アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法
2021年6月6日
アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。
この方法は、カエルの卵抽出物を用いた細胞質動態のライブイメージングに適しており、細胞質内の空間パターン情報の研究を可能にします。サンプルは、均一で調整可能な厚さの層に成形し、2Dフィールドまたは3Dボリュームにわたって画像化することができます。この方法は費用効果が高く、実装も簡単です。
ローラーアプリケーターでスライドガラスにFEP粘着テープの層を塗布することから始めます。きれいなかみそりの刃で端の余分なテープを切り取ります。次に、FEPテープでコーティングされたカバースリップを同じ方法で準備します。
次に、両面粘着性イメージングスペーサーをスライドのFEPテープコーティングされた側に適用し、保護ライナーを剥がさないようにします。卵を400ミリリットルのガラスビーカーに移し、デカントしてできるだけ多くの産卵バッファーを取り除きます。次に、100ミリリットルの新たに調製したデゼリー溶液で卵をインキュベートし、穏やかに回転させます。
約3分後、溶液を注ぎ、100ミリリットルの新鮮なデゼリー溶液を加えます。卵がしっかりと詰まるまで孵卵を続けますが、合計5分以上卵を脱ゼリー溶液に残さないでください。インキュベーション後、脱ゼリー溶液をできるだけ取り除き、0.25倍のMMRバッファーで卵を洗います。
卵を渦巻き、バッファーを注ぎます。合計1リットルのバッファーが洗浄に使用されるまで、数回繰り返します。次に、合計400ミリリットルの卵溶解バッファーで卵を数回洗浄し、洗浄の間に異常な卵を取り除きます。
次に、先端が広いトランスファーピペットを使用して、1ミリリットルの卵溶解バッファーを含む17ミリリットルの丸底遠心チューブに卵を移します。チューブを400 gの臨床用遠心分離機で15秒間回転させて、卵を詰めます。次に、パスツールピペットを使用してできるだけ多くの卵溶解バッファーを除去します。
パックされた卵のおおよその量を決定します。次に、アプロチニン、ロイペプチン、サイトカラシンBをそれぞれ1ミリリットルあたり5マイクログラム、シクロヘキサミドを1ミリリットルあたり50マイクログラムをパックされた卵の上に直接加えます。スイングバケットローターで12, 000 g、摂氏4度でチューブを15分間遠心分離して卵を粉砕します。
次に、18ゲージの針を注射器に取り付けます。針先ベベルを上に向けて、細胞質層の下部にある側からチューブを穿刺し、ゆっくりと描画して抽出物を回収します。回収した細胞質抽出物を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保管します。
イメージングの準備ができたら、目的の試薬と蛍光イメージングプローブを抽出物に補充します。準備したスライドのイメージングスペーサーから上部の保護ライナーを取り外し、ウェルの中央に約7マイクロリットルの抽出物を堆積させます。FEP側を抽出物に向けてFEPテープでコーティングされたカバースリップをすぐに適用してウェルを密閉し、すぐにイメージングに進みます。
電動ステージとデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡または正立顕微鏡にスライドをセットします。明視野チャンネルと蛍光チャンネルの両方で時間間隔で目的の空間位置で抽出液を画像化します。アフリカツメガエル卵抽出物を使用して、間期中の細胞質の自己組織化を研究するタイムラプス実験をここに示します。
室温で約20分間インキュベートした後、光散乱細胞質成分が枯渇した領域は、明視野チャネルおよびミトコンドリアチャネルの両方で可視であった。室温で約60分までに、細胞状の区画からなる空間パターンが十分に確立され、微小管が中空の花輪のような構造を形成し、ミトコンドリアが各区画に明確に仕切られるはずです。ここでは、ガラス上のFEPテープを使用した場合と使用しない場合のイメージングチャンバーでの抽出性能の比較を示します。
FEPテープガラスで作られたチャンバー内で、抽出物は正常な細胞様パターンに自己組織化しました。ガラス表面がFEPテープで覆われていないチャンバーでは、抽出物は異常な明視野と微小管パターンを示し、時間の経過とともにますます破壊されました。GST-mCherry-NLSタンパク質の核内輸入に有意差は観察されなかった。
覚えておくべき重要なことは、FEPテープでガラス表面を不動態化し、抽出物の調製中にすべての悪い卵を取り除くことです。このシステムでは、抽出サンプルの厚さを簡単に制御でき、ライトシート顕微鏡を使用して細胞質パターンを3Dでイメージングする道が開かれます。
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概要
本研究では、Xenopus laevis卵から希釈していない細胞質抽出液を調製し、ライブイメージングを行うための効率的な手法を提示します。この技術により、細胞質のダイナミクスや細胞質内における空間パターンの形成を観察することが可能となり、細胞組織化に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- 顕微鏡法
- 発生生物学
背景
- 細胞質ダイナミクスは、細胞組織を理解する上で極めて重要です。
- カエルの卵から抽出した抽出物は、これらのプロセスを研究するための適切なシステムを提供します。
- ライブイメージング技術により、細胞質における空間パターニングの探索が進展しています。
使用した手法
- Xenopus laevis卵からの未希釈細胞質抽出液の調製。
- イメージング中のサンプル安定性のためのFEPテープの使用。
- 蛍光マーカーと明視野顕微鏡を用いたライブイメージング。
主要な結果
- 細胞質抽出液における自己組織化の経時的な可視化に成功した。
- 明確な微小管構造を持つ細胞様コンパートメントを構築した。
- 表面処理に基づくイメージング性能の比較により、抽出液の組織化に有意な影響があることが示された。
結論
- 本研究では、細胞質構造およびそのダイナミクスをイメージングするための実用的な方法を概説します。
- 得られた知見は、細胞プロセスの理解を深め、調製技術の重要性を強調するものです。
よくある質問
業界への実用的な関連性
本手法は、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵抽出液における細胞質ダイナミクスのライブイメージングを可能にし、細胞組織化に関連する空間的なパターン形成および自己組織化プロセスの研究のための、拡張性とコスト効率に優れたシステムを提供します。化学的な表面処理を不要にし、量産された消耗品を利用することで、制御されたin vitro環境における微小管、核、およびミトコンドリア組織の再現性の高い高解像度可視化をサポートします。このアプローチは、細胞質挙動のメカニズム研究における予測の信頼性を高め、創薬パイプラインにおける初期段階のターゲットバリデーションおよびアッセイ開発を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的活用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：細胞質での自己組織化および空間的なパターニング機構に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：生理学的に適切な抽出系において細胞質の動的な組織化を可視化することで、生物学的なリスク低減を支援する。
- トランスレーショナルバイオマーカー：機能的な細胞状態と相関する可能性のある細胞質の動的特性の特定を促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの標準化：FEPテープによるパッシベーションを用いることで、均一な厚さと安定性を備えた抽出液を調製するための再現可能なプラットフォームを提供します。
- 定量的出力：タイムラプス明視野および蛍光イメージングを通じて、細胞質のダイナミクスと空間的組織化の測定を可能にします。
- スクリーニングへの適応性：化合物による効果の評価に適した、広視野および共焦点顕微鏡と互換性のある、拡張可能で低コストなシステムを提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患関連システム：細胞分裂および細胞組織化に関連する保存された細胞質プロセスの研究のためのメカニズムモデルとして機能する。
- 予測の信頼性：抽出液の自己組織化を直接可視化することで、細胞骨格調節および空間パターニングに関与するターゲットのリスク低減を支援する。
- トランスレーショナルな連続性：一貫性のあるイメージング可能な細胞質モデルを確立することで、発見段階の観察結果と前臨床検証を橋渡しする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲット仮説の検証からアッセイの開発、そして前臨床バリデーションに至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、特に細胞骨格のダイナミクスや細胞内組織化に影響を与えるターゲットに適しています。
- 発見生物学： 間期抽出液における微小管およびミトコンドリアのダイナミクスの直接的な可視化を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 標準化された抽出液調製と、化学的な表面処理を必要としない安定したイメージング条件により、アッセイの即時導入を実現します。
- 分析： 細胞質組織に関する定量的な空間的・時間的データを生成し、異なる条件下での比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 保存された細胞組織化プロセスを研究するための一定のモデルを提供し、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用： 複数のターゲットやスクリーニングキャンペーンに適応可能な、再利用可能で低コストなイメージングプラットフォームを確立します。
運用的および企業的な影響
- 科学的価値：細胞質組織化研究におけるメカニズムの曖昧さを低減し、ターゲットバリデーションの予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：標準化された抽出液調製とFEPテープによる表面パッシベーションにより、再現性とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値：細胞質のダイナミクスに対する表現型への影響を早期に可視化することで、Go/No-go判断の質を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：細胞組織に影響を与える化合物のメカニズムに関する知見を提供し、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の注意点
- Xenopus卵の取り扱い、抽出液の調製、およびライブイメージング技術に関する専門知識が必要です。
- 遠心分離機、顕微鏡システム（ワイドフィールド/共焦点）、およびFEP粘着テープとイメージング用スペーサーへのアクセスに依存します。
- 卵の洗浄、除ゼリー処理、および抽出液回収プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 3Dイメージングへの適応には、ライトシート顕微鏡との統合や、試料厚さ制御の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、卵の品質への感受性があり、抽出液の均一性を確保するために調製中に異常な卵を除去する必要があります。
