分子解析のための小脳局所解剖

小脳の従来の分子研究は、小脳全体の抽出物に対して行われており、これにより特定の小脳領域の違いが隠される可能性があります。このプロトコルにより、小脳の異なる領域を個別に評価することが可能になり、さまざまな行動や疾患の進行に対する独自の貢献の根底にある可能性のある分子メカニズムの調査が可能になります。この技術の主な利点は、4つの小脳領域、深部小脳核、虫部の前後小脳皮質、および半球の小脳皮質の再現性のある迅速な解剖を可能にすることです。

安楽死させたマウスの首を切った後、頭の内側矢状線に沿って、鼻から始まり、ずっと後ろまで続くかみそりの刃で切開を行います。皮膚を分離し、かみそりの刃を使用して両側の筋肉を切り取り、外耳道を過ぎて切り取ります。解剖ハサミを使用して、脳幹が小脳と出会う場所まで多くの脊髄領域をトリミングし、小脳を傷つけないように注意します。

血管はさみの刃の1つを脳幹と脊柱の間のスペースに挿入し、耳道に向かって切断し、組織への損傷を制限するために切断しながら上に持ち上げます。頭蓋骨の端に沿って嗅球に向かって切り続けます。鈍い鉗子を使用して、この頭蓋骨の裏側をそっと剥がし、脳と小脳の後部を露出させます。

鈍い鉗子を頭蓋骨の切り口に沿って配置し、頭蓋骨を上から脳の上に剥がします。血管はさみと鈍い鉗子で頭蓋骨の残りの部分を切り取り、脳の上部から頭蓋骨の大部分を取り除きます。マイクロスパチュラで脳をわずかに持ち上げて、残りの頭蓋骨から嗅球を取り出し、視路線維を切断します。

この時点で、脳は簡単に自由になるはずです。氷の上に座って脳をシャーレに入れ、残っている頭蓋骨やその他の破片を取り除きます。背側を上にして、脳を脳マトリックスにそっと置きます。

マトリックスで水平に設定され、正中線が中央にあることを確認します。1枚のカミソリの刃を矢状正中線に沿って置き、刃がマトリックスの底まで押し込まれていることを確認します。別のかみそりの刃を最初の刃の側面に1ミリメートル置きます。

さらに2つのブレードを配置すると、3つのブレードが脳の片側に1mm間隔で配置されます。これを反対側で繰り返します。カミソリの刃の前端と後端を慎重につかみ、マトリックスからまっすぐ持ち上げます。

かみそりの刃の外側にあるティッシュを捨てます。ゆっくりと、一度に1つのかみそりの刃を他の刃から分離し、組織切片を傷つけないように注意してください。ティッシュ部分をカミソリの刃からスライドさせ、マイクロスパチュラでスライドガラスにスライドさせます。

6つの矢状脳切片を収集する必要があります。最も前面の側面部分にはDCNが表示されます。DCNを分離するには、200マイクロリットルのピペットチップにトリムをDCN上で垂直に保持し、組織を押し下げて、すべての方向にしっかりと揺れます。

ピペットを持ち上げて、先端に組織が存在することを視覚的に確認します。先端の上部に1本の指を置き、押し下げるとティッシュが膨らみます。チップを正しくラベル付けしたマイクロフィッシュチューブに挿入し、ティッシュパンチがチューブの底に配置されていることを確認します。

残りの3つのセクションでこれを繰り返し、DCNパンチを同じチューブに配置します。チューブを液体窒素で急速凍結します。DCNが抽出された部分の小脳の周りの残りの脳組織を押しのけます。

鈍い鉗子を使用して、これらの半球の小脳皮質切片を優しく拾い上げ、それぞれのマイクロフィッシュチューブに入れてから、瞬間凍結します。最後の2つの春側セクションでは、周囲の脳組織を押しのけて小脳だけを残します。かみそりの刃を使用して、前唇と後唇を分離する切り込み

カットが唇6の形成直後であり、唇10を含まないことを確認してください。鈍い鉗子を使用して、前小脳皮質切片と後小脳皮質切片をそれぞれのマイクロフィッシュチューブに慎重に配置し、チューブを液体窒素に5分間放置して瞬間凍結します。組織が急速に解凍されないようにマイクロフィッシュチューブを氷上に配置し、マイクロフィッシュチューブに150マイクロリットルの冷たいRNA分離溶液を塗布し、滅菌した乳棒で均質化します。

組織が均質化されたら、溶液を上下にピペットで動かして、無傷の組織が残っていないことを確認します。さらに、小さな組織片をインスリン注射器に数回引き上げて砕きます。さらに350マイクロリットルの試薬を加え、ピペットで上下させて十分に混合し、室温で5分間

チューブに150マイクロリットルのクロロホルムを加えて激しく振った後、2〜3分間休ませます。12, 000倍Gで摂氏15度で10分間遠心分離します。遠心分離機からチューブを慎重に取り外し、遠心分離機の温度を摂氏4度に設定します。

透明な水相のみを新しいチューブに移し、不透明な間相を乱さないように注意してください。チューブに残っている溶液を保存するか、廃棄します。100%イソプロピルアルコールを1対2の割合で加え、ピペッティングで上下に動かしてよく混ぜます。

サンプルを室温で10分間休ませて、溶液からRNAを沈殿させます。Gの12,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、すべてのチューブを同じ向きに配置して、ペレットを視覚化しやすくします。遠心分離後、ペレットを乱さないように、チューブを慎重に取り外し、ピペットで上清を取り除きます。

ペレットはゲル状で見づらいため、遠心分離機内のチューブの向きに基づいてペレットがどこにあるかを推定します。すべての上清を取り除いた後、75%エタノールの500マイクロリットルを加え、短時間ボルテックスし、7、500倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを乱さずに、上清を慎重に取り除きます。

キャップを開けたままにして、サンプルを5〜10分間乾燥させます。乾燥したら、ペレットをDNAの自由水に20マイクロリットルでDCNのサンプルに、他のすべてのサンプルに30マイクロリットルで再懸濁します。さらなる分析まで、サンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

このプロトコルは、マウス小脳の4つの異なる領域を解剖し、遺伝子発現の地域差を調査するために使用されました。アルドラーゼC、パルブアルブミン、KCNG4の発現レベルは、リアルタイムの定量的PCRを使用して評価されました。アルドラーゼCは、後小脳虫部でより強く発現します。

しかし、DCNおよび虫癬の前部領域は、大脳郭清と比較すると低くなります。パルブアルブミンは、バルク小脳抽出物と比較した場合、DCN前虫部、後部虫部、半球小脳皮質にも同様に存在します。.KCNG4は、DCNと内部虫部で有意に濃縮されていますが、バルク抽出と比較した場合、後部虫部や半球では濃縮されていません。

小脳皮質全体でのアルドラーゼCの発現を直接比較するために、発現レベルを前虫部と比較しました。アルドラーゼCの発現レベルは、後虫部で有意に高く、小脳半球で高くなる傾向にありました。これらの領域から抽出されたRNAは、RNAシーケンシング、実験にも使用できます。

これらを小脳領域と比較するRNA配列は、これらの領域の根底にある個別の機能である分子メカニズムに関するより詳細な情報を提供します。また、病気に対する脆弱性の潜在的な違いもあります。