Name: タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶマウス3T3-L1脂肪細胞への逆トランスフェクション法。siRNAやmiRNAを用いてタンパク質発現を操作し、インスリンシグナルやグルコース取り込みなどの機能解析を行う効率的な手法です。

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この研究は、将来の優秀研究所(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)とイニシアティブ・オブ・エクセレンス(アイデックス・UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)を通じて、INSERM、コート・ダジュール大学、フランス国立研究機関(ANR)によって支援されました。J.J.は、ソシエテ・フランコフォン・デュ・ディアベテ(SFD)、フランソワーズ・デチュード・エ・ド・レシェルシュ・シュル・ロベシテ(AFERO)、テマティク・マルチ・オーガミーズ・テクノロジーズ・インスティトゥート・ド・サンテ(ITMO)、フォンダシオン・ベンジャミン・デレッサーの助成金を受けています。J.G.はANR-18-CE14-0035-01でサポートされています。J-F.T.はANRグラントADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01とフォンダシオンからの助成金は、ラ・レシェルシュ・メディカル(エクイペFRM、DEQ20180839587)によってサポートされています。また、コンセイル・デ・アルプ・マリティームが出資するC3Mのイメージング・コア・ファシリティと、GIS IBiSA顕微鏡・イメージング・プラットフォームコート・ダジュール(MICA)が支援するレジオンPACAに感謝します。

注: 滅菌技術を使用して、層流細胞培養フード内のプロトコルのすべてのステップを実行します。すべての試薬および装置の詳細については、 資料表 を参照してください。
1. 腺3T3-L1線維芽細胞のアディポ細胞への分化
<ol><li>3T3-L1線維芽細胞を、ピルビン酸を含まない培地DMEM、25mMグルコース、10%新生児の子牛血清、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む培地中のDMEMで3T3-L1の繊維芽細胞を成長させる(図1A)。培養インキュベーター(7%CO2および37°C)に皿を入れる。</li>
	<li>合流から2日後、 培地を変更し、ピルビン酸なしDMEM、25mMグルコース、10%の胎児血清(FCS)、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンに0.25 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.25 μMデキサメタゾン、5 μg/mL、インスリンスキタゾン、インスリンスライト10を補充した。 注:細胞が100 mm皿あたり30万個の細胞で播種されると、合流するまでに5日かかります。</li>
	<li>2日後、培養液をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン1%に5μg/mLインスリンと10μMロシグリタゾンとインキュベートを2日間補充してDMEMに置き換えます。次いで、2日毎にピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(図1B)で細胞を供給する。</li>
	<li>分化プロトコルの開始から7-8日後に3T3-L1のアディポサイトをトランスフェクトする。 注:トランスフェクション後に残りの線維芽細胞の増殖を避けるために、トランスフェクションの前に高いレベルの分化(>80%)に到達することが重要であり、結果に偏る可能性のある細胞の混合集団につながる可能性があります。</li>
</ol>2. プレコートプレートの準備
<ol><li>トランスフェクションの前日または数時間前に、1mg/mLのストック溶液から30%エタノールで100μg/mLのコラーゲンタイプIの溶液を調製します。12ウェルプレートのウェルあたり250μL、24ウェルプレートのウェルあたり125 μLを加え、ウェルの表面に溶液を広げます。</li>
	<li>コラーゲンが乾くまで、培養フードの下に蓋をせずにプレートを放置します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分(D-PBS)で2回洗浄します。 注:プレコーティングされたプレートは購入可能です。</li>
</ol>3. トランスフェクションミックスの調製
注: siRNA の最終的な濃度は 1 ~ 100 nM (12 ウェル プレートのウェルあたり 1 ~ 100 pmol siRNA) です。miRの模倣の最終的な集中は10 nM(10 pmol/well)である。実験を開始する前に、各siRNA、miR模倣、または他のオリゴヌクレオチドの最適な濃度を決定し、オフターゲット効果を回避します。結果の統計分析を容易にするために三重でトランスフェクション実験を行います。ピペット処理中の通常の損失を考慮して、過剰に全ての試薬を準備してください。
<ol><li>改善された最小必須培地(表1)とsiRNA(または他のオリゴヌクレオチド)をピペッティング(体積/体積)で混合する。室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>トランスフェクション試薬と改良された最小必須培地をsiRNAに加え、ミキシングするピペットを加える(表1)。室温で20分間インキュベートします(この間、セクション4に進みます)。コラーゲンコーティングされたプレートの各ウェルにトランスフェクションミックスを追加します。</li>
</ol>4. 3T3-L1のアディポサイトの調製
<ol><li>100mmペトリ皿の細胞をD-PBSで2回洗います。5倍のトリプシンを細胞に加え(100mm皿あたり1mL)、すべての表面をトリプシンで覆うことを確認します。30 s を待ち、慎重にトリプシンを取り外します。</li>
	<li>ペトリ皿をインキュベーターで37°Cで5〜10分間インキュベートします。100mm皿をタップしてセルを取り外します。</li>
	<li>ピルビン酸なしのDMEM10ml、25mMグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えてトリプシンを中和します。慎重に上下に培地をパイプし、細胞を取り外し、細胞懸濁液を均質化します。</li>
	<li>マラッセス計房または自動セルカウンターを使用して細胞を数え、培地の6.25 x 105 細胞/mLに細胞の濃度を調整します。12ウェルプレート(5 x105 細胞)またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレート(2.5 x105 細胞)の細胞懸濁液/ウェルの800μLの種子。 注:アディポサイトの100ミリメートルペトリ皿は、12ウェルプレートまたは1つの24ウェルプレートの調製を可能にします。100 mm皿は通常6-7 x 106 のアディポサイトを含み、12ウェルプレートのウェルあたり5 x 105 のアディポサイトに相当する。</li>
	<li>プレートを細胞培養インキュベーター(7%CO2および37°C)にインキュベートし、24時間細胞を乱さない。翌日は、上清をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを使用せずに、新鮮なDMEMに慎重に交換してください。 注:また、コラーゲンプレコーティング48-および96ウェルプレートに細胞を播種することも可能ですが、アディサイトの剥離を避けるためにメディアを交換する際に、より多くの予防措置を取ります。</li>
</ol>5. トランスフェクト3T3-L1の異胞細胞の機能解析
<ol><li>mRNAおよびタンパク質に対するsiRNAまたはmiR模倣送達後の24-48時間および48-96時間の標的ノックダウンをそれぞれ研究した。</li>
	<li>トランスフェクトされた脂肪細胞の機能解析を行い、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、アディポカイン分泌、脂肪分解、およびリポジェネシスを研究する。</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本論文では、成熟したアディポサイトの分化とトランスフェクションに関する詳細なプロトコルを紹介する。この逆トランスフェクション法は、トランスフェクトが最も困難な細胞株の1つである3T3-L1アディポサイトにsiRNA、マイクロRNA模倣、および抗マイクロRNAのようなオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法である。この方法には、考慮する必要があるいくつかの制限があります。このプロトコルは、機能獲得研究のためにこの技術の有用性を制限するプラスミドDNAによるトランスフェクションには有効ではありません。3T3-L1細胞株を含むマウス細胞株は、通常、インビトロでの有分細胞機能を研究するために使用されてきたが、マウス組織におけるマイクロRNA発現パターンおよび活動はしばしばヒトで観察されるものとは異なる。これは、プライマリ セルとセル ラインにも当てはまりやすいです。さらに、3T3-L1線維芽細胞を脂肪細胞に分化するために使用される培地には、生理学的なホルモンカクテル(インスリン、デキサメタゾン、IBMX、およびロシグリタゾン)が必要であり、分化した細胞は生体内の成熟した脂肪細胞と形態的に区別され、単ロ黄色の脂質滴の代...

肥満は、インスリン抵抗性(IR)、2型糖尿病(T2D)、および心血管疾患1を含む多数の代謝性疾患の主要な危険因子と考えられている。現在の治療法は、これらの疾患の絶えず増加する有病率を止めることができず、肥満および糖尿病患者のIRの管理は依然として重要な臨床的問題である。脂肪組織は、エネルギー恒常性の制御に重要な役割を果たし、肥満時のその病理学的拡張は、IRおよびT2D2、3の発達に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。多くの研究は、アディポサイト生理学におけるタンパク質コードRNAの役割と肥満との関連を調査してきました。
最近では、非コードRNA(ncRNA)、特にマイクロRNA(miRs)の発見は、遺伝子発現プログラムの調節機構に関連する新しい概念を偽造している。研究は、ncRNAが、有数細胞細胞機能の重要な調節因子であり、その調節不調が代謝性疾患において重要な役割を果たしていることを示している。したがって、アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの操作は、アディポサイト機能におけるそれらの役割とT2Dなどの病理への影響を解読するために重要である。しかし、生体内および一次アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの発現を操作することは依然として非常に困難であり、体外の椎骨細胞モデルの使用を支持する。
Mtune 3T3-L1線維芽細胞は、脂肪細胞機能(例えば、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪分解および脂肪分泌)5、6、7、8、9、10を研究するために使用される十分に特徴付けられる細胞株である成熟した、機能的、およびインスリン応答性脂肪細胞に容易に分化する。これらの特性は、3T3-L1アディポサイトを、タンパク質コードおよびnc-RNAの発現を調節し、有分細胞機能におけるその役割と肥満関連疾患における潜在的な役割を解読する魅力的なモデルにする。残念ながら、3T3-L1線維芽細胞は市販の試薬を使用してトランスフェクトしやすいのに対し、分化された3T3-L1アディポサイトはトランスフェクトするのが最も困難な細胞株の1つである。このため、3T3-L1細胞における遺伝子発現を操作する数多くの研究が、アディポサイト機能ではなく、アディポサイト分化に焦点を当てています。
長い間、アディポ細胞をトランスフェクトする唯一の効率的な技術はエレクトロポレーション5であり、これは退屈で高価であり、細胞損傷を引き起こす可能性があります。本論文では、トランスフェクションの実用時間を短縮する一般的なトランスフェクション試薬を用いた逆トランスフェクション技術を報告し、細胞の生存率に影響を及ぼさないため、エレクトロポレーションよりもはるかに安価である。このプロトコルは、マイクロRNA模倣(miR模倣)および抗miRsのようなsiRNAおよび他のオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに完全に適している。逆トランスフェクションプロトコルの原理は、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドをインキュベートして細胞培養プレートに複合体を形成し、成熟したアディポサイトをウェルに播種する。次いで、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で接着板表面に再び付着する。このシンプルで効率的で安価な方法論は、有数体細胞機能におけるタンパク質コードRNAおよびmiRの役割と肥満関連疾患におけるその潜在的な役割の研究を可能にする。

<table><tbody><tr><td>12 ウェル組織培養プレート</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2.5% トリプシン (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>D-PBS で 5x に希釈</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell 非ターゲティング プール</td><td>ホライゾン ディスカバリー</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>子牛の皮膚からのI型コラーゲン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ギブコ</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&nbsp;Modified Eagles's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4.5 g/L D-グルコース;L-グルタミン;ピルビン酸なし</td></tr><tr><td>、エタノール</td>、<td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr>、<tr><td>FAM標識、ネガティブコントロール、si-RNA</td>、<td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr>、<tr><td>ウシ胎児血清</td><td>、Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr>、<tr><td>遊離グリセロール試薬</td><td>、Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr>、<tr><td>グリセロール標準液</td><td>、Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr>、<tr><td>HSP90抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc-131119</td><td>希釈率 : 0.5 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Human Recombinant</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA mimics</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primerアッセイ Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript プライマーアッセイ Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR グリーン PCR キット</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>新生児用ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus マウス Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>HorizonDiscovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペリリピン-1抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3470</td><td>希釈 : 1/1000</td></tr><tr><td>ペトリ皿 100 mm x 20 mm</td><td>ダッチャー</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9272</td><td>希釈 : 1/1000</td></tr><tr><td>PKB リン酸化 Thr308 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9275</td><td>希釈 : 1/1000</td></tr><tr><td>ロシグリタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬 (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&α;-tubulin antibody</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>希釈 : 0.5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB5136</td><td>希釈率 : 0.1 & マイクロ;グラム/mL</td></tr></tbody></table>

タンパク質とマイクロrna変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

アディポサイト機能の変化は、2型糖尿病およびインスリン抵抗性を含む代謝性疾患の病因に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。アディポサイトにおけるタンパク質および マイクロRNAの 発現を調節することは、依然として非常に困難である。本論文では、マウス線維芽細胞を成熟したアディポ細胞に分化し、小干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA模倣(miR模倣)オリゴヌクレオチドを用いた逆トランスフェクションを通じて成熟したアディポ細胞におけるタンパク質およびマイクロRNAの発現を調節するプロトコルについて述べている。この逆トランスフェクションプロトコルは、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドのインキュベーションを含み、成熟したアディポサイトが添加される細胞培養プレートに複合体を形成する。次に、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で、接着板表面に再び付着させられます。インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解の研究などの機能解析を、トランスフェクトした3T3-L1成熟脂肪細胞に対して行い、脂肪細胞機能に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができます。

3T3-L1アディポサイトにおけるタンパク質またはマイクロRNAの発現を調節するためにここで説明する逆トランスフェクションの手順を用いて、このアディポサイトはトランスフェクション後にそれらの形態を維持することが示されている(図1B、C)。実際、トランスフェクションの2日後、脂肪細胞は、プレートに良好に広がり、結合し、成熟した3T3-L1脂肪細胞の特徴である多発性脂質滴を提示した。脂質含有量は、トランスフェクトと非トランスフェクト脂肪細胞の間で異ならなかった(図1D、E)。また、 ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ2(Pparγ2)、アディポネクチン(Adipoq)、グルコーストランスポーター4または溶質キャリアファミリー2メンバー4(Slc2a4)、インスリン受容体基質1(Irs1)、ペリリピン-...

ここでは、小干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA模倣体(miRs)、抗マイクロRNA(抗miR)などのオリゴヌクレオチドを成熟したアディポサイトに送達し、タンパク質およびマイクロRNA発現を調節するプロトコルを紹介します。

タンパク質とマイクロRNA変調がアディポサイト機能に及ぼす影響を研究するアディポサイト細胞培養モデル

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

このプロトコルは、分化されたアディポサイトにおけるタンパク質、またはマイクロRNA発現を操作して、アディポ細胞機能におけるその役割を研究することを可能にする。この逆トランスフェクション法は、オリゴヌクレオチドをマウス3T3-L1アディポサイトにトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法です。この方法は、アディポサイトに分化したヒトの前読細胞にも適用できる。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者メラニー・ゴードフリンです。ピルビン酸なしDMEMの100ミリメートルの皿で3T3-L1線維芽細胞を成長させます, 25 ミリモルグルコース, 10% 新生児子牛血清, ペニシリンとストレプトマイシン.37°Cと7%の二酸化炭素で組織培養インキュベーターに料理を置きます。合流の2日後、培養培地を変え、ピルビン酸を含まないDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン1%を0.25ミリモルIBMX、0.25ミクロモルデキサメタゾン、ミリリットルインスリン当たり5マイクログラム、および10マイクロモロラーラグリタゾンで補充した。2日間の料理をインキュベートします。2日後、培養液をピルビン酸なしDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを1ミリリットルインスリンあたり5マイクログラム、10ミクロモルロシグリタゾンを補充し、さらに2日間培養します。ピルビン酸、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を使用せずに2日ごとに細胞を供給し、細胞をインキュベーターに保管します。トランスフェクションの1日または数時間前に、1ミリリットル当たり1ミリグラムのストック溶液から30%エタノールで1ミリリットル当たり100マイクログラムのコラーゲンタイプIの溶液を調製する。12ウェルプレートのウェルあたり250マイクロリットルまたは24ウェルプレートのウェルあたり125マイクロリットルを加え、井戸の表面に溶液を広げます。コラーゲンが乾くまで、培養フードの下に蓋をせずにプレートを放置します。その後、D-PBSで2回洗浄します。混合し、室温で5分間インキュベートする改善された最小必須培地とsiRNAをピペット。トランスフェクション試薬と改善された最小必須培地をsiRNAとピペットに加え、混合します。室温で20分間インキュベートします。次に、コラーゲンコーティングされたプレートの各ウェルにトランスフェクションミックスを加えます。100ミリのペトリ皿の細胞をD-PBSで2回洗います。5倍のトリプシンを細胞に加え、表面全体をトリプシンで覆います。30秒待ってから、トリプシンを慎重に取り外します。ペトリ皿をインキュベーターで摂氏37度で5~10分間インキュベートします。その後、細胞の損傷を避けるために、細胞を取り外すために皿をタップします。ピルビン酸なしのDMEM10ミリリットル、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えてトリプシンを中和します。慎重に上下に培地をピペットし、細胞を取り外し、細胞懸濁液を均質化します。マラッセス計房または自動セルカウンターを使用して細胞を数え、培地のミリリットル当たり0.625百万細胞に細胞の濃度を調整します。トランスフェクションミックスを含む24ウェルプレートのウェル当たり12ウェルプレートまたは400マイクロリットルの細胞懸濁液のウェル当たり800マイクロリットルの細胞懸濁液の種子。細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートし、24時間乱散しないでください。翌日、上清をピルビン酸なしの新鮮なDMEM、25ミリモルグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%に慎重に交換し、細胞をインキュベーターに戻します。siRNAまたはmiR送達後の標的のノックダウンを検出するための典型的なタイムポイントは、mRNAの場合は24〜48時間、タンパク質では48〜96時間である。機能性実験は、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、アディポカイン分泌、脂肪分解、およびリポジェネシスを含むトランスフェクトされた脂肪細胞に対して行うことができる。このアディポサイトは、トランスフェクション後に形態を維持することが示されている。トランスフェクションの2日後、脂肪細胞は、トランスフェクトと非トランスフェクトされた脂肪細胞の間で異ならない脂質含有量を有する多発性脂質滴を提示した。トランスフェクション細胞における種々の分化マーカーのmRNA発現は、非トランスフェクトされたアディポサイトと比較して変化していない。逆トランスフェクションプロトコルは、70%以上のアディポサイトがトランスフェクションされたとして効率的である。ペリリピン-1に対するsiRNAによるトランスフェクションの3日後、ペリリピン-1のmRNAレベルは70%減少し、タンパク質レベルはトランスフェクションの4日後に蛍光顕微鏡法によって63%ペリリピン-1発現を分析し、対照脂肪細胞の発現と比較して92%減少したことがわかった。miR-34aの発現をアップレキュレートするマイクロRNAを用いたアディポサイトの逆トランスフェクションをここに示す。miR-34aの過剰発現により、VAMP2タンパク質発現が50%減少し、3T3-L1脂肪細胞におけるペリリピン-1のノックダウンが基底脂肪分解の増加につながり、miR-34aの過剰発現がインスリン誘導タンパク質キナーゼBリン酸およびグルコース取り込みの阻害につながった。新たに分化したアディポサイトのトランスフェクションを実行し、トリプシンによるアディポサイトの治療を注意深く監視するために、高レベルのアディポサイト分化に達することが重要です。トランスフェクション後、脂肪細胞に対する機能実験を行い、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、および脂肪分解に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができる。

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生物学

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