Name: アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル卵抽出物を用いた動的細胞質組織のライブイメージング法。FEPテープ処理と蛍光顕微鏡で細胞質の自己組織化と空間パターン形成を可視化し、細胞生物学研究に応用する。

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原稿へのコメントをくださったJ. Kamenz、Y. Chen、W. Y. C. Huangに感謝します。この研究は、ジェームズE.フェレルジュニアに授与された国立衛生研究所(R01 GM110564、P50 GM107615、およびR35 GM131792)からの助成金によってサポートされました。

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1.スライドとカバーガラスの準備
<ol><li>フッ素化エチレンプロピレン(FEP)粘着テープの層をローラーアプリケーターでスライドガラスに貼り付けます。きれいなかみそりの刃で端の余分なテープを切り取ります。同じ方法でFEPテープでコーティングされたカバーガラスを準備します(図1A)。</li>
	<li>両面スティッキーイメージングスペーサーをスライドのFEPテープコーティング面に塗布します。上部の保護ライナーは剥がさずに残しておきます(図1A)。 注意: スライドとカバーガラスは実験の前に準備する必要があります。すぐに使用することも、表面にほこりがたまるのを防ぐために箱に保管することもできます。イメージングスペーサー内のウェルは深さ120μm、直径9mmです。</li>
</ol>2. 間期停止卵抽出物の調製とライブイメージング
注:次のプロトコルは、デミングとコーンブルース19、マレー20、スマイスとニューポート25 から修正を加えて適応されています。すべてのステップは、特に明記されていない限り、室温で実行する必要があります。
<ol><li>採卵の3〜10日前に、成熟した 雌のアフリカツメガエルを 100IUの妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)とともに背側リンパ嚢に皮下注射します。</li>
	<li>計画された採卵の16〜18時間前に、ステップ2.1のカエルに500IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を注射します。産卵バッファー(100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO 4·7H 2 O、2.5 mM CaCl2·2H2O、0.5 mM HEPES、0.1 mM EDTA)にカエルを18°Cで放置し、pH7.4で20倍ストック溶液として調製し、使用前にきれいなカエルタンク水で1倍に希釈してから卵を採取します。</li>
	<li>実験当日、大きなガラスのペトリ皿に卵を集め、卵の品質を評価します。白いふくらんでいるボールのように見える、またはひもで現れる卵はすべて捨てます(図1B)。立体視鏡で卵を調べ、卵を通常の外観に保ち(図1C)、不規則な色素やまだらの色素を含む卵を捨てます(図1D)。 注:このプロトコルは、通常、hCG注射後16時間までに25mLの卵を産む単一のカエルから収集された卵で機能します。通常、hCGによって合計3〜6匹のカエルが誘導され、卵の品質が最も高いカエルが抽出調製実験に選ばれます。</li>
	<li>卵を400 mLのガラスビーカーに移し、デカンテーションによってできるだけ多くの産卵バッファーを取り除きます。</li>
	<li>卵を100 mLの新しく調製したデゼリー溶液(水中で2%w / v L-システイン、NaOHでpH 8.0に調整)でインキュベートし、定期的に穏やかに回転させます。約3分後、溶液を注ぎ、100 mLの新鮮なデゼリー溶液を加えます。卵がしっかりと詰まるまで(卵の間にスペースがなくなるまで)孵卵を続けますが、合計5分以上卵を脱ゼリー溶液に残さないでください。</li>
	<li>デカンテーションによりできるだけ多くの脱ゼリー溶液を除去し、0.25x MMRバッファー(25 mM NaCl、0.5 mM KCl、0.25 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2、0.025 mM EDTA、1.25 mM HEPES、10xストック溶液として調製し、NaOHでpH 7.8に調整し、使用前にMilli-Q水で希釈)で卵を洗浄します。 卵を渦巻いてから、バッファーを注ぎます。合計1 Lのバッファーが洗浄に使用されるまで、数回繰り返します。</li>
	<li>合計400 mLの卵溶解バッファー(250 mMスクロース、10 mM HEPES、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、1 mM DTT、新鮮にし、KOHでpH 7.7に調整)で卵を数回洗浄します。洗浄の合間にパスツールピペットを使用して異常な外観の卵を取り除きます。 注:異常な外観の卵とは、白いふくらんでいるボールのように見える卵(図1B)、まだらの色素沈着(図1D)、白い領域の成長とともに悪化している卵(図1E)、または動物半球の黒ずみと収縮した色素沈着領域を示す卵を指します(図1F)。</li>
	<li>先端を大きく開いたトランスファーピペットを使用して、卵溶解バッファー17 mLが入った1 mLの丸底遠心チューブに卵を移します。チューブを400 x g の臨床遠心分離機で15秒間回転させて、卵を詰めます。</li>
	<li>パスツールピペットを使用して、パックされた卵の上部からできるだけ多くの卵溶解バッファーを取り除きます。 注:卵抽出物の希釈を最小限に抑えるために、パックされた卵からできるだけ多くのバッファーを除去することが重要です。これを達成するために、残留緩衝液と一緒にいくつかの緩い卵を取り除く必要がある場合があります。</li>
	<li>パックされた卵のおおよその容量を決定し、5 μg / mLのアプロチニン、5 μg / mLのロイペプチン、5 μg / mLのサイトカラシンB、および50 μg / mLのシクロヘキシミドをパックされた卵の上に直接加えます。 注:アプロチニンとロイペプチンはプロテアーゼ阻害剤です。サイトカラシンBはアクチン重合を阻害し、抽出物が収縮およびゲル化するのを防ぐ26。シクロヘキシミドはタンパク質合成を阻害し、それによって抽出物を細胞周期の間期に保ちます。</li>
	<li>チューブを12,000 x g、4°Cで15分間、スイングバケットローターで遠心分離して卵を粉砕します。 注:遠心分離の終わりに、卵は破裂し、溶解物は3つの主要な層に分離しているはずです:上部の黄色の脂質層、中央の細胞質抽出物(粗抽出物とも呼ばれます)、および下部の色素顆粒を含む暗く濃い層(図1G)。</li>
	<li>18ゲージの針を注射器に取り付けます。針先ベベルを上に向けて、細胞質層の下部にある側からチューブを穿刺し、ゆっくりと描画して抽出物を回収します。 注:黄色の脂質層からの汚染含有量が含まれないように、細胞質抽出物をゆっくりと描画します。</li>
	<li>回収した細胞質抽出物を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保持します。1時間以内に抽出物を使用してください。</li>
	<li>イメージングの準備ができたら、抽出液に目的の試薬と蛍光イメージングプローブを補充します。 注:蛍光イメージングプローブは、特定の細胞質構造を標識して、蛍光顕微鏡で視覚化できるようにします。</li>
	<li>ステップ1.2で準備したスライドのイメージングスペーサーから上部保護ライナーを取り外し、ウェルの中央に約7 μLの抽出物を堆積させます。FEP側を抽出物に向けてFEPテープでコーティングされたカバーガラスをすぐに適用し、ウェルを密封します。すぐにイメージングに進みます(図1H、I)。</li>
	<li>電動ステージとデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡または正立顕微鏡にスライドをセットします。明視野チャンネルと蛍光チャンネルの両方で、目的の空間位置と時間間隔で抽出液を画像化します。 注:通常、5倍の対物レンズがイメージングに使用されます。電動ステージにより、複数の定義された空間位置での自動画像取得が可能です。明視野顕微鏡は、さまざまな透明度で細胞質構造を視覚化します。蛍光顕微鏡は、ステップ2.14で追加した蛍光イメージングプローブによって特異的に標識された細胞質構造を視覚化します。カメラはこれらの構造のタイムラプス画像を記録し、それによって細胞質組織のダイナミクスをキャプチャします。</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

アフリカツメガエル卵抽出物は、さまざまな細胞内構造10、14、15、16、17、18、21、31、32、33、34、35、36および細胞質組織全体のイメージングベースの研究のための強力なモデルシステムとして浮上しています。<sup class...

細胞質は細胞の主要な体積を構成し、明確な組織を持っています。真核生物の細胞質の成分は、微小管アスターやゴルジ体装置などの幅広い空間構造に自己組織化することができ、細胞の同一性や生理状態に応じて動的に配置され、ひっくり返されます。したがって、細胞質の空間構成と細胞機能へのリンクを理解することは、細胞がどのように機能するかを理解するために重要です。アフリカツメガエル卵抽出物は、伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきました1,2,3,4,5,6,7,8、しかし最近の研究は、細胞質構造とその細胞機能の機構研究のための強力なライブイメージングシステムとして確立されています9,10,11、 12,13,14,15,16,17,18。これらの希釈されていない抽出物は、細胞質の多くの構造と機能を保存する一方で、従来の細胞ベースのモデルでは達成できなかった細胞質内容物の直接操作を可能にします19,20。これにより、細胞質現象を特徴付け、その機構的基盤を解剖するのに理想的です。
抽出物をイメージングするための既存の方法は、化学的表面修飾、またはマイクロ流体デバイスの製造を必要とします。カバーガラスベースの方法の1つは、ガラスカバーガラス21のポリエチレングリコール(PEG)パッシベーションを必要とする。マイクロエマルジョンベースの方法では、ガラス表面22,23へのトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着が必要です。マイクロ流体ベースのシステムは、抽出液滴の量、形状および組成の正確な制御を可能にするが、特殊な微細加工設備を必要とする11、12、24。
ここでは、実施が容易で、容易に入手可能で低コストの材料を利用する卵抽出物のイメージングの代替方法を紹介します。これには、スライドとフッ素化エチレンプロピレン(FEP)テープでコーティングされたカバーガラスを備えたイメージングチャンバーの準備が含まれます。このチャンバーは、ステレオスコープや正立顕微鏡、倒立顕微鏡など、さまざまな顕微鏡システムで抽出物をイメージングするために使用できます。この方法は、表面の化学的処理を必要とせず、上記の既存のガラスベースの方法で得られるのと同様の光学的透明度を達成します。これは、2Dフィールド全体で均一な厚さの抽出物の層を画像化するように設計されており、3Dボリュームの抽出物を画像化するために簡単に拡張できます。広い視野にわたる集団細胞質挙動のタイムラプスイメージングに適しています。
我々は、イメージング方法を実証するために、間期停止卵抽出物を使用しました。抽出物の調製は、デミングおよびコーンブルース19のプロトコルに従います。簡単に言えば、減数分裂IIの中期に自然に停止した卵は、低速スピンによって押しつぶされます。このスピンは細胞質を減数分裂停止から解放し、抽出物が間期に進むことを可能にします。通常、サイトカラシンBは、F-アクチン形成を阻害するために、破砕スピンの前に添加される。但し、F-アクチンを希望する場合は省略することができる。シクロヘキシミドは、間期抽出物が次の有糸分裂に入るのを防ぐために、粉砕スピンの前にも添加されます。続いて、抽出物を前述のイメージングチャンバーに入れ、顕微鏡上に配置します。最後に、顕微鏡に接続されたカメラによって定義された間隔で画像が経時的に記録され、2Dフィールドでの抽出物の動的挙動をキャプチャするタイムラプス画像シリーズが生成されます。

<table><tbody><tr><td>17 ml遠心分離管</td><td>ベックマンコールター</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm正方形#1カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>10236624001</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr>シ<tr><td>クロヘキシミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>01810</td><td>タンパク質合成阻害剤</td></tr><tr><td>サイトカラシンB</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C6762</td><td>アクチン重合阻害剤</td></tr><tr><td>雌Xenopus laevis カエル</td><td>Nasco</td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent HiLyte 488 標識チューブリンタンパク質</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>微小管細胞骨格の可視化用</td></tr><tr><td>Fluorescent HiLyte 647 標識チューブリンタンパク質</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>微小管細胞骨格の視覚化用</td></tr><tr><td>フッ素化エチレンプロピレン(FEP) 光学的に透明なテープ</td><td>CS ハイド社</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG)</td> <td>ミリポアシグマ</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>イメージングスペーサー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>11017101001</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>ミリポアシグマ</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M7512</td><td>ミトコンドリアの視覚化用</td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン (PMSG)</td><td>BioVendor</td><td>RP1782725000</td><td></td></tr><tr><td>ローラーアプリケーター</td><td>Amazon</td><td>B07HMBJSP8</td><td>スライドガラスやカバースリップにFEPテープを貼る</td></tr><tr><td>片刃カミソリの刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-640</td><td>余分なFEPテープの取り外し用</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきた アフリカツメガエル 卵抽出物は、細胞質分裂、有糸分裂紡錘体形成、核の組み立てなどの細胞質現象を研究するための強力なイメージングベースのツールとして登場しています。まばらな時点でサンプリングされた固定抽出物を画像化する初期の方法に基づいて構築され、最近のアプローチは、タイムラプス顕微鏡を使用してライブ抽出を画像化し、時間分解能を高めてより動的な特徴を明らかにします。これらの方法は、通常、イメージング容器の高度な表面処理を必要とする。ここでは、化学的表面処理を必要としない卵抽出物のライブイメージングの代替方法を紹介します。実装が簡単で、大量生産された実験用消耗品をイメージングに利用します。広視野顕微鏡と共焦点顕微鏡の両方に使用できるシステムについて説明します。2次元(2D)フィールドでの抽出物のイメージング用に設計されていますが、3Dでのイメージングに簡単に拡張できます。細胞質内の空間パターン形成の研究に適しています。代表的なデータを使用して、この方法を使用して調製された間期抽出物における微小管、核、ミトコンドリアの典型的な動的組織を示します。これらの画像データは、細胞質動態や空間構成に関する定量的な情報を提供することができます。

アフリカツメガエル卵抽出物は、間期中の細胞質の自己組織化を研究するために使用することができる。図2Aは、成功した実験の結果を示しています。間期間核の再構成と可視化を可能にするために、アフリカツメガエル精子核19を27核/μLの濃度で、0.38 μMの精製GST-GFP-NLS 27,28,29,30(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、および核局在配列からなる融合タンパク質)を添加しました。また、微小管を可視化するために1 μM蛍光標識チューブリンを、ミトコンドリアを可視化するために500 nM MitoTracker Red CMXRosを追加しました。...

アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

この方法は、カエルの卵抽出物を用いた細胞質動態のライブイメージングに適しており、細胞質内の空間パターン情報の研究を可能にします。サンプルは、均一で調整可能な厚さの層に成形し、2Dフィールドまたは3Dボリュームにわたって画像化することができます。この方法は費用効果が高く、実装も簡単です。ローラーアプリケーターでスライドガラスにFEP粘着テープの層を塗布することから始めます。きれいなかみそりの刃で端の余分なテープを切り取ります。次に、FEPテープでコーティングされたカバースリップを同じ方法で準備します。次に、両面粘着性イメージングスペーサーをスライドのFEPテープコーティングされた側に適用し、保護ライナーを剥がさないようにします。卵を400ミリリットルのガラスビーカーに移し、デカントしてできるだけ多くの産卵バッファーを取り除きます。次に、100ミリリットルの新たに調製したデゼリー溶液で卵をインキュベートし、穏やかに回転させます。約3分後、溶液を注ぎ、100ミリリットルの新鮮なデゼリー溶液を加えます。卵がしっかりと詰まるまで孵卵を続けますが、合計5分以上卵を脱ゼリー溶液に残さないでください。インキュベーション後、脱ゼリー溶液をできるだけ取り除き、0.25倍のMMRバッファーで卵を洗います。卵を渦巻き、バッファーを注ぎます。合計1リットルのバッファーが洗浄に使用されるまで、数回繰り返します。次に、合計400ミリリットルの卵溶解バッファーで卵を数回洗浄し、洗浄の間に異常な卵を取り除きます。次に、先端が広いトランスファーピペットを使用して、1ミリリットルの卵溶解バッファーを含む17ミリリットルの丸底遠心チューブに卵を移します。チューブを400 gの臨床用遠心分離機で15秒間回転させて、卵を詰めます。次に、パスツールピペットを使用してできるだけ多くの卵溶解バッファーを除去します。パックされた卵のおおよその量を決定します。次に、アプロチニン、ロイペプチン、サイトカラシンBをそれぞれ1ミリリットルあたり5マイクログラム、シクロヘキサミドを1ミリリットルあたり50マイクログラムをパックされた卵の上に直接加えます。スイングバケットローターで12, 000 g、摂氏4度でチューブを15分間遠心分離して卵を粉砕します。次に、18ゲージの針を注射器に取り付けます。針先ベベルを上に向けて、細胞質層の下部にある側からチューブを穿刺し、ゆっくりと描画して抽出物を回収します。回収した細胞質抽出物を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保管します。イメージングの準備ができたら、目的の試薬と蛍光イメージングプローブを抽出物に補充します。準備したスライドのイメージングスペーサーから上部の保護ライナーを取り外し、ウェルの中央に約7マイクロリットルの抽出物を堆積させます。FEP側を抽出物に向けてFEPテープでコーティングされたカバースリップをすぐに適用してウェルを密閉し、すぐにイメージングに進みます。電動ステージとデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡または正立顕微鏡にスライドをセットします。明視野チャンネルと蛍光チャンネルの両方で時間間隔で目的の空間位置で抽出液を画像化します。アフリカツメガエル卵抽出物を使用して、間期中の細胞質の自己組織化を研究するタイムラプス実験をここに示します。室温で約20分間インキュベートした後、光散乱細胞質成分が枯渇した領域は、明視野チャネルおよびミトコンドリアチャネルの両方で可視であった。室温で約60分までに、細胞状の区画からなる空間パターンが十分に確立され、微小管が中空の花輪のような構造を形成し、ミトコンドリアが各区画に明確に仕切られるはずです。ここでは、ガラス上のFEPテープを使用した場合と使用しない場合のイメージングチャンバーでの抽出性能の比較を示します。FEPテープガラスで作られたチャンバー内で、抽出物は正常な細胞様パターンに自己組織化しました。ガラス表面がFEPテープで覆われていないチャンバーでは、抽出物は異常な明視野と微小管パターンを示し、時間の経過とともにますます破壊されました。GST-mCherry-NLSタンパク質の核内輸入に有意差は観察されなかった。覚えておくべき重要なことは、FEPテープでガラス表面を不動態化し、抽出物の調製中にすべての悪い卵を取り除くことです。このシステムでは、抽出サンプルの厚さを簡単に制御でき、ライトシート顕微鏡を使用して細胞質パターンを3Dでイメージングする道が開かれます。

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生物学

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ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

学ぶアフリカツメガエル卵抽出物を用いた動的細胞質組織のライブイメージング法。FEPテープ処理と蛍光顕微鏡で細胞質の自己組織化と空間パターン形成を可視化し、細胞生物学研究に応用する。

アフリカツメガエル動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

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