Name: クレイゼン・シュミット凝縮アプローチによるpH依存性ピラゾール、イミダゾール、イソインドロネジピロンフルオロフォアの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 学ぶクレイゼン・シュミット縮合反応による蛍光性ジピロリノン類似体の合成法。塩基触媒アルドール反応を用いてpH依存性蛍光プローブを効率的に作成し、有機合成化学研究に応用する。

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Z.R.W.とN..B.は、NIH(2P20 GM103440-14A1)の寛大な資金に感謝し、ユングジェ・コーとネバダ大学ラスベガスは 1Hと 13C NMRの買収を支援しました。さらに、NSCビジュアルメディアの学生、アーノルド・プラセンシア=フローレス、オーブリー・ジェイコブス、アリスター・クーパーの皆さんに、この原稿の撮影部分の撮影とアニメーションのプロセスに協力してくださったことに感謝します。

1. ジピリニロンアナログの合成のための一般的な手順 16-25
<ol><li>ピロリノール/イソインドロン(1.00ミリモル)とそれに対応するピラゾール/イミダゾールアルデヒド(1.00 mmol)を丸底フラスコで5.0mLのエタノールに溶かします。</li>
	<li>水性KOH(24.0 mmol,10 M,2.40 mL)をフラスコに1つの部分に加えます。</li>
	<li>反応が完了するまで攪拌還流し、反応が確認されるまで(反応時間のリストについては 表1参照)。ジクロロメタン中の10%メタノールのTLC溶出液が使用され、アナログは0.62〜0.86の範囲内または周囲のRf 値を有することが観察されている。十分な量の真空グリースを塗布するか、ガラスジョイントの相間にPTFEスリーブを使用して、凝縮器のガラスと丸底フラスコが高温と基本条件下で押収されるのを防ぎます。</li>
	<li>反応混合物を室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で揮発性物質を蒸発させます。</li>
	<li>氷浴を用いて反応混合物を0°Cに冷却する。</li>
	<li>酢酸(30.0 mmol、1.70 mL)を1つの部分に加えて残りの油性混合物を中和する。</li>
	<li>真空濾過を使用して得られた製品材料を精製する (ステップ 2a、化合物: 17、18、20-22、24 および 25)を使用するか (ステップ 2bを参照してください: 化合物: 16、19、および 23)。 </li>
</ol>2. 手続き浄化
<ol><li>真空ろ過<ol>
<li>装着されたゴム製アダプターを使用して、ヒルシュ漏斗をサイドアームフラスコに取り付けます。</li>
		<li>丸いろ紙をヒルシュ漏斗に塗布し、脱イオン水を使用して軽く濡らして漏斗を付着させます。</li>
		<li>フラスコのサイドアームに真空源を接続し、真空中にガラス製品を引き離す必要がないことを確認して、十分な真空シールがあることを確認します。</li>
		<li>結晶化した製品を含むフラスコを真空フィルターの上に注ぎ、濾過できるようにします。10 mLの氷冷脱イオン水で結晶をすすいでください。</li>
		<li>すべての液体のろ過に続いて、真空源に接続したまま、濾過された結晶がフィルターペーパーの上で乾燥し続けることを可能にする。</li>
		<li>ろ過した結晶を集め、25 mLの丸底フラスコに入れる。</li>
		<li>丸底フラスコを、フリット付きグランドガラスジョイント/真空ラインアダプタに取り付けます。ガラスジョイントユニオンをケッククリップで固定します。</li>
		<li>ガラス高真空ラインアダプターのリブ付きエンドに、高真空ポンプにルーティングされる真空ラインを取り付け、真空トラップ(液体窒素やドライアイス/アセトンなどの冷却剤を使用)を適切に冷却して、結晶材料から蒸発する可能性のある揮発性物質を凝縮します。高真空ポンプをオンにして、残りの溶媒を結晶から完全に蒸発させます。</li>
		<li>結晶を高真空下で1時間以上乾燥させます。真空ライン/アダプターから丸底フラスコを取り外し、高真空ポンプをオフにして、真空トラップを清掃します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カラムクロマトグラフィーによる手順精製
	<ol>
<li>酢酸処理反応混合物の内容物(ステップ1.6から)を10mLの脱イオン水で希釈し、セパレーター漏斗に移します。セパネルにジクロロメタン10mLを加えます。2つの層を分離するためにセパレーター漏斗を穏やかに振って通気します。</li>
		<li>ジクロロメタンの後続の部分(3 x 5 mL)を使用して水層を抽出します。無水Na2SO4を使用して有機分画と乾燥を組み合わせます。ロータリーエバポレーターを使用して減圧下ですべての揮発性物質をデカントし、除去します。</li>
		<li>工程2.2.2から得られた残渣を希釈する。CH 2 Cl2の5 mLと。約75gのシリカゲルを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行う。ジクロロメタン中に10%メタノールの溶液でサンプルを溶出させます。</li>
		<li>ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で回収した溶媒の分量を除去します。約10 mLのCH 2Cl2を用いて、固体残渣を25mL丸底フラスコに移す。ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶媒を除去します。</li>
		<li>手順 2.1.7 ~ 2.1.9 で前述したように、残りの固体残渣を高真空で乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. モル吸収吸収の取得とUV/VispKアナログ のための研究 16-25
<ol><li>アナログ 16-25のUV/Vis分光光測定用の複合ストックソリューションを作成します。<ol>
<li>選択したジピロンアナログ(16-25)の10μmolを計量し、10 mLの体積フラスコに加えます。</li>
		<li>DMSOを体積フラスコの10.0 mLマークに追加します。 注:化合物が完全に溶解しない場合は、ヒートガンを使用してフラスコを加熱し、化合物を完全に溶解するために必要に応じてフラスコを攪拌します。</li>
	</ol></li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩(PBS)溶液を様々なpHレベルで作ります。アナログは、pHの範囲が約4〜15のPBSバッファーで特徴付けられていた。<ol>
<li>1 L体積円筒を使用して、100 mLのPBS(x100)を900mLの脱イオン水に希釈して、PBSストック溶液を1Lで作ります。</li>
		<li>調製したPBSストック溶液(ステップ3.2.1)50mLを100 mLビーカーに移し、磁気攪拌棒を加えます。次に、較正されたpHメーターを使用してpHの変化を監視し、水性1.0 M NaOH(pH>7.0でバッファを得る)または1.0 M HCl(pH<7.0でバッファを得る)のいずれかでPBSバッファを滴定します。 注: 明確に定義された滴定曲線をもたらすデータを取得するには、予想される変曲点の± 0.5 以内に 0.1 pH 単位単位の pH バッファーを生成し、予想される変曲点の外側の 0.5 単位を生成することをお勧めします。</li>
	</ol></li>
	<li>PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOH(pH 14.0)溶液でアナログ 16-25 のモル吸収スペクトルを取得します。<ol>
<li>クリーンで乾燥したクオーツキュベットを使用して「ブランク」を準備し、100- 1000 μLマイクロピペットを使用して、PBSストック溶液(pH 7.0)または水性1.0 M NaOHのいずれかをキュベットに追加します。 注:キュベット溶液に気泡がないことを確認し、キュベットの外側のほこりや破片に起因する光の散乱を防ぐために、キュベットの側面をキムワイプで徹底的に拭き取ることは、ブランクソリューションデータ取得プロセスの完全性にとって重要です。泡が持続する場合は、硬い表面に置かれたペーパータオルのキュベットを軽く繰り返しタップします。</li>
		<li>UV/Vis分光光度計を使用して、選択した溶液を200~800 nmの範囲でブランクにします。</li>
		<li>2番目のクリーンで乾燥したクオーツキュベットに、PBS(pH 7.0)または1.0 M NaOH(pH 14)の2.00 mLに加え、その後にジピリノンアナログ(16-25)の10 μLを5〜50 μLピペットでストック溶液(ステップ3.1を参照)を加えます。キュベットにキャップを置き、キュベットを反転させることに加えてよく振ります。 注:キュベット溶液に気泡がないことを確認し、キュベットの外側のほこりや破片に起因する光の散乱を防ぐために、キュベットの側面をキムワイプで徹底的に拭き取ることは、サンプルソリューションデータ取得プロセスの完全性にとって重要です。泡が持続する場合は、硬い表面に置かれたペーパータオルのキュベットを軽く繰り返しタップします。</li>
		<li>UV/Vis分光光度計を使用して、200-800 nmの範囲のジピリニオンアナログ溶液の吸収スペクトルを取得します。</li>
		<li>同じキュベットに、ジピロンアナログストック溶液を10μL追加し、ステップ3.3.3と3.3.4を繰り返します。</li>
		<li>ステップ3.3.5を繰り返して、少なくとも5つの励起波長データポイントを取得するために、合計50μLのジピリロンアナログストック溶液がキュベットに追加されます。16 - 25 のすべてのストック溶液がPBS(pH 7.0)と1.0 M NaOHの両方で得られるまで、ステップ3.3.1-3.3.6を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベストフィット線形回帰分析を使用して、PBS(pH 7.0)で 16~25、1.0 M NaOHのモル吸合率値を取得します。<ol>
<li>GraphPad Prism 7 などのグラフプログラムを使用して、測定された吸光度(y軸)をジピリロンアナログ濃度(x軸)に対してプロットします。5 つのプロットされた点に対して、最適な線形回帰分析を作成します。線形関係を観察し、統計分析はR2 値≥0.98を示す必要があります。</li>
		<li>PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOHのアナログ 16~25 に対して、ステップ3.4.1を繰り返します。</li>
		<li>PBS(pH 7.0)の 16~25 のモル吸収率と、最良適合線形曲線からの外挿された傾斜角値を使用して1.0 M NaOHを計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>UV/Vis 分光光度法を 使用して pK の値 を 16 ~ 25 の分析結果を決定する<ol>
<li>クリーンで乾燥したクオーツキュベットに、100 ~1000 μL マイクロピペットを使用して、選択したpHレベル(ステップ3.2で作成)でPBSバッファーの1,900 μLを転送します。 注:私たちは、いくつかのバッファに白い沈殿物が形成される可能性があることにストレージを使用して気づきました。バッファーが完全に均質であり、沈殿物が見える場合は、重力濾過を使用して、使用直前に任意の沈殿物を除去します。ステップ 3.3.1 以降の注を参照してください。</li>
		<li>UV/Vis分光光度計を使用して、選択したPBS緩衝液を200~800 nmの範囲にブランクします。</li>
		<li>2番目のクリーンで乾燥したクオーツキュベットに、選択したPBSバッファーの1,900 μLを移し、5-50 μLマイクロピペットを使用して、選択したアナログストック溶液の100 μLを加えます。キュベットにキャップを置き、キュベットを反転させることに加えてよく振ります。 注: ステップ 3.3.3 以降の前の注を参照してください。</li>
		<li>UV/Vis分光光度計を使用して、200〜800nmの範囲のジピリニオンアナログの吸収スペクトルを取得します。</li>
		<li>ステップ 3.2 で生成された PBS バッファーのそれぞれで 、16 ~ 25 のステップ 3.5.1 ~ 3.5.4 を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベストフィットシグモイド曲線フィッティング関数を 使用して 、16~25 のpK値を決定します。<ol>
<li>グラフプログラムを使用して、測定された吸光度対波長(nm)を 16~25 の様々なpHレベルでグラフ化する。</li>
		<li>380-415 nmの間で、低いpHレベル(<7.0)の吸光度が小さく(0-0.1単位)、より大きなpH(>12.0)の吸光度がかなり大きい(0.8-1.0単位)の波長を選択してください。選択した波長とpHの吸光度をプロットします。</li>
		<li>シグモイド曲線関数を使用して、各アナログ 16〜25に対して最適なフィット曲線を生成する。曲線の半分の高さで外挿された pH を報告します。これは、報告された pK値です 。</li>
	</ol></li>
</ol>量子収量獲得と蛍光研究
<ol><li>ジピリロンアナログ 16 - 18 と 20 - 25のための蛍光研究ストックソリューションを作成します。<ol>
<li>ステップ3.1で作成したジピリノンアナログストック溶液を用いて、2〜20μLマイクロピペットを使用して1mL体積フラスコにストック液10μLを加えて、1mLマークにPBS(pH 7.0)バッファーを加えて、ストック液の希釈を行います。ボリュームフラスコにキャップを置き、フラスコを反転させて振ってよく混ぜます。この希釈ストック溶液は、蛍光スペクトルを生成するために使用され、蛍光ストック溶液と呼ばれます。</li>
		<li>アナログ 16 - 18 および20 - 25に対してステップ 4.1.1 を繰り返します。 </li>
	</ol></li>
	<li>アナログ 16-18 および 20-25に対して、様々な濃度で蛍光発光スペクトルを取得する。 18以外のすべてのアナログについて、pH 7および14の溶液中の各アナログに対して、19.96、39.84、59.64、79.37、99.01 nMの濃度で5つのスペクトルを取得します。アナログ18の場合、49.75、99.01、147.8、196.1、および243.9 nMの濃度でpH 7の溶液中の5つのスペクトルを取得します。pH 14の溶液では、99.01、196.1、291.3、384.6、476.2 nMの濃度でアナログ18のための5つのスペクトルを取得します。<ol>
<li>透明な四面クォーツキュベットに3.00 mLのPBS(pH 7.0)または1.0 NaOHを加え、100-1,000 μLマイクロピペットを3つの1,000 μL単位で加えます。 注: ステップ 3.3.1 以降の注を参照してください。</li>
		<li>フルオロメーターとフルオロメーターソフトウェアプログラムFluorEssenceを使用して、選択した溶液の発光スペクトルを取得し、これを溶液「ブランク」とラベル付けします。</li>
		<li>同じキュベットに、0.5-10 μLマイクロピペットを使用して、選択したジピロンアナログ(Part 4.1)に6μLの蛍光ストック溶液を加えます。キャップをキュベットに置き、キュベットを反転させて軽く振ってよく混ぜます。 注: ステップ 3.3.3 以降の注を参照してください。</li>
		<li>フルオロメーターを用いて、λmax absを励起波長として使用して、選択した化合物溶液の発光スペクトルを取得する。励起強度は、励起波長を超えて15nmから始まる200nmの範囲にわたって測定した(通常、200nmの範囲は、蛍光強度がベースラインに戻るために必要である)。</li>
		<li>ステップ 4.2.3 ~ 4.2.4 を、合計 30 μL の蛍光ストック溶液をキュベットに添加するまで繰り返します。</li>
		<li>PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOHのアナログ 16-25について、ステップ4.2.1~4.2.5 を繰り返します。 注:キュベット濃度はアナログ 18 のために変更され、データは、中性(プロトン化 18)溶液のための蛍光ストック溶液の5つの連続した10 μL増分を有するPBSの2.0 mLおよび基本(脱プロトナトリウム 18)溶液のための5つの20 μLの付加された化合物ストック溶液の2.0 μLの1.0 mLを使用して取得した。</li>
	</ol></li>
	<li>ウィリアムズ、A.T.らの方法を用いて量子収率を決定する<ol>
<li>スプレッドシートソフトウェアプログラム(すなわち、Microsoft Excel)を使用して、単一のディピリノンアナログ(PBS[pH 7.0]または1.0 M NaOHのいずれかで撮影)の発光スペクトルのデータ(発光強度データポイント)をさまざまな濃度レベルでインポートします。</li>
		<li>「ブランク」溶液の発光スペクトルからデータポイントをインポートし(ステップ4.2.1 - 4.2.2)、発光強度データポイントから「ブランク」の発光強度データポイントを差し引き、対応する波長で、様々な濃度レベルで取得します。</li>
		<li>「空白」補正された発光強度データポイントをグラフプログラム(GraphPad Prism 7 など)に転送し、発光対波長をプロットします。ジピリロンアナログの様々な濃度レベルで得られた各曲線の曲線の下の領域を計算します。</li>
		<li>ウィリアムズ、A.T.らによって概説された技術に従って、ジピリロンアナログの様々な濃度レベルのそれぞれについて外挿吸光度値を計算する。これは、計算されたモル吸収率の値(ベストフィット線形回帰分析からステップ3.4を参照)とステップ4.2.3-4.2.5で使用されるジピリロンアナログの各濃度を掛けることによって達成されます。</li>
		<li>GraphPad Prism 7 などのグラフプログラムを使用して、最大の発光値に対応する発光波長について、各濃度曲線(ステップ 4.3.4)の下の計算領域に対して、アナログの外挿吸光度(x軸)のプロットを作成します。r2 ≥ 0.96 との線形関係を観察する必要があります。</li>
		<li>0.5 M H2SO4 (ΦF = 0.55)18のキニーネの 3.1-3.4 および 4.1-4.3.5 に類似した手順を実行し、エタノール中のアントラセーン (ΦF = 0.27)18,19に準じて標準データを取得します。</li>
		<li>以下の式のステップ 4.3.5 および 4.3.6 から得られた外挿傾斜を使用して、PBS (pH 7.0) および 1.0 M NaOH の 16 ~ 25 の量子収率値を取得します。 Φx =Φst(グラード×/グラードst)(η 2x/η2st) ここでΦstは標準の量子収率を表し、Φxは未知の量子収率を表し、グラードは最良の線形適合の傾きであり、ηは使用される溶媒の屈折率である(屈折率はη=1.36エタノール、η=1.35(0.5 MH2SO4)を用いて計算した)。</li>
		<li>キニーネとアントラセネについて得られたΦxの平均として、PBS(pH 7.0)で16-18および20-25の量子収率を報告する。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

Claisen-Schmidt 凝縮アプローチは、ピラゾール、イミダゾール、イソインドロロンジピリノンフルオロフォアを比較的操作的に単純化したプロトコルを介して生成するかなり堅牢な方法を提供します。蛍光ジピロンアナログの合成がこの研究の焦点であったが、同様の条件はジピリノン23、24、25およびピロールフラン付加物のような他の二環性メチン結合リング系にアクセスするために適用することができることに留意すべきである26だけでなく、3H-ピラゾール-3-ワンフラン付加管27、イソインドロンピロール付加体28、および2 H -Indol-2-1-ピリンジン付加体29は潜在的な医薬品としての約束を保持する。一般に、説明した手順は中程度から高い収率で反応生成...

2つの芳香環がモノメチン橋で連結される多くの共役二環系は、結合回転を介して異性化を受け、光子(図1A)1、2、3、4、5で励起した場合である。励起された異性体は、一般的に非放射減衰プロセス6を通じて地盤状態に緩和する。ボンド回転に対するエネルギーバリアが十分に大きくなると、光異性化を制限または防止することができる。その代わりに、フォトニック励起は、非放射減衰ではなく蛍光を介してリラックスすることが多い励起された一重の状態をもたらす(図1B)。光異性化の抑制は、共有結合によって2つの芳香環系をテザリングして結合回転を機械的に制限することによって最も一般的に達成され、それによって分子を特定の異性体状態にロックする。このアプローチは、次のようないくつかの異なる蛍光三環式ジピリノンおよびジピロールメタンアナログを作成するために利用されてきた:3H,5H-ジピロロ[1,2-c:2',1'f]ピリミジン-3-1(1),キサント ホグロース(2)6、7、ピロロインドリンジインジオンアナログ(3)8、およびBODIPYアナログ9(4、図2)によりピロリジンおよび/またはピロールリングシステムがメチレン、カルボニル、カルボニルとつながれている、 またはホウ素ジフルオロリンカー。通常、1~4 は ΦF > 0.7 を所有しており、これらのシステムはフルオロフォアユニットとして非常に効率的であることを示唆しています。
また、環系を共有結合する以外の手段により光異性化を制限することも可能である。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)のフェノールおよびイミダゾリノンリング(図2)は、タンパク質環境による回転に制限されています。制限的な設定は自由解10の同じ発火単位と比較して量子収率を3桁増加させる。GFPのタンパク質足場は、立体及び静電効果11を通じて回転バリアを提供すると考えられている。最近、ネバダ大学のOdohグループと共同で、リノはジピリノー系のキサントホロー系と構造的類似性を持つ別のフルオロフォア系を発見した(図2)12。しかし、これらのジピロン類似体は、共有結合ではなく分子内水素結合という点でキサントホロー系とは異なり、光異性化を抑止し、蛍光二環系をもたらす。さらに、ピラゾール、イミダゾール、およびイソインドロネジピロン類似体は、プロトン化および脱プロトン化された状態で水素結合することができる。デプロトネーションは、励起波長と発光波長の両方の赤ずれをもたらし、システムの電子的性質の変化による可能性が高い。水素結合は、13、14、15、16の制限された回転を経ても量子収率を増加させると報告されているが、分子のプロトン化および分解状態の両方で制限異性化が蛍光のモードとなる他の蛍光系は認識していない。したがって、これらのpH依存性ジピロンフルオロフォアは、その点でユニークである。
このビデオでは、蛍光ジピロンアナログシリーズの合成と化学特性に焦点を当てています。特に、一連の蛍光アナログを完全に構築するために使用されたクラゼン・シュミット凝縮方法論に重点が置かれています。この反応は、アルデヒド基を攻撃する塩基媒介性ビニノラスエノール酸イオンの生成に依存し、その後、排除を受けるアルコールを生成する。ジピリノーンアナログシリーズの場合、ピロリニオン/イソインドロンは、ピラゾールまたはイミダゾールリングに付着したアルデヒド群への攻撃を容易にするためにエノレートに変換される(図3);除去後、メチン橋によって連結された完全結合二環系が形成される。ジピリロンアナログのシリーズ全体は、容易に入手可能な市販材料から構築することができ、一般的に中程度から高い収率(収率は約50〜95%)で単一のワンポット反応シーケンスで製造することができることは注目に値します。ジピリニオンアナログの大部分は、本質的に結晶性が高いため、分析的に純粋なサンプルを生成するために標準的なワークアップ条件以外の精製はほとんど必要ありません。したがって、このフルオロフォアシステムは、容易に入手可能な市販材料からアクセスするためにわずかなステップしか必要とされず、比較的短い時間枠での分析または生物学的研究のために合成、精製、および調製することができる。

<table><tbody><tr><td>3-エチル-4-メチル-3-ピロリン-2-オン</td><td>コンビブロック</td><td>&nbsp;[766-36-9]</td><td>黄色固体試薬</td></tr><tr><td>イソインドリン-1-one</td><td>ArkPharm</td><td>&nbsp;[480-91-1]</td><td>オフホワイト固形試薬</td></tr><tr><td>5-ブロモイソインドリン-1-オン</td><td>コンビブロック</td><td>&nbsp;[552330-86-6]</td><td>ピンク固体試薬</td></tr><tr><td>2-ホルミルイミダゾール</td><td>コンビブロック</td><td>&nbsp;[10111-08-7 ]</td><td>オフホワイト固形試薬</td></tr><tr><td>イミダゾール-4-カルバルデヒド</td><td>ArkPharm</td><td>&nbsp;[3034-50-2]</td><td>固形試薬</td></tr><tr><td>1-H-ピラゾール-4-カルバルデヒド</td><td>オークウッド・ケミカル</td>ズ<td>&nbsp;[35344-95-7]</td><td>固形試薬</td></tr><tr><td>1-H-ピラゾール-5-カルバルデヒド</td><td>マトリックス サイエンティフィック</td><td>&nbsp;[3920-50-1]</td><td>固体試薬</td></tr><tr><td>固体KOHペレット</td><td>BeanTown Chemicals</td><td>[1310-58-3]</td><td>白色固体ペレット</td></tr><tr><td>Siliflash シリカゲル</td><td>Scilicycle</td><td>R12030B</td><td>微細な白色粉末</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (x10)</td><td>Growcells</td><td>MRGF-6235</td><td>無色半透明液体</td></tr><tr><td>ベックマン・コールター DU-800 UV/Vis 分光光度計およびソフトウェア</td><td>ベックマン・コールター</td><td>N/A</td><td>分光法装置およびソフトウェア</td></tr><tr><td>Fluoromax-4 分光蛍光光度計</td><td>堀場製作所</td><td>N/A</td><td>分光法装置</td></tr><tr><td>FluorEssence 蛍光測定ソフトウェア V3.5</td><td>堀場製作所</td><td>N/A</td><td>分光法ソフトウェア</td></tr><tr><td>Finnpipette II マイクロピペット (サイズ: 100-1,000、20-200、0.5-10 &micro;L)</td><td>Fischerbrand</td><td>N/A</td><td>装置</td></tr><tr><td>Wilmad-LabGlass ロータリーエバポレーター (型式:WG-EV311-V-PLUS)</td><td>SP Scienceware</td><td>N/A</td><td>装置</td></tr><tr><td>:DuoSeal 真空ポンプ(型番:1405)</td><td>Welch</td><td>N/A</td><td>装置</td></tr><tr><td>:GraphPad Prism 4</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>データ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>SympHony pH Meter (Model:Sb70P)</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>備品</td></tr></tbody></table>

クレイゼン・シュミット凝縮アプローチによるph依存性ピラゾール、イミダゾール、イソインドロネジピロンフルオロフォアの合成

Synthesis of pH Dependent Pyrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Fluorophores using a Claisen-Schmidt Condensation Approach

メチンブリッジ結合二環芳香族化合物は、ポルフィリン、ジピリノン、医薬品などの生物学的に関連する様々な分子の一般的な成分です。さらに、これらのシステムの回転を制限すると、3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]ピリミジン-3-1、キサントホグロー、ピロロインドリンジネジオン類似体、BODIPYアナログ、フェノールおよびイミダゾロン環で観察されるほど中程度の蛍光系が多い。本稿では、クラゼン・シュミット凝縮を行い、一連の蛍光pH依存性ピラゾール/イミダゾール/イソインドロロンジピリノン類似体を生成する安価で運用上簡単な方法を説明しています。方法論はジピリロン類似体の合成を示すが、それは結合二環芳香族化合物の広い範囲を生成するために翻訳することができる。この方法で利用されるClaisen-Schmidt縮合反応は、塩基性条件下で起用される求核物質および求電子物(求核成分)および非溶化性アルデヒド(電子親水成分)に限定される。さらに、求核反応物質と求水反応物質の両方は、誤って水酸化物と反応しない官能基を含んでいる必要があります。これらの制限にもかかわらず、この方法論は、生物学的または分子プローブとして使用することができる完全に新しいシステムへのアクセスを提供します。

Claisen-Schmidt 凝縮反応は、プロトコルセクションで説明したワンポット手順を用いてジピリノンアナログ(16-25、図4)へのアクセスを提供した(ステップ1参照)。アナログ16-25は、すべてピロリノン9、ブロモイソインドロン10、またはイソインドロネ11を1H-イミダゾール-2-カルボキシアルデヒド(12)で凝縮して生成したH-イミダゾール-5-カルボキサンアルデヒド(13),1H-ピラゾール-3-カルボキサンデヒド (14), または 1H-ピラゾール-4-カルボキサンデヒド (15);この組み合わせは、制御化合物を含む10...

クレイゼン-シュミット凝縮反応はメチンブリッジ結合二環芳香族化合物の生成のための重要な方法論である。アルドール反応の塩基媒介バリアントを利用することにより、蛍光および/または生物学的に関連する分子の範囲は、一般的に安価で運用的に簡単な合成アプローチを通じてアクセスすることができます。

クレイゼン・シュミット凝縮アプローチによるpH依存性ピラゾール、イミダゾール、イソインドロネジピロンフルオロフォアの合成

Methine-bridged conjugated bicyclic aromatic compounds are common constituents of a range of biologically relevant molecules such as porphyrins, ...

クライゼン・シュミット凝縮反応は古い反応であり、1881年にクライセンとシュミットによって同時に報告された。これは、赤で示される芳香族アルデヒドに、青で示されるケトンまたはアルデヒドのベースアシストエノレート添加を含む。最初に、角括弧に示すように、エノレートの添加はアルコールの形成をもたらす。しかし、その後の脱水は最終的にエノンを生成します。アロアルデヒドはアルファ水素を含まないため、エノレートを形成することができない。その結果、多くの場合、水酸化物のような弱い塩基を、エノレートを生成するために使用することができる。クレイゼン-シュミット凝縮は、長年にわたって化合物の数を生成するために使用されています。しかし、それは広範囲に赤と青で示されているカルコンとフラバノンの芳香環系に参加するために使用されています。青色部分は、芳香族部分のエノレートと赤色に由来することを示す。カルコンおよびフラバノンは、置換パターンに応じて、抗菌、抗真菌、抗炎症、抗腫瘍などの様々な活性を有する生物学的活性分子の範囲に不可欠なコアである。クラゼン・シュミット縮合反応から生成される分子のもう一つの広範なクラスは、この研究で例を挙げるメチン橋状化合物です。当研究室では、ヘムの分解物を自然に生成する色素ビリルビンの蛍光成分に興味を持っています。ビリルビンの合成とその構成成分の多くは、クラゼン・シュミット型の縮合を中心に展開し、青色のエノール酸と赤色の芳香族アルデヒド成分によって表示される構造で視覚化することができます。典型的には、ジピリノンのようなビリルビンの直接成分は、非蛍光である。しかし、1つがメチレンまたはカルボニル基で2つの窒素基を架橋する場合、得られる分子は、キサントホローの場合のような高い蛍光性となる。通常、ジピリノンはUVまたは青色光を吸収し、ZからEの異性化プロセスを生じる。ブリッジドジピロンのNは、ブリッジドジピロンと同様にUVや青色光を吸収しますが、蛍光を介して励起状態でリラックスするという点で異なります。我々は最近、2つの窒素基を結ぶ共有橋なしで実際に蛍光を発する一連のジピリニオーネ誘導体を発見した。その代わりに、水素結合がZからEの異性化プロセスを抑止しているように見え、蛍光のモードにつながる。また、これらの分子が基礎培地で脱プロトン化され、脱プロトン化された状態で赤ずれた吸収発光スペクトルを導くという予期せぬ発見がなされた。その結果、これらの分子は、レシオメトリックpHプローブとしての価値を有し得る。蛍光ジピロン誘導体が使用され、伝統的なクレイゼン・シュミット縮合反応にわずかな適応を生じさせる。このプロトコルは、ピロリノンまたはイソインドロン由来のビニゴ性エノレートが求核性源であるという点で、伝統的なクレイゼン・シュミット縮合反応から逸脱する。ビニノギースエノレートは、ピラゾールまたはイミダゾールアルデヒドのいずれかに加えて、ジピリニロン類似体の小さなライブラリを生成する。このライブラリの作成手順をビデオに示します。しかし、類似のステップは、伝統的なクレイゼン-シュミット反応を行うために使用することができる。クレイゼン・シュミット反応は依然として広く使用されている合成反応ですが、これは私たちが知っているこの方法の最初のビデオカウントです。アルドール縮合を介した蛍光ジピロン類似体の合成に備えるために、選択された求核および求電子物と同等のものを等重み出す。次に、磁気攪拌棒を含む25ミリリットルの丸い底フラスコに追加します。段階のシリンダーを使用してエタノールの5ミリリットルを測定します。その後、丸底フラスコにエタノールを加えます。卒業したシリンダーを使用して、以前に調製された10モル水酸化カリウムの2.4ミリリットルを測定します。その後、水酸化カリウムをフラスコに加えます。フラスコを還流に設定するには、十分な量の真空グリースを反応コンデンサーのグランドガラスジョイントに塗布し、グランドガラスジョイントの圧入を防止します。コンデンサーを冷水供給に接続し、グリスチャーのグリースジョイントを丸底フラスコに取り付けます。その後、フラスコをオイルバスまたは熱プレートスターラーと熱結合を介して一定の温度を維持できるアルミニウム加熱ブロックのいずれかに置きます。反応を攪拌しながら熱を逆流温度にする。反応液は、反応速度を測定し、出発物質の完全な消費をチェックするために、1、3、6、12および24時間の薄層クロマトグラフィーによって監視されるべきである。フラスコを室温まで冷却し、次にロータリーエバポレーターを使用してエタノール溶媒を蒸発させます。フラスコを氷浴に入れ、フラスコを5分間にわたって氷浴の温度に平衡させます。フラスコに残っている水酸化カリウムを1つの部分に1.7ミリリットルの酢酸を加えて中和します。結晶形成が中和後に起こった場合は、次に真空濾過精製手順に従ってください。結晶形成が認められない場合は、フラッシュカラムクロマトグラフィー精製手順に従ってください。丸いフィルターペーパーを漏斗の上に置き、脱イオン水を使って漏斗に付着して紙を軽く濡らします。結晶の真空ろ過に備えるために、ヒルシュまたはブフナー漏斗を、取り付けたゴム製アダプターを使用してサイドアームフラスコに取り付けます。濾過を妨げる可能性のあるフィルターペーパーの詰まりを避けるために、同様のスケールろ過プロセスに典型的であるよりも大きなヒルシュまたはブフナー漏斗を使用しました。丸底フラスコの内容物を濾紙の上に注ぎ、混合物を濾過できるようにします。10ミリリットルの氷冷脱イオン水を使用して、濾過プロセス中に結晶をリンスします。濾過後、結晶を25ミリリットルの丸底フラスコに移します。高出力真空ラインガラスアダプターに真空グリースのライトコートを適用し、そのアダプターを丸底フラスコに接続します。ガラスジョイントをKeckクリップで固定します。残留溶媒の結晶を乾燥させる高出力真空を調製するために、ドライアイスとアセトンの混合物でガラス真空トラップを適切に冷却する。丸底フラスコに取り付けられたガラスアダプターにハイパワー真空ラインを接続します。高出力真空ポンプをオンにし、結晶を少なくとも1時間乾燥させます。結晶が真空下で十分に乾燥したら、真空ポンプをオフにして真空シールを放して丸底フラスコを取り除きます。乾燥した結晶を秤量して反応率を報告する。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製の準備をするために、合成手順から結晶を形成しなかった酸処理混合物をセパリー漏斗に加えます。段階的なシリンダーを使用してジクロロメタンの10ミリリットルを測定し、これを使用してセパリー漏斗で酸処理混合物を希釈します。頻繁に通気するようにしながら、セパレーター漏斗を閉じて穏やかに振ります。これに続いて、セパレートファネルに 2 つの別々のレイヤーが表示されます。さらに5ミリリットルのジクロロメタンを用いて水層を抽出する。この手順をさらに 2 回実行します。すべての有機分画を組み合わせ、有機分を乾燥させるために十分な量の無水硫酸ナトリウムを加えます。乾燥した有機分を丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを使用してジクロロメタンを取り除きます。残りの残渣を追加の5ミリリットルのジクロロメタンで希釈します。約75グラムのシリカゲルを使用してカラムを調製し、これを使用して、溶出液としてジクロロメタン中の10%メタノールを使用して、サンプル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーを行います。ロータリーエバポレーターを使用して、回収された分率から溶離を蒸発します。真空濾過精製手順に記載されているように、高出力真空ポンプとガラス溶剤トラップを準備し、収集した固体を高真空下で少なくとも1時間乾燥させます。結晶を真空下で十分に乾燥させたら、乾燥した結晶を秤量して反応率を報告する。ライブラリー内の各ジピリニオン類似体の構造を確認するために、核磁気共鳴分光法、赤外線分光法、高分解能質量分析など、いくつかの分光法を組み合わせて利用した。蛍光ジピロン類似体の光物理特性解析においてUV-Visおよび蛍光分光法が用いられた。Claisen-Schmidt凝縮反応を用いて、分子間水素結合に関与できない対照化合物を含む10化合物の小さなライブラリを合成することができました。ジピリロン類似体の収率は、およそ40%からほぼ定量的に変化し、各分子の下にリストされています。量子収率が最も高い化合物は、プロトン化およびデプロトン化された形態の両方で、2-フォルミミダゾールに由来し、ピンクのボックスで表示される。蛍光を発しない対照化合物は、シアンボックス内にあります。標準の365ナノメートルの長波長ランプの下でジピリロン誘導体は観察された蛍光を与える。1つは、デプロトネーションから生じる赤ずれた蛍光を視覚的に観察することができる。バイアルの色を通して、彼らは色の青からシアンに移行します。ジピリノン誘導体の光物理学的および他の物理的性質に関するより定量的なデータについては、原稿の書かれた部分の表2に視聴者を導く。全体として、クレイゼン-シュミット凝縮反応は、メチン結合二環芳香族化合物の範囲へのアクセスを提供する。ただし、いくつかの制限があります。この反応は、結露を成功させるために、溶起性の求核球と、アロアルデヒドのような非溶化性アルデヒド電気ファンフィルの両方の使用に依存する。この基本的な要件を満たしていない場合、この反応を実行しようとすると、リングシステムや競合する副産物の生成を相互にリンクできなくなる可能性があります。もう一つの考慮事項は、塩水酸化物との反応を受けやすい官能基との非互換性を生じ得るエノレート求核球を生成するために基本的な条件が使用されるということです。このような場合、水酸化物を、DBU、トリエチルアミン、ピピトリジン、フニッヒの塩基、炭酸ナトリウムで達成した窒素塩基または炭酸塩で置換することが可能です。私たちは、単にその可用性と相対的な費用のために水酸化カリウムを使用することを選択しました。これらの制限にもかかわらず、プロトコルで概説されている方法は、手続き的に簡単で費用対効果の高いシングルステップ反応を通じて、多数のシステムに芳香環を結合する手段を提供することができる。我々が合成したジピリノン類似体の場合、クレイゼン・シュミット凝縮は、これまでに記述されたpH依存性フルオロフォアへの最もアクセス可能なルートの1つを可能にした。それにもかかわらず、ジピリニロン類似体の将来の設計は、より強い分子間水素結合能力と低いpKa値を有する蛍光化合物を生成するために、概説された手順を用いて開発される。これらの強化されたpH依存プローブは、より広い範囲の細胞内事象に対するpH変動の視覚化を可能にしながら、より高い量子収量を有すると予想する。

synthesis-ph-dependent-pyrazole-imidazole-isoindolone-dipyrrinone

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶクレイゼン・シュミット縮合反応による蛍光性ジピロリノン類似体の合成法。塩基触媒アルドール反応を用いてpH依存性蛍光プローブを効率的に作成し、有機合成化学研究に応用する。

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