Name: マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぶマウスの気道粘膜線毛クリアランス評価法。SPECT/CTを用いた放射性核種イメージングにより、呼吸器疾患モデルでの薬物効果評価や新規治療法開発に応用可能な再現性の高い測定プロトコルを解説します。

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M.Z.とK.S.F.とこの研究は、ピットイノベーションチャレンジ(PInCh)の下で授与された助成金、ピッツバーグ大学臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所、およびNHLBI R01助成金HL153407によって支えられ、M.Zに授与されました。

ピッツバーグ大学の制度的動物管理および使用委員会は、これらの動物実験のいずれかを行う前に、この出版物に指定されたすべての動物プロトコルを承認しました。
注:このプロトコルは、デュアルモダリティSPECT / CTスキャナを用いた放射性核種イメージングを利用した生体内粘液構造クリアランス研究の実施方法を詳述しています。実証された技術は、システム較正の実行、マウスの麻酔、マウスの気管挿管、肺への同位体の植え付け、デュアルモダリティイメージング、これらの画像の共同登録、および分析です。
1. SPECT/CT システムのセットアップ
<ol><li>生きている動物を使って実験を行う前に、適切なワークフローを設計し、設定します。<ol>
<li>回転半径 40 cm の投影間のステップ サイズが 6o の 60 の投影から成る SPECT の取得を使用します。CTの獲得は、投影間の1.6oの 角度を持つ220の投影から成ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>システムにマウス用の正しい MWB コリメーターと SPECT イメージングが適切であることを確認します。不適切なコリメータがインストールされている場合は、コリメーターウィザードを使用して正しいコリメータをインストールします。</li>
	<li>必要なシステムキャリブレーションを実行して、システムを使用できるように準備します。 メモ: スキャナーの SPECT および CT コンポーネントには、キャリブレーションが必要です。ソースコンディショニングとダーク/ライト(D/L)キャリブレーションを使用してCTコンポーネントを1日1回、センターオフセット(COS)キャリブレーションを2週間ごとに調整し、毎月X線ハードウェアを評価します。SPECTコンポーネントは、年に一度キャリブレーションする必要があります。<ol>
<li>X線ハードウェアを評価するには、CTキャリブレーション中に X線ハードウェアを評価 するチェックボックス(補足的なCTキャリブレーションメニュー)をチェックします。</li>
		<li>ソースコンディショニングを実行するには、CTキャリブレーション中に ソースコンディショニングを実行 チェックボックスをオンにします(補足CTキャリブレーションメニュー)。</li>
		<li>D/Lキャリブレーションを実行するには、CTキャリブレーション中の実験で使用したCT取得プロトコルの横にある D/L ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコルのチェックを外します (補足的な CT キャリブレーション メニュー)。</li>
		<li>COSキャリブレーションを実行するには、ベッドをキャリブレーションリングツールに置き換え、モーションコントロール設定で一致するようにベッドタイプの設定を調整し、CTキャリブレーション中の実験中に使用したCT取得プロトコルの横にある COS ボックスをチェックします。他のすべてのプロトコル(補足CTキャリブレーションメニュー、補足キャリブレーションリング)のチェックを外します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウス挿管とインスティレーション
<ol><li>スキャンするマウスの重さを量る。複数のマウスをスキャンする場合は、耳のパンチや尾のマーキングなどの方法を使用して、マウスを識別するために注意してください。</li>
	<li>1.5%のイソフルランを使用して、ガス室に2 L/min O2のガスフローを用いて、十分な深さの麻酔を生成するために、呼吸が16分あたり〜55〜65呼吸まで遅くなるまで、マウスを麻酔する(図1A)。</li>
	<li>チャンバーからマウスを取り出し、45o傾斜の挿管スタンドのフロント切歯で吊り下げます。挿管スタンドにノーズコーンを装備して、挿管中にマウスが麻酔を受けることを確認します(図1B)。</li>
	<li>50 μm の光ファイバーワイヤの一端を光源に接続し、ワイヤーを使用して 20 ゲージのカニューレを通してガイドとして機能します (図 1C)。</li>
	<li>マウスの口を開き、鈍い鉗子を使用して舌を前方に引っ張ります。ガイドワイヤーを照らし、それを使って声帯を可視化します(図1D)。</li>
	<li>ワイヤーが声帯を越えて上気管で休むように、声帯を通してガイドワイヤーを渡します。1インチのカニューレをワイヤーに沿って前方にスライドさせてマウスを挿管し、カニューレを十分に深く通過させ、そのハブが動物の切り傷に対して行われます(図1E)。カニューレを所定の位置に残してワイヤーを取り外します。</li>
	<li>指でカニューレを短時間差し込み、呼吸の変化を確認して挿管をテストします。放出時に呼吸を止め、呼吸を加速させながら呼吸を止めたり、呼吸を緊張させたりすると、適切な気管挿管の徴候である。カニューレを差し込む際に呼吸パターンに変化がない場合、後者は食道にある可能性が高い。</li>
	<li>99mテクネチウム-硫黄コロイド(99mTc-Sc)の0.2 mCiを10μLの体積で準備し、ピペットをカニューレに入れ。マウスが1-2分以上の肺に自発的に吸い込むことを許可する(図1F)。マウスをスキャナーのパレットに移す前にカニューレを取り外します。 注:放射性核種はカーディナルヘルスによって準備され、フィルタリングされました。</li>
</ol>3. スペクター/CTイメージング
<ol><li>マウスをノーズコーンで25mmパレットに移し、テープで固定し、胸と腹部をしっかりとテープで貼り付けすぎないように注意して呼吸を損なわないようにします。マウスに取り付けられた金属の耳のタグを取り除くように注意してください。</li>
	<li>200 μL で 0.05 mCi からなる放射性ファントムを準備し、0.2 mL PCR チューブに入れます。マウスの下腹部の下のパレットにテーピングしてチューブを置き、肺との重なりを避けます。 注: ファントムは、CT 画像と SPECT 画像を共に登録する目的で使用され、またクリアランスのための負のコントロールにも使用されます。</li>
	<li>SPECT/CT システムにマウスを挿入し、イメージング ワークフローを選択して 、セットアップを実行します。</li>
	<li>マウス上の検出器の位置を設定し、イメージングワークフローを実行します。</li>
	<li>放射能後の手順を受けたマウス用のケージを準備し、食物や水への無制限のアクセス、放射線安全ステッカーを使用した明確なラベリングを行います。</li>
	<li>ワークフローが完了したら、マウスをイメージングパレットから取り出し、調理されたケージ内で、スキャンの間(スキャンの終わり1からスキャン2の開始まで)の間に6時間の間、調理されたケージ内で、食品および水へのアドリビタムアクセスで回復させます。6時間は、小胞のクリアランスが非常に少ない繊毛機能に応じて線形クリアランスが行われている期間に対応するように選択した。</li>
	<li>6時間後、マウスを再麻酔し、同じワークフローを使用して、同じワークフローを使用して、気道からクリアされた同位体の量を測定して、ファントムと一緒にスキャンします。 注:イソフルランを伴う無断麻酔として6時間回復させ、粘液性クリアランスがほぼゼロになるため、マウスが有意な繊毛抑制効果を引き起こします。</li>
</ol>4. 分析
<ol><li>イメージングの後、後処理を実行して完全な3Dスタック画像を再構築します。<ol>
<li>99mTcの工場標準設定を使用してSPECT画像をヒストグラムし、MAP3Dアルゴリズムとポイントスプレッド関数(PSF)再構築を使用して再構築します。 注: 再構築は、8 回の反復と 6 つのサブセットを使用して実行されました。効果的な再構築には、1:10での投影に対するサブセットの比率または予測数に均等に分割する必要があるため、60の予測を使用して取得したために6つのサブセットが使用されました。</li>
		<li>フェルドカンプ アルゴリズムとシェップ ローガン フィルターを使用して CT 画像を再構築します。 注: 再構築は 4 回の反復を使用して実行されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再スライスツールを使用して、デフォルトの軸イメージからコロナビュー画像を生成するために、フィジー ImageJ21 で CT 画像と SPECT イメージを処理します。次に、SPECT イメージに z スタック合計投影を実行して、各スライスのカウント データを追加し、分析を容易にするために 1 つの画像を生成します。</li>
	<li>ファントム・エペンドルフ・チューブを参照として、CT画像とSPECT画像のサイズ変更と登録を行います(図2A,B)。すべてのサンプルで一貫したサイズ変更の測定値を追跡し、使用します。</li>
	<li>自動閾値を使用してCT画像を二元化し、続いてスタックを反転し、Zスタック合計投影を実行して分析用の肺の輪郭を生成する(図2C)。</li>
	<li>CT 画像と SPECT イメージを回転させ、チャンネル ツールを使用して画像をマージします。右肺の周囲にROIを描画し、測定することによってMCCを計算します(図2D)。 注: この測定は、0 時間および 6 時間のタイム ポイントの右肺の合計カウントで、6 時間の画像は、式N(t) = N0e-t.99mTc-Sc は、約 6 時間の半減期で、1 秒あたり 3.21e-5の減衰定数を持っています。これらの値を使用して、パーセントクリアランスを計算できます。 注:右肺は、粘液性クリアランスが肺から咽頭から肺に放射性同位体を輸送し、胃の中で終わるので、ROIの描画と測定カウントのために選択されます。非常に頻繁に、カウントは左肺と重なり、したがって誤ったカウントを生成する可能性のある胃の中で見ることができます。この交和は、右肺のカウントのみを測定することによって回避することができます。</li>
</ol>

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</ol>

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病気と発達の両方における運動性呼吸繊毛の役割は進化し続け、より良く評価される。気管気管支樹を裏打つ細胞の有頂端表面上の複数のモチル繊毛の同期的なメタクロナル拍動は、粘膜クリアランスまたはMCCを産生するセファラッド流を生成する。MCCは、PCD22のようなシリオパシーで危険にさらされ、COPD18のような病気を獲得し、その重要性は伝統的に繊毛症であるとは考えられてはいえないCHDで認識されている。最近のデータは、ヘテロタキシー23 とヘテロタキシー7のない両方のCHDで呼吸毛様機能不全を示している。このようなモチル繊毛機能不全は、より大きな呼吸症状9 ならびにより大きな術後罹患率8に変換することが示された。これらの疾患のほとんどは、すべてではないにしても、利用可能なマウスモデルを持っており、マウスのMCCを測定するためのプロトコルは、潜在的な治療法をテストするために利用できる貴重なツールです。
動物モデルは、病気を理解し、治療法の開発のための有用性を提供します。In vivo動物イメージングは、動物を犠牲にすることなく、同じ動物から複数のデータポイントを取得する機能を提供し、研究者が治療効果の研究と同様に病気の縦方向の経過をたどることを可能にする。MCCのマウスモデルは、複数の研究者によって数十年にわたって開発され、当初は平面シンチグラフィーを用いてビーグル犬に対して行われている、2次元核画像化技術24である。この技術は10年後にマウスでの使用に適応され、その後25,26の10年後にSPECTイメージングに適応した。マウスモデルにおけるこの技術の開発は、毛様体機能が大幅に変化するPCDのようなヒト疾患の複数のマウスモデルの入手可能性のために、この技術の関連性における大きな発展であった。MCCは、肺脱用および免疫抑制のマウスモデルにおいて評価されており、他のモデル19,26と組み合わせて使用される可能性を有する。CF、喘息、PCD、およびCHDに関連する繊毛症などの気道疾患を有するヒト患者におけるMCC測定試験が行われ、この技術が肺生理学および治療効果13の両方の研究を助けることができるという結果を生み出した。
このプロトコルの重要な部分は、正確な画像を定量化するために正しいイメージングパラメータを使用して取得を設定することです。SPECT取得設定を設計する際には、使用するコリメータ、回転あたりの射影数、回転ステップサイズなど、多くの要因が重要です。コリメータ選択は、取得の感度と分解能の主要な要因であり、そして取得設定は、使用されているコリメータ27に合わせて調整する必要がある場合があります。あるいは、ラットのような大きな動物を使用する場合、コリメーターを調整する必要があります。例えば複数のピンホールコリメータは、より敏感であるが、重なり合う突起を避けるためにステップサイズを選択する際には注意が必要であり、これは再構成アーティファクト25を引き起こす可能性のある画像のあいまいさを犠牲にして取得の感度をさらに高めることができる。再構成セットアップは、定量化可能な画像を生成する上でも重要です。MAP3Dは一般的に使用される反復再構成アルゴリズムであり、PSFは一般的な再構成モデルである。どちらもイメージの再構築に対して信頼性がありますが、反復回数とサブセット数を設定する際には注意が必要です。反復回数が多いほど、再構築に必要な計算時間が増加し、さらに増加するとリターンが減少して再構築の質が向上します。
ImageJ で画像を定量化するために使用する理想的な測定ツールは、選択範囲内のピクセルの合計値を出力する RawIntDen です。異なるサイズの肺ROI間でSPECTデータを定量化する場合、RawIntDenを使用すると、カウントの絶対的な尺度を提供し、平均測定が21と同様にROIの面積に対する測定の調整を回避します。
この手法には、この手法を適用する際に調査員が認識する必要がある、関連する多数のエラーの原因があります。注目すべきコンファウンダーは、麻酔薬の使用です。イオブルランは、マウスが取得完了後に急速に回復する速い作用、吸入麻酔薬です。しかし、マウスにケージ内で回復するのに十分な時間を与え、必要以上に麻酔を受けないように注意する必要があります。私たちの個人的な経験(未発表のデータ)では、0時間から6時間の間に吸入イオブルランを使用して麻酔を連続的に維持されたマウスは、無視できるクリアランスを示した。同様に、迅速な回復を確実にするためには、麻酔薬の制御用量も必要です。画像処理のために動物をパレットに固定する場合、人工物が肺と重ならないように、共同登録に使用される幻の管を胃の上に低く保つ必要があります。同様に、CT 画像の品質を確保するために、マウスから金属タグを取り除き、X線散乱からアーチファクトを避けるように注意してください。
現在のMCCプロトコルは無数の動物モデルに適用することができる。この技術は、スキャンされた動物の健康にごくわずかな影響を及ぼし、マウスによって十分に許容され、このため既に繊細なマウスの健康を危険にさらすことなく疾患モデルで使用することができる。この方法論の強さは、ビデオ顕微鏡のために気管を切除するために動物を犠牲にすることなく気道機能の一貫した反復可能な測定値を取得することを可能にするin vivo技術であることから来る、ex vivoモデルは26を必要とする。同じ動物の複数のスキャンで反復可能な測定を生成するこの技術の一貫性は、同じ動物が異なる薬剤または潜在的な治療で治療されることを可能にし、そして任意の動物モデルに内在する生物学的変動性を減少させるために同じ動物間で行われた統計的比較を可能にし、それによって統計的に有意な差を示すために必要なサンプルサイズを減少させる。
MCC技術を用いた気道機能の評価は、さまざまな動物モデルに調整し、気道の健康の多くの異なるモデルに適用するだけでなく、新しい治療法をテストすることができます。PCDのマウスモデルの気道は、この技術だけでなく、COPDのモデルを使用して評価することができます。また、一般的な臨床使用のMCCに対する様々な麻酔薬の差動効果を研究するためにも利用できます。最後に、このモデルを用いて、気道に対する治療剤の効果を評価することもできる。先に述べたように、繰り返しクマ, それはインビボ測定であるため、それは病気の過程で繰り返しMCC評価を可能にします, だけでなく、時間の経過と共に治療介入のテストの利点.さらに、マウスはヒト疾患を模倣/研究するために使用される最も一般的な実験動物であり、場合によっては、ヒト疾患の複数のトランスジェニックマウスモデルから選択できる。

繊毛は、藻類からヒトまでの進化史を通じて保存された微小管ベースの細胞小器官である。それらは細胞表面から発せられると多くの機能を有する1、局所的な環境感覚信号の認識から運動性、ヒトから初期の単細胞真核生物にまでさかのぼることができる機能2、3に至るまで。Ciliaは非運動性であり、環境信号を処理するセルの特殊なアンテナとして単一の役割を果たすことができます。またはモチルと倍数、同期して叩く、転移波は、卵管の内層や上下気道など流体の流れを発生させる、1、2に至る末端気管支を除く。
気道の広範な上皮表面は、潜在的に危険な汚染物質および病原体の形で汚染の絶え間ない集中砲火にさらされ、防御を必要とする。1つの重要な防御機構は気管気管支柱の粘液性装置であり、気管気管支上皮細胞の有端な表面を裏打ちする複数のモチル繊毛の叩きによって、分泌された粘液の連続的な流れが気道から機械的に運び出される。吸入された汚染物質を捕捉するこれらの機能、およびそれらの連続的な、同期の鼓動を通して、それらをセファルド4、5を輸送する。
繊毛は、胚発生における左右のパターン形成の発達などにおいて重要な役割を果たしていることが実証されており、胚節のモチル繊毛は対称性を破る6。繊毛関連遺伝子の変異は、心臓の非対称構造による先天性心疾患(CHD)などの疾患に関連している。最近の研究では、CHD患者の気道における毛様機能不全の発生率が高く、また、上気道および下部気道7、8、9、10における術後呼吸器合併症および慢性気道症状の有病率の増加が報告されている。CHDおよび毛様機能不全を有する患者は、ヘテロタキシーの有無にかかわらず、術後の呼吸合併症および陰性呼吸転帰のリスクが5、8、10に増加することが実証されている。シグナリングと発達における彼らの役割を超えて、気道繊毛の重要性は、主要な毛様体異形成(PCD)である毛様症によって実証されている。PCDは、運動性呼吸器繊毛に影響を及ぼす多数の突然変異に起因する先天性障害であり、再発性肺感染症、気管支拡張症、および肺移植の必要性を引き起こす可能性がある11。さらに、嚢胞性線維症(CF)において繊毛が正常であるにもかかわらず、白人集団において最も一般的な先天性障害は、CFTR遺伝子12の突然変異に起因する厚い粘膜粘液が厚いために障害される。PCDとCFの複数のマウスモデルと、CHDのモデルが増え続けています。最終的に繊毛は多くの重要な役割を持つ多目的な構造であり、生体内の運動性呼吸繊毛の機能を評価する方法は、前臨床研究に有用であり、突然変異および粘膜クリアランス(MCC)13に対する薬物の影響を評価する方法である。この方法は、これらのマウスモデルにおけるMCCに対する新規薬物、遺伝子治療または介入の影響を評価する上でも価値がある。
MCC の評価に使用されているさまざまなモデルがあります。1つの注目すべき方法は、気管支に植え付けられたメチレンブルー染料を使用することを含み、色素運動14の光ファイバー測定によって測定されたクリアランスを有する。この方法は、前臨床マウスモデルよりもヒトでより日常的である色素の動きを観察する能力によって制限される。もう一つの注目すべき方法は、放射光相対位X線イメージング(PCXI)であり、気道内の個々の粒子を追跡するために使用することができます。この方法は比較的新しく、広くアクセスできない15です。ビデオ顕微鏡用気管を切除することによって気道を評価する数多くのex vivo方法がありますが、これらのモデルはヒト患者16にはほとんど有用性を提供しません。光コヘレンス断層撮影などの繊毛イメージングの高解像度技術は、同じように17に制限されている。
本稿では、無数の動物モデルにおける肺クリアランスの測定に用いられてきたMCC in vivoを測定する再現性のある方法を提示するとともに、慢性閉塞性肺疾患におけるMCCの研究と免疫抑制薬18,19の効果を評価する。この方法は、肺への注入後に、不溶性微粒子放射性トレーサーである放射性医薬品99mテクネチウム硫黄コロイド(99mTc-Sc)のクリアランスを追跡する。放射性核種は、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)18,20を使用して追跡することができる。我々は、肺への放射性同位元素数の共局在化とデュアルモダリティSPECTとコンピュータ断層撮影(CT)イメージングを使用して、6時間にわたってこれらのカウントの減少を測定することにより、MCCを測定するためのこの技術をさらに洗練しました。二重モダリティイメージングは、CT画像とSPECT画像の共登録により、対象領域である肺に対する放射線数の正確な局在化を可能にします。マウスにおけるMCC測定法については詳細に説明するが、プロトコルはラットのMCCを研究するように調整することができる。コリメーターは放射線量と同様に調整する必要があります。我々の見解では、マウスMCCスキャンは、小さな動物の大きさのために技術的に困難であるが、多くのヒト障害の確立されたマウスモデルの数が多いため、ラットよりも有用である。さらに、動物コロニーの低コストとメンテナンスコストのために、より大きなサンプルサイズはマウスでより実行可能です。

<table><tbody><tr><td>500 & マイクロ;m ジャケットなし光ファイバー ワイヤー</td><td>エドモンド オプティクス</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mテクネシウム 硫黄コロイド</td><td>枢機卿 健康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔気化器</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>ダーモント #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan 安全カテーテル 20G1インチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリーシャイン</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>マウス挿管スタンド</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>シーメンス インヴェオンデュアルモダリティ SPECT/CT</td><td>シーメンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル麻酔スタンド</td><td>サミット麻酔ソリューション</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

呼吸性繊毛は、細胞の専門の小器官であり、気道を裏打ちする上皮細胞の上端表面を並べる。メタクロナル、シンクロナル様式で殴打することにより、これらの複数の、運動性、アクチンベースのオルガネラは、吸入汚染物質および病原体の気道をクリアするセファラッド流体流れを生成する。環境汚染の増加に伴い、新しいウイルス病原体および新たな多剤耐性菌は、繊毛発生粘液性クリアランス(MCC)が肺の健康維持に不可欠である。MCCはまた、原発性毛様体異性症、嚢胞性線維症、ならびに慢性閉塞性肺疾患のような後天性障害のような複数の先天性疾患でうつ病である。これらすべての障害は、いくつかのケースでは、複数のマウスモデルを確立しています。本稿では、少量の放射能とデュアルモダリティSPECT/CTイメージングを用いて、生体内マウスのMCCを正確かつ再現的に測定する方法について詳述する。この方法は、イメージング後のマウスの回収を可能にし、連続測定を可能にし、時間の経過とともに長い間潜在的な治療薬をテストする。野生型マウスのデータは、細部に十分な注意が払われ、プロトコルが厳密に付着している限り、MCC測定の再現性を示す。

このプロトコルを用いて、イオブルランチャンバー内のマウスを麻酔した(図1A)。十分なレベルの麻酔を達成した後、マウスを垂直支持に置き(図1B)、発声コードを照らされたガイドワイヤーを使用して可視化した(図1C-1D)。マウスを挿管し、カニューレを介して10μLの体積で0.2 mCi 99mTc-Scを植え付け、マウスは肺に自発的に吸入することを許した(図1E-1F)。画像の取得と処理の後、CT画像とSPECT画像をランドマークとして使用して共局化した(図2A)。肺のマスクは、CT画像(図2C)から生成され、0(図2D)および6時間(図2E-2F)で分析するために右肺の周りにROIを描くために使用した。プロトコルの再現性をテストするために、同じ実験条件を持つ異なる日に合計8匹のマウスを2回スキャンし、繰り返しスキャンの間に有意な差を示さないペアのt検定を用いた分析(p値=0.9904)(図3A)。さらに2匹のマウスを同一の実験条件で異なる日に3回スキャンし、一方向ANOVAを用いた分析では、反復スキャン間の有意な一致を示す(図3B)。計8匹のマウスをスキャンし、2つの代表的な画像を表示した(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> 図1:マウス挿管と同位体の内挿。気道に同位体を挿管し、植え付けるために必要なステップの画像。 A) マウスはチャンバー内で麻酔を受ける。 B)麻酔マウスを垂直支持に置き、フロント切歯によって吊り下げ。 C)ガイドワイヤとして機能する光ファイバーワイヤを照射した0.5mmの光ファイバーワイヤーは、20 Gカニューレを通してそれを実行することによって準備されます。 D)マウスの口は鉗子を使って開き、照明付きガイドワイヤーを使って声帯を視覚化する。 E)カニューレは声帯を横切って押され、ガイドワイヤーは取り外される。 F)可溶性同位体はピペットを用いてカニューレに植え付け、マウスは自発的に同位体を肺に吸い込む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> 図 2: MCC スキャンの SPECT/CT イメージA) CT イメージと共にローカライズされた SPECT イメージ。 B)共局化に使用された可視幻のチューブを持つCT画像。 C)CT画像を二値化し、zスタックの合計投影を行うことによって導出される気道のマスク。 D)SPECT イメージと共にローカライズされた CT マスク。右肺の周囲に分析用のROIが描かれています。 E)6時間で気道のマスク。 F)分析用ROIと6時間の気道のCTおよびSPECTの共局化画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> 図3:複数のスキャンで同じマウスのクリアランス測定。A)実験条件に変化のない8匹のマウスについて2個の反復クリアランスを測定した。ペアのt検定では、p値0.9904の繰り返しスキャンに有意な差がないことを示した。 B)実験条件に変化のない2匹のマウスについて3つの個別の反復クリアランスを測定した。一方向の分散分析は、p値0.0041の繰り返しスキャンの間に有意な一致があることを示した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> 図4:右肺を概説する0時間と6時間でROIを描いた2匹のマウスにおける0時間および6時間の気道の共局化されたSPECT/CT画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:呼吸効果を可視化した光ファイバーワイヤーで照らされた声帯の映像。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補助ファイル。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

私たちのプロトコルは、デュアルモダリティのSPECTおよびCTイメージングによって追跡される放射性核種を使用して、動物モデルにおける粘液線毛クリアランスの正確な測定を可能にし、気道クリアランスを正確に特定および測定します。この技術は、デュアルSPECT/CTの利用により、さまざまな動物モデルや疾患モデルに適用できるMCCを測定するための再現性のある方法です。ペダル反射に対する反応がないことを確認した後、スタンドにノーズコーンを装着して麻酔を維持し、麻酔をかけたマウスを前切歯で迎えたマウスを挿管スタンドに45度の角度で吊り下げます。50ミクロンの光ファイバーワイヤーの一端を光源に接続し、ワイヤーに20ゲージのカニューレを通します。鈍い鉗子を使用して舌を引き出し、ガイドワイヤーを照らして声帯を視覚化します。ガイドワイヤーを声帯に通して、ワイヤーが上部気管にある声帯のすぐ後ろに来るようにし、1インチのカニューレをワイヤーに沿って前方にスライドさせ、ハブが動物の切歯に当たるほど深くなるまでスライドさせます。カニューレを所定の位置に残したままワイヤーを取り外し、指でカニューレを短く差し込んで呼吸の変化を確認します。次に、新たに調製した0.2ミリキュリー99mテクネチウム硫黄コロイド10マイクロリットルをカニューレに加え、マウスが放射性核種を1〜2分間かけて自発的に肺に吸入できるようにします。SPECT/CTイメージングでは、カニューレを取り外した後、テープを使用してマウスをノーズコーン付きの25ミリメートルパレットに固定し、0.05ミリキュリー放射性ファントムを含む200マイクロリットルのPCRチューブをマウスの下腹部の肺の下にテープで固定します。マウスをSPECT/CTシステムに入れます。イメージングワークフローを選択し、「設定」をクリックします。マウス上の検出器の位置を設定し、イメージングワークフローを実行します。ワークフローが完了したら、マウスを新しいケージに移し、モニタリングを行い、スキャンの合間に6時間、餌や水、放射線安全ステッカーを無制限に貼り付けます。イメージング後、99mテクネチウム硫黄コロイドの工場標準設定を使用してSPECT画像をヒストグラム化し、MAP3Dアルゴリズムと点像分布関数再構成を使用して3Dスタック画像を再構築します。Feldkamp アルゴリズムと Shepp-Logan フィルターを使用して CT 画像を再構築し、FIJI で CT 画像と SPECT 画像を開きます。再スライス ツールを使用して、デフォルトの軸方向画像からコロナ ビュー 画像を生成し、SPECT 画像に対して z スタック合計投影を実行して、各スライスからカウント データを追加します。分析を容易にするために 1 つの画像を生成します。また、Phantom Eppendorfチューブをリファレンスとして使用して、CT画像とSPECT画像のサイズを変更し、同時レジストレーションを行います。自動しきい値処理を使用して CT 画像を二値化し、スタックを反転し、z スタック合計投影を実行して分析用の肺の輪郭を生成します。CT画像とSPECT画像を回転させ、チャンネルツールを使用して1つの画像に結合します。次に、右肺の周囲に関心領域を描画して、粘液線毛クリアランスを決定します。画像の取得と処理の後、CT画像とSPECT画像は、ファントムチューブをランドマークとして共局在化することができます。肺のマスクは、CT画像から生成し、さまざまな時点での分析のために肺の周囲に関心領域を描画するために使用できます。この解析では、合計8匹のマウスを同じ実験条件下で異なる日に2回スキャンし、プロトコールの再現性を検証しました。対応のあるT検定分析では、反復スキャン間に有意差は示されませんでした。さらに2匹のマウスも、同じ実験条件下で異なる日に3回スキャンされました。一元配置ANOVA分析では、反復スキャン間で有意な一致が示されました。ここでは、スキャンしたマウスのうち2匹の代表的な画像を観察することができます。気道を視覚化できることは不可欠です。また、挿管が成功したことを確認するために、必要に応じてカニューレを取り外し、食道挿管の誤りを避けるために再挿管します。このプロトコルは、疾患モデルに適用して、気道クリアランスに対するさまざまな薬物の影響を評価し、新しい薬物療法の開発を支援することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価

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