コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

MSCの遊走を調査するための既存のin vitro法には、トランズウェルまたは創傷治癒プロトコルが含まれます。ここで説明する方法は、MSCの外植片への移動をリアルタイムで追跡するために使用できます。外植片の培養に関しては、他の方法と比較してこの方法の利点は、時間とコストの削減、および実験ステップの簡素化を達成することです。

この手法は、幹細胞のターゲットへのホーミングをリアルタイムで観察するために使用でき、ホーミング効率を最適化したモデルの開発につながります。経験の浅い研究者にとって、皮膜の除去は困難です。開発段階にもよりますが、このプロトコルを成功させるには、皮膜を切除する適切なタイミングを理解することが重要です。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるJeong-Eun Park博士と Dr.Su Hoon Leeです。まず、紫外線を約30分間オンにして、層流組織培養フードを滅菌します。使用前にすべての表面に70%エタノールをスプレーし、乾燥させます。

解剖器具を70%エタノールに10分間入れ、乾燥させてから使用してください。生後3〜4日齢のマウスの首を切った後、前方を70%エタノールに浸し、層流フードの連続顕微鏡下に置きます。組織を組織解剖液にすばやく浸して、エタノールを除去します。

外科用刃で頭蓋骨の中心線を切断し、次に皮膚を前方に引き下げて耳の外耳道を切断することにより、頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨の前部から後部までアイラインを横切って切り取り、次に頭蓋骨を開き、鈍い鉗子で前脳、小脳、脳幹を切除します。マイクロ鉗子を使用して、蝸牛を側頭骨から分離し、組織解剖液を含むシャーレに移します。

蝸牛耳嚢のすべてを慎重に解剖し、内部の蝸牛軟部組織のみを残します。蝸牛のモディオールスを鉗子で保持し、蝸牛管を別の鉗子のペアで保持し、次に2つの組織をゆっくりと分離します。脈筋と皮膜をそっと剥がして取り除きます。

滅菌したプラスチックカバースリップを新しい組織解剖液に入れ、次にコルチ器官をカバースリップに置き、基底膜が下を向いていることを確認します。.ライスナーの膜と残りのモディオルス組織を鉗子でカバースリップに押し付けて、組織を固定します。ティッシュが埋め込まれたカバーガラスを35mmの共焦点皿の中央に移します。

ガラスクローニングシリンダーを皿の中央に配置し、蝸牛外植片を皿の中央に配置し、100マイクロリットルの外植片培養培地をシリンダーに加えます。5, 000骨髄由来のGFPタグ付き間葉系幹細胞またはMSCをガラスシリンダーの外側の2ミリリットルの培養培地に入れ、皿をインキュベーターに入れます。テキスト原稿に記載されているように細胞を培養した後、シリンダーの内側と外側のすべての培地を吸引し、ガラスシリンダーを共焦点皿から取り出します。

2ミリリットルの新鮮な培地を皿に加えます。分析の準備ができるまで、加湿インキュベーターに入れます。ステージトップインキュベーターを備えた共焦点顕微鏡システムを使用してください。

共焦点顕微鏡、蛍光灯、コンピューターの電源を入れます。ステージトップインキュベーターの条件を摂氏37度、二酸化炭素雰囲気5%に設定します。サンプル皿を皿固定容器に置き、皿固定蓋で覆い、上部ヒーター蓋でチャンバーを閉じます。

ズームとフォーカスを調整して、視野内のコルチとMSCの臓器を位置合わせします。画像処理ソフトウェアを開きます。位置決めオプションで、20倍プランアポクロマート対物レンズまたは開口数0.8と0.5倍のクロップエリアを選択します。

acquisitionで、smart setupをクリックし、EGFPを選択します。「アクイジション」の下の「チャンネル」タブを開き、レーザー出力を0.2%、ピンホールを44マイクロメートル、マスターゲインを750ボルト、デジタルゲインを1.0に設定します。イメージング設定の下のESIDをクリックし、ESIDゲインを4に、デジタルゲインを7.5に設定します。

タイルをクリックして賭けると、210枚のタイルが生成されます。フォーカス戦略を開き、フォーカスモードを選択します。[時系列] で、期間を 24 時間に設定し、間隔を 10 分に設定します。

[集録] で、フレーム サイズを 512 x 512 ピクセル、スキャン速度を 8、方向を双方向、平均を 4X、ピクセルあたりのビット数を 16 に設定します。[実験の開始] をクリックして実験を開始します。間葉系幹細胞またはMSCの二次元経路は、MSCとコルチ器官との間のバリアとしてガラスシリンダーを使用することにより、創傷治癒法で追跡されました。

コルチの器官を培養すると、線維芽細胞は最外層の外側の有毛細胞から非常に急速に外側に成長しました。ほとんどのGFP標識MSCは、急速に成長する線維芽細胞によって押し出されました。それにもかかわらず、一部は線維芽細胞の層を貫通し、コルチ器官にうまく移動しました。

72時間のインキュベーションの結果、MSCはコルチ器官に移動し、主にモディオールスとモディオルスから分離した蝸牛神経線維のある領域に局在していることが示されました。MSCの形態は、神経線維の形態に似た放射状に変化しました。細胞は、有毛細胞の領域ではなく、辺縁部線に沿って直線状に形質転換されました。

MSCは、さまざまな細胞層と物理的障壁を貫通することにより、神経線維収集領域内を移動および成長することができました。カナマイシンによる16時間の治療により有毛細胞への損傷を誘発し、カナマイシンの除去後さらに72時間細胞を培養したところ、MSCはモディオールスだけでなく、外側の有毛細胞にも局在していました。組織を固定することは、コルチの器官が付着しているこのプロトコルの重要なステップです。

簡単には落ちません。これは些細なことですが、外植片の培養を成功させるためのヒントです。この方法は、MSCから分泌されるエクソソームの有効性を研究するために適応できる可能性があります。