アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

このプロトコルにより、遺伝子組み換えアリを生成して、社会環境におけるコミュニケーションと行動における遺伝子の機能を理解することができます。真社会性昆虫の遺伝システムを操作することは、多くの種が実験室の設定で交尾および繁殖しないため、困難です。アリの鼻腔細胞床における顕著な表現型の可塑性により、CRISPRを介した変異株を確立することができます。

手順を実演するのは、研究室の大学院生であるケイリー・シーバーです。H.saltatorの野生型コロニーを、摂氏22〜25度のアリ飼育室の透明なプラスチックの箱に維持し、12時間の明度、12時間の暗照スケジュールで維持します。小さな箱を使用して個々の労働者または小さなコロニーを飼育し、中型または大型の箱を使用して大きなコロニーを飼育します。

巣箱を作成するには、石膏を使用して床を作ります。湿った石膏が中型箱と大きな箱の中で乾いているので、箱の後ろから数センチの深さと数センチの石膏にフォームブロックを押して、下の巣の領域を指定します。石膏が乾いたら、指定された巣の領域を正方形のガラス片で覆います。

週に2回、生きたコオロギをコロニーに与え、洗浄ボトルを使用してプラスチック製の巣箱の床に定期的に水をかけます。給餌が行われるときはいつでも、ゴミや死んだ人を取り除きます。すべての廃棄物と死んだアリを摂氏マイナス30度で一晩凍結してから、これらの材料を通常のゴミとして処分します。

乾燥したおがくずをコロニーに定期的に追加して、幼虫が蛹化を受けるのを助け、労働者が巣箱を清潔に保つのを助けます。マイクロピペットプラーを使用して、ガラスマイクロインジェクションニードルを引きます。使用するガラスがほこりのない清潔な環境で保管されていることを確認してください。

2段階のプロセスを使用して、マイクロインジェクションニードルを引きます。最初のステップでは、熱を575、フィラメントを3、速度を35、遅延を145、プルを75に設定します。2番目のステップでは、熱を425、フィラメントを0、速度を15、遅延を128、プルを200に設定します。

得られた針のテーパーが2ミリメートル、先端が0.5マイクロメートルであることを確認します。針を抜いた後は、使用するまでほこりのない清潔な環境に保管してください。カゼインタンパク質とin vitro合成低分子ガイドRNAのマイクロインジェクション混合物を調製します。

マイクロインジェクションニードルをロードするまで、混合物を氷上に置いておきます。使用しないときは、マイクロインジェクション混合物を摂氏マイナス80度で保管してください。射出パラメータを射出圧力を 140 ヘクトパスカル、一定圧力を 70 ヘクトパスカル、時間0.4 秒に設定します。

材料が一方向にのみ流れるように一定の圧力を調整し、針から胚に材料が流れていない場合にのみ注入圧力と時間を調整します。マイクロローダーピペットチップを使用して、2マイクロリットルの混合物をマイクロインジェクションニードルにロードします。混合物をゆっくりと行い、気泡が形成されないようにします。

テープの端に沿って針の先端だけを折って、狭いテーパーが維持されるようにします。針が先端が開くのに十分なだけ折れていることを確認してくださいが、テーパーが折れるほどではありません。次に、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。

細胞質分裂なしで核が分裂する合胞体期からマイクロインジェクション用の胚を選択します。顕微鏡スライドガラスに貼り付けた両面テープのプレートに胚を並べ、注入中の動きを防ぐためにテープにしっかりと固定されていることを確認します。各胚の外側がテープの端になるように胚を垂直方向に置きます。

スライドと裏打ちされた胚を、指定されたマイクロインジェクションワークステーションの顕微鏡のステージに置きます。マイクロマニピュレーターを使用して注射する最初の胚に針を合わせ、顕微鏡下で最初の胚を背側軸または腹側軸に沿って横方向に穿刺します。マイクロインジェクション混合物を注入し、注入された液体による内圧の上昇を示す胚のわずかな動きを探します。

さらに、胚の外膜に目に見える痕跡の組織または脂質を含む小さな液滴が形成されるのを観察します。胚から針をそっと外し、顕微鏡スライドの位置を調整して次の胚に進みます。すべての胚が注入されるまで繰り返します。

スライド上のすべての胚が正常に注入されたら、スライドを湿潤ボックスに移して1時間、スライドから取り出す前に胚が回復する時間を与えます。インキュベーション後、スライドをエタノールで洗浄し、フェザー級鉗子を使用して注入した胚をテープから静かに取り除き、少量の70%エタノールで満たされたチューブに移します。チューブを数回反転させます。

小さくて柔らかい絵筆を使用して、注入したすべての胚を2%抗生物質抗真菌剤を含む1%寒天プレートに移します。プレートを摂氏25度で約4週間インキュベートし、定期的に孵化をチェックします。最初の胚が幼虫に孵化したら、すべての胚と幼虫を巣箱に戻して、孵化したばかりの子ガメの世話をするために数人の若い看護師がいます。

以前に実証された方法に従ってコロニーを維持します。このプロトコルは、ハルペグナトス塩析胚のゲノム編集を成功させるために使用されました。結果は、注入された胚から抽出されたDNAのPCRおよびpGEMクローニング、およびそれに続くDNAシーケンシングによって検証されました。

このプロトコルを使用した体細胞突然変異誘発の効率は約40%に達しました F1変異オスを野生型のメスと交配させてヘテロ接合型のF2メスを産生し、交配しない場合はF3オスを産生した。変異F3オスをヘテロ接合メスと交配して、F4ホモ接合変異メスを生成しました。突然変異誘発が成功した結果、標的遺伝子の喪失と相関する異常な行動が観察された。

Orcoの喪失は、フェロモン感知の喪失、獲物を検出できないこと、繁殖力の低下、およびコロニーからの徘徊に関連しています。このプロトコルを実行する場合、注射中の胚の損傷を最小限に抑える必要があります。これは、針先が大きく開きすぎないようにし、注入時に針をゆっくりと動かすことで行うことができます。

同様の技術を使用してトランスジェニックアリを生成および維持することができ、ニューロンの活動および行動を調査するためのより洗練されたツールを提供する。CRISPRを介した神経新生は、ミツバチ、クローン侵入アリ、ヒアリなどの他の真社会性昆虫種で使用されています。遺伝子組み換えは、真社会性昆虫の発生、生理、社会的行動に関する機能的研究を促進します。