゲル状で、見えにくくなりますが、遠心分離機のチューブの向きに基づいてどこにあるかを推定できるはずです。</li>
	<li>上清をすべて取り除いた後、500 μLの75%エタノール、渦、7500 x gの遠心分離機を4°Cで5分間加えます。エタノールはさらにペレットを打ち上げる。</li>
	<li>ペレットを破壊することなく、上清を慎重に取り除きます。キャップを開けてサンプルを乾燥させます。これは通常5〜10分かかりますが、ペレットに残されたエタノールの量によって異なる場合があります。乾燥し過ぎないでください。</li>
	<li>乾燥したら、DNaseフリーウォーターのペレットを再び懸濁します。DCNのサンプルには20 μL、他のサンプルには30 μLを加えます。</li>
	<li>再懸濁後、サンプルは-80°Cで保存するか、さらなる試験に進むことができます。</li>
</ol>4. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RTqPCR)
<ol><li>このステップの前に、DNaseはRNAを治療してゲノムDNAを除去し、BioRadからiScriptを利用してcDNAを生成する必要があります。必ず、cDNAを作る前にRNAの濃度を正常化してください。さらに、qPCR用のプライマーを最適化することが重要です。ここで説明する方法に従って、この手順21を完了します。以下の qPCR について簡単に説明します。</li>
	<li>プライマーはすべてIDTから購入されます。順方向および逆配列は、両方とも同じサンプルチューブ内にあり、20倍の濃度で保存されます。 Rps18(コントロール遺伝子): フォワード - 5'-CCTGAGAGTTCCAGCACAT-3' リバース - 5'-アカカカガガカタットクッチ-3' パルアルブミン(カルシウム結合タンパク質、阻害細胞): フォワード - '5-ATGAGGTGAAGGTTCC-3' 逆 – '5-AGCGTTTGtTTTTタグカグ-3' Kcng4 (カリウムチャネルサブユニット): フォワード - 5'-CTCTTTCCTGGTCAGTGA-3' 逆 – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' アルドラーゼC(ゼブリンII、小脳皮質全体で差し合って発現): フォワード - 5'-アガガカアガガガタガトGCTG-3' リバース - 5'-TCAGTAGGCATGGTGGC-3'</li>
	<li>qPCR条件は以下の通りであった。プレインキュベーション期間、5分、95°Cで。増幅期間、50サイクル:95°Cで10分、62°Cで10分、72°Cで10分。融解曲線周期、95°Cで5秒、65°Cで1分、ランプレートを97°Cの目標温度まで0.07°C/秒に設定します。その後、10分から40°Cの冷却期間。 全てのqPCR反応を三重で行い、遺伝子発現を正常化するための負荷制御として2-ΔΔCtをRps18で解析した。 バルク小脳抽出物を基準として使用した。</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia%2Fneuron+ratio%3A+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する方法は、4つの異なる小脳領域内の基礎となる遺伝子発現および分子メカニズムを評価することを可能にする - 深い小脳核(DCN)、脊椎の前小脳皮質(CCaV)、ベルミの後小脳皮質(CCpV)、および半球の小脳皮質(CCH)。これらの領域を別々に評価する能力は、特定の小脳領域の不均一性に関する我々の知識を拡大し、おそらく様々な行動への貢献に光を当てる。
完全な脳組織を矢状に切り離すことによって、小脳のこれら4つの領域を容易に可視化して同定することができ、迅速な解剖を可能にする。著者の知る限りでは、これは分子分析のための完全な小脳局所解剖の最初の記述である。最近発表された論文では、研究者は分子解析22のために小脳の前小葉と小脳のうなず小葉の一括解剖を使用した。しかし、説明された方法では、DCNを解剖することもできないであろう。300um厚さのスライスをカットするためにビブラートメを使用してDCNパンチを分離しようとする試みは、通常、3つの重大な問題に遭遇します。第1に、脳の取り付けと組織が切断される角度のわずかな違いのために、動...

小脳は脳内のニューロンの半分以上を含み、歴史的に脳内の運動制御とバランスセンターと呼ばれています1.最近では、小脳が認知、報酬処理、および2、3、4、5に影響を及ぼすなど、他のさまざまな機能において重要な役割を果たしていることを実証した。
小脳は、よく記述された解剖学を有する:皮質領域は顆粒、プルキンジェ、および分子層で構成される。顆粒細胞は、顆粒細胞層を形成し、分子層のプルキンエ細胞デンドライトに平行繊維を介して入力を送信し、劣ったオリーブに由来する上昇繊維からの入力も受け取る。プルキンエ細胞は、小脳からの主な出力として機能する深小脳核(DCN)内の細胞に抑制性の投影を送る。この小脳回路の出力は、ゴルジ、ステレート、およびバスケット細胞4を含む小脳皮質における阻害性相互作用ニューロンの活性によってさらに変調される。この小脳機能ユニットは、小脳皮質のすべての小葉全体に分布しています。小脳を横切るこの比較的均一な回路にもかかわらず、ヒトの神経イメージング文献および患者研究からの証拠は、小脳6,7の機能的不均一性を示す。
小脳皮質は、正中線定義のめまいと横半球の2つの主要な領域に分けることができます。ベルミはさらに前葉と後部小葉に分けることができます。小脳のこれらの異なる領域は、異なる行動に寄与することに関与している。タスク誘発またはタスクフリーの活動パターンは、脊椎の前領域が運動機能に多く寄与し、後方のバーミが認知に多くを寄与することを含む6、7。バーミは影響や感情とも連動し、小脳半球はエグゼクティブ、視覚空間、言語、その他のニーモニック機能8に寄与する。さらに、解剖学的研究は、機能的に異なる小脳領域が異なる皮質領域と接続しているという証拠を提供した9.病変症状のマッピングは、前葉に影響を与える脳卒中(小葉VIに及ぶ)を有する患者は細かい運動タスクでパフォーマンスが悪く、後葉領域および半球に損傷を与えた患者は小脳運動症候群10の不在時に認知障害を示すことを明らかにした。最後に、疾患における局所小脳病理は、機能的に異なる小脳領域も疾患11,12に対して異なる感受性を示す。
あまり探求されているが、予備的な証拠は、小脳皮質領域全体で明確な遺伝子発現シグネチャを示している。ゼブリンIIのプルキンエ細胞発現は、後葉小葉にゼブリンII陽性細胞が多く、前葉13に少なくなるようなめまいにおける領域特異的なパターニングを示す。これはまた、ゼブリンII陰性プルキンイェ細胞がゼブリンII陽性14であるプルキンエ細胞よりも高いトニック焼成の頻度を示すように、局所的に異なる生理機能と相関する。
小脳は小脳の皮質に加えて、小脳の主要な出力として機能する深い小脳核(DCN)を含む。核は、内側(MN)、介在(IN)、および横核(LN)で構成されています。機能的イメージングおよび患者研究は、DCNが様々な行動15にも関与することを実証しているが、DCNの遺伝子発現変化を調べる研究はほとんどない。
分子技術の進歩により、脳内の領域遺伝子発現を評価することが可能となり、生理学的および疾患状態16の両方において異なる脳領域の異種性を発見した。このような研究は、小脳が他の脳領域とは異なっていることを意味します。例えば、神経細胞とグリア細胞の比率は、他の脳領域1と比較して小脳で反転する。正常な生理学的条件においても、他の脳領域17と比較して小脳において炎症促進性遺伝子の発現がアップレギュレートされる。分子技術は、小脳病の病因に寄与する経路を同定する上でも非常に有用であった。例えば、小脳全体のRNAシーケンシングは、スピノセレラー失調症のプルキンエ細胞特異的トランスジェニックマウスモデルで改変された遺伝子を同定し、その野生型制御と比較した。このような証拠は、小脳プルキンエ細胞における病因の根底にある主要な分子経路を明らかにし、潜在的な治療標的18を同定するのに役立った。しかし、最近の研究では、小脳領域11、12、19の疾患に対する脆弱性に違いがあることを示唆している。これは、異なる小脳領域で重要な変化が起きており、小脳抽出物全体でマスクまたは検出されないことを示している可能性があります。したがって、研究者が異なる小脳領域の分子プロファイルを調べることができるようにする技術を開発する必要があります。
ここで提案される技術は、それらの領域からRNAを分離し、遺伝子発現の地域差を探るためにマウス小脳の4つの異なる領域を解剖する再現可能な方法を記述する。 図1A のマウス小脳の模式図は、青で朱色を、半球を黄色で強調しています。具体的には、この技術は、深い小脳核(DCN)( 図1Aの赤点点のボックス)、前立体(CCaV)の小脳皮質( 図1Aの濃い青色)、後部バーミ(CCpV)の小脳皮質( 図1Aの水色)、および小脳皮質(図 1Aの淡色)の4つの領域を単離することを可能にする。これらの領域の遺伝子発現を個別に評価することにより、これらの異なる領域の離散機能の基礎となる分子メカニズムと、疾患における脆弱性の潜在的な違いを調査することが可能になります。

<table><tbody><tr><td>1.5 マイクロ遠心チューブ</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% イソプロピルアルコール</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul ピペットチップ</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>大人 マウス 脳 マトリックス サジタル</td><td>ケント サイエンティフィック</td><td>コーポレーション RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>鈍い鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>マクロン</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>斬首ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr>解<tr><td>剖ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr>エ<tr><td>チルアルコール</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス(電気泳動用)</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザーキン</td><td>ブル</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードル ノーズ</td><td></td><td></td><td></td>鉗子</tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>パイレックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プライムタイム プライマー アルドラーゼ C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.5>43415246</td><td></td></tr> <tr><td>8 用Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>パルブアルブミン用プライムタイムプライマー</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer RPS18&nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>シングル エッジ Rzor ブレード</td><td>Personna GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み、単用乳棒</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Ambion by Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>血管はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

分子解析のための小脳局所解剖

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

小脳は、動きの制御を含むいくつかの重要な機能で重要な役割を果たしています, バランス, 認知, 報酬, そして、影響.イメージング研究は、異なる小脳領域がこれらの異なる機能に寄与することを示している。局所的小脳の違いを調べる分子研究は、主に小脳エキス全体で行われるため、特定の小脳領域にわたる区別を隠すため、遅れている。ここでは、深い小脳核(DCN)、前および後の脊髄小脳皮質、半球の小脳皮質の4つの異なる小脳領域を再現し、迅速に解剖する技術について説明します。これらの異なる領域を解剖することは、バランス、動き、影響および認知への彼らのユニークな貢献の根源となり得る分子メカニズムの探求を可能にする。この技術はまた、様々なマウス疾患モデルにおけるこれらの特定領域の病理学的感受性の違いを探求するために使用され得る。

これらの実験では、生後11週齢の雌野生型C57/Black6マウス4匹を使用した。1つのマウスは、「バルク小脳」と呼ばれる完全な小脳解離を行うために使用され、解剖された領域のRNAレベルを完全解剖と比較することを可能にした。他の3匹のマウスを用い、このプロトコルに記載された小脳解剖を行った。3匹のマウスを使用することで、RNAのレベルで検出された傾向がマウス全体で再現可能であることを確認することができます。
図1Aは 、マウス小脳-青で朱色、黄色の半球を表す。ベルミの矢状の概略図(濃い青色の前領域、水色の後部領域)および半球(黄色)。DCN は赤い点線のボックスで強調表示されます。解剖が成功すると、脳の正中線の下に最初のカミソリの刃の配置から始まります (図 1B);これは、次の 6 つのブレードの配置を正常に行うガイドです (<st...

異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

小脳の従来の分子研究は、小脳全体の抽出物に対して行われており、これにより特定の小脳領域の違いが隠される可能性があります。このプロトコルにより、小脳の異なる領域を個別に評価することが可能になり、さまざまな行動や疾患の進行に対する独自の貢献の根底にある可能性のある分子メカニズムの調査が可能になります。この技術の主な利点は、4つの小脳領域、深部小脳核、虫部の前後小脳皮質、および半球の小脳皮質の再現性のある迅速な解剖を可能にすることです。安楽死させたマウスの首を切った後、頭の内側矢状線に沿って、鼻から始まり、ずっと後ろまで続くかみそりの刃で切開を行います。皮膚を分離し、かみそりの刃を使用して両側の筋肉を切り取り、外耳道を過ぎて切り取ります。解剖ハサミを使用して、脳幹が小脳と出会う場所まで多くの脊髄領域をトリミングし、小脳を傷つけないように注意します。血管はさみの刃の1つを脳幹と脊柱の間のスペースに挿入し、耳道に向かって切断し、組織への損傷を制限するために切断しながら上に持ち上げます。頭蓋骨の端に沿って嗅球に向かって切り続けます。鈍い鉗子を使用して、この頭蓋骨の裏側をそっと剥がし、脳と小脳の後部を露出させます。鈍い鉗子を頭蓋骨の切り口に沿って配置し、頭蓋骨を上から脳の上に剥がします。血管はさみと鈍い鉗子で頭蓋骨の残りの部分を切り取り、脳の上部から頭蓋骨の大部分を取り除きます。マイクロスパチュラで脳をわずかに持ち上げて、残りの頭蓋骨から嗅球を取り出し、視路線維を切断します。この時点で、脳は簡単に自由になるはずです。氷の上に座って脳をシャーレに入れ、残っている頭蓋骨やその他の破片を取り除きます。背側を上にして、脳を脳マトリックスにそっと置きます。マトリックスで水平に設定され、正中線が中央にあることを確認します。1枚のカミソリの刃を矢状正中線に沿って置き、刃がマトリックスの底まで押し込まれていることを確認します。別のかみそりの刃を最初の刃の側面に1ミリメートル置きます。さらに2つのブレードを配置すると、3つのブレードが脳の片側に1mm間隔で配置されます。これを反対側で繰り返します。カミソリの刃の前端と後端を慎重につかみ、マトリックスからまっすぐ持ち上げます。かみそりの刃の外側にあるティッシュを捨てます。ゆっくりと、一度に1つのかみそりの刃を他の刃から分離し、組織切片を傷つけないように注意してください。ティッシュ部分をカミソリの刃からスライドさせ、マイクロスパチュラでスライドガラスにスライドさせます。6つの矢状脳切片を収集する必要があります。最も前面の側面部分にはDCNが表示されます。DCNを分離するには、200マイクロリットルのピペットチップにトリムをDCN上で垂直に保持し、組織を押し下げて、すべての方向にしっかりと揺れます。ピペットを持ち上げて、先端に組織が存在することを視覚的に確認します。先端の上部に1本の指を置き、押し下げるとティッシュが膨らみます。チップを正しくラベル付けしたマイクロフィッシュチューブに挿入し、ティッシュパンチがチューブの底に配置されていることを確認します。残りの3つのセクションでこれを繰り返し、DCNパンチを同じチューブに配置します。チューブを液体窒素で急速凍結します。DCNが抽出された部分の小脳の周りの残りの脳組織を押しのけます。鈍い鉗子を使用して、これらの半球の小脳皮質切片を優しく拾い上げ、それぞれのマイクロフィッシュチューブに入れてから、瞬間凍結します。最後の2つの春側セクションでは、周囲の脳組織を押しのけて小脳だけを残します。かみそりの刃を使用して、前唇と後唇を分離する切り込みを入れます。カットが唇6の形成直後であり、唇10を含まないことを確認してください。鈍い鉗子を使用して、前小脳皮質切片と後小脳皮質切片をそれぞれのマイクロフィッシュチューブに慎重に配置し、チューブを液体窒素に5分間放置して瞬間凍結します。組織が急速に解凍されないようにマイクロフィッシュチューブを氷上に配置し、マイクロフィッシュチューブに150マイクロリットルの冷たいRNA分離溶液を塗布し、滅菌した乳棒で均質化します。組織が均質化されたら、溶液を上下にピペットで動かして、無傷の組織が残っていないことを確認します。さらに、小さな組織片をインスリン注射器に数回引き上げて砕きます。さらに350マイクロリットルの試薬を加え、ピペットで上下させて十分に混合し、室温で5分間放置します。チューブに150マイクロリットルのクロロホルムを加えて激しく振った後、2〜3分間休ませます。12, 000倍Gで摂氏15度で10分間遠心分離します。遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、遠心分離機の温度を摂氏4度に設定します。透明な水相のみを新しいチューブに移し、不透明な間相を乱さないように注意してください。チューブに残っている溶液を保存するか、廃棄します。100%イソプロピルアルコールを1対2の割合で加え、ピペッティングで上下に動かしてよく混ぜます。サンプルを室温で10分間休ませて、溶液からRNAを沈殿させます。Gの12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、すべてのチューブを同じ向きに配置して、ペレットを視覚化しやすくします。遠心分離後、ペレットを乱さないように、チューブを慎重に取り外し、ピペットで上清を取り除きます。ペレットはゲル状で見づらいため、遠心分離機内のチューブの向きに基づいてペレットがどこにあるかを推定します。すべての上清を取り除いた後、75%エタノールの500マイクロリットルを加え、短時間ボルテックスし、7、500倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを乱さずに、上清を慎重に取り除きます。キャップを開けたままにして、サンプルを5〜10分間乾燥させます。乾燥したら、ペレットをDNAの自由水に20マイクロリットルでDCNのサンプルに、他のすべてのサンプルに30マイクロリットルで再懸濁します。さらなる分析まで、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。このプロトコルは、マウス小脳の4つの異なる領域を解剖し、遺伝子発現の地域差を調査するために使用されました。アルドラーゼC、パルブアルブミン、KCNG4の発現レベルは、リアルタイムの定量的PCRを使用して評価されました。アルドラーゼCは、後小脳虫部でより強く発現します。しかし、DCNおよび虫癬の前部領域は、大脳郭清と比較すると低くなります。パルブアルブミンは、バルク小脳抽出物と比較した場合、DCN前虫部、後部虫部、半球小脳皮質にも同様に存在します。.KCNG4は、DCNと内部虫部で有意に濃縮されていますが、バルク抽出と比較した場合、後部虫部や半球では濃縮されていません。小脳皮質全体でのアルドラーゼCの発現を直接比較するために、発現レベルを前虫部と比較しました。アルドラーゼCの発現レベルは、後虫部で有意に高く、小脳半球で高くなる傾向にありました。これらの領域から抽出されたRNAは、RNAシーケンシング、実験にも使用できます。これらを小脳領域と比較するRNA配列は、これらの領域の根底にある個別の機能である分子メカニズムに関するより詳細な情報を提供します。また、病気に対する脆弱性の潜在的な違いもあります。

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分子解析のための小脳局所解剖

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