Name: コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶコルチ器官への間葉系幹細胞移動のリアルタイムイメージング法。共焦点顕微鏡を用いて損傷組織への細胞ホーミングを追跡し、時間とコストを削減する効率的なプロトコルを提供します。

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この研究は、韓国国立研究財団(NRF)とハリム大学研究基金の研究助成金(NRF-2018-R1D1A1B07050175、HURF-2017-66)によって支援されました。

ICRマウスを含むすべての研究プロトコルは、元州医科大学延世大学の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験は世界医師会倫理規定に従って行われた。このプロトコルでは、妊娠中のICRマウスを12/12時間の明暗サイクルに保ち、食物および水に自由にアクセスした。
1. コクリー解剖
<ol><li>紫外線を30分間オンにして層流組織培養フードを殺菌し、使用前に70%エタノールで全ての表面をスプレーします。表面を乾かします。</li>
	<li>解剖器を70%エタノールに10分間入れ、使用する前に乾燥させます。</li>
	<li>手術用ブレードを使用して、出生後3-4日齢のマウスの首を切り落とします(図2A)。</li>
	<li>頭蓋骨を層流フードの実体顕微鏡の下に置き、組織を70%エタノールに浸します。</li>
	<li>組織を組織解剖液(1xハンクスバランス塩溶液、1 mM HEPES)に素早く浸し、エタノールを除去する。</li>
	<li>外科用ブレードで頭蓋骨の中心線を切る(図2B、C)。</li>
	<li>皮膚を前から引き下げ、耳の外耳道を切断して頭蓋骨を露出させる(図2D)。</li>
	<li>眼線を横切って頭蓋骨の前部から後部に切り取る(図2E)。</li>
	<li>頭蓋骨を開き、前脳、小脳、脳幹を鈍い鉗子で取り除く(図2F、G)。</li>
	<li>マイクロ鉗子を用いて、側頭骨から内耳を分離する(図2H)。</li>
	<li>組織解離液を含むペトリ皿にコクリーを移します。</li>
	<li>内の人工内軟組織のみを残して、すべての人工内臓のオティックカプセルを慎重に解剖する(図2I、J)。</li>
	<li>鉗子と別の鉗子のペアで人工内耳管の変化を保持し、ゆっくりと2つの組織を分離する(図2K)。</li>
	<li>ストリア血管症とテクトリアル膜を静かに剥がして取り除く(図2L、M)。</li>
	<li>新しい組織解剖液に殺菌プラスチックカバースリップを入れ、コルティの器官を直径9mmのカバースリップに置き、バジラー膜が下向きであることを確認する(図2N-P)。</li>
	<li>Reissnerの膜と残りの変形組織を鉗子でカバースリップに押し込んで組織を固定化する(図2N-P)。</li>
	<li>埋め込みティッシュのカバースリップを直径35mmの共焦点皿の中心に移す。</li>
	<li>皿の中央に位置する人工内草を持つガラスクローニングシリンダーを皿の上に置き、100 μLの外植培養培地(DMEM/F12、10%胎児血清(FBS)、1%N2サプリメント、アンピシリン(10μg/mL))をシリンダー内に10を加える(図2Q)。</li>
	<li>プレート5×マウス骨髄由来緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きMSPの10細胞<ol><li></ol></li><li></li><li><li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li></ol><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol>

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<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

損傷した細胞の再生を促進するために、損傷部位へのMSCの移植が広範囲に研究されており、治療効果が明らかである。移植とその後のMCの分化は、3-ニトロプロピオン酸13によって誘発される難聴を有するラットの聴力を回復させることが報告されている。Leeらはヒトに対してMSCをトランスベンで適用したが、彼らは聴覚14において有意な改善を達成しなかった。最近まで、MSC移植によるげっ歯類モデルの聴覚を回復させるために、ほぼ12の実験が行われました。結果は異質性のためにやや不明であるが、MSCが聴覚を促進することができるといういくつかの兆候がある。
化学吸引に関連する様々な成長因子およびケモカインは、異質性または均質性15に関係なく、損傷した領域への移植幹細胞の移動に関与している。ケモカインは、組織ホメオスタシス、免疫応答、創傷治癒のための細胞移動の主要な調節因子です。生体内のケモカイン誘導化学引力は、インビボとインビトロの実験条件の違いのために、イン...

難聴は先天的に起こり得るか、加齢、薬物、騒音を含むいくつかの要因によって徐々に引き起こされる可能性がある。難聴は、聴力を担う毛細胞が損傷した後に機能障害を回復することは非常に困難であるため、しばしば治療が困難である。世界保健機関(WHO)によると、世界の4億6,100万人が難聴と推定されており、これは世界人口の6.1%を占めています。難聴者のうち93%が成人で、7%が子供です。
多くのアプローチは、難聴を治療するために試みられてきた;特に、MSCを用いた再生アプローチが有望な治療法として登場している。組織が損傷すると、MSCは循環系に自然に放出され、損傷部位に移動し、そこで様々な分子を分泌して再生を促進する微小環境を形成する2。したがって、外部移植されたMSCを標的とする臓器への移行と、強力な免疫調節、血管新生、および抗アポトーシスを引き起こす分子のその後の分泌を通じて損傷した組織を治療する方法を開発することが重要であり、損傷した細胞機能3、4、5の回復を強化する。
MSCが損傷した組織に移行するホーミングプロセスは、克服すべき最も重要な障害である可能性があります。MSCには、テザリング/ローリング、活性化、逮捕、トランスマイグレーション/ダイアペデス、および移行6、7、8の順次ステップを備えた全身ホーミングメカニズムがあります。現在、これらのステップを改善する方法を特定するための取り組みが進行中です。遺伝子組み換え、細胞表面工学、インビトロプライミング、磁気誘導など、さまざまな戦略が6,7で試験されています。さらに、損傷した人工内毛部位にMSCをホーミングすることにより、聴覚毛細胞の保護と再生を促進するためにいくつかの試みがなされている。しかし、インビボでのMSCの追跡は時間と労力を要し、高度に専門的なスキルを必要とします 9.
この問題を解決するために、数時間にわたって細胞の移動を撮影するタイムラプス共焦点顕微鏡を介して、内腔内のMSCのホーミングを観察する方法が開発された(図1)。それは20世紀 初めに開発され、最近特定の細胞の移動を研究するための強力なツールとなっています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> 図1:図1:(A)コルティの解剖された器官が鉗子を用いてプラスチックカバースリップに付着した後、カバースリップは35mmガラス底の共焦点顕微鏡皿に置かれ、(B)ガラスシリンダーが配置される。(C)ガラスシリンダーの内部を媒体で充填した後、(D)GFPラベル付きMSCを媒体で慎重にシリンダーの外に追加する。(E)一晩のインキュベーション後、ガラスシリンダーを取り外し、画像を共焦点顕微鏡で撮影する。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC = 間葉系幹細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>バッファーGenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4%ホルマリン</td><td>T&I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点ディッシュ</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>coverslip</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild with DAPI</td><td>sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>フォーセプス</td><td>デュモン</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン-iFluor 647 試薬</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>東海HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6マウスメッセンキマ系幹細胞とGFP</td><td>シアーゲン</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

間葉系幹細胞(MCs)が細胞再生および治療に及ぼす影響を調べ、人工内皮との共培養後のMSC移行および形態学的変化を追跡する。コルティの器官は、解剖中に発生したライスナーの膜の一部を押すことによってプラスチックカバースリップに固定化された。ガラスシリンダーで閉じ込められたMSCは、シリンダーが取り外されたときに人工内皮上皮に移行した。彼らの主な局在は、コルチの器官の透析で観察され、神経線維と同様の方向に整列した。しかし、いくつかのMSCは、手足の領域に局在し、水平に細長い形状を示した。また、毛細胞領域への移動が増加し、カナマイシン処理後にMSCの形態が様々な形態に変化した。結論として、この研究の結果は、人工内皮とのMSCの共培養が細胞移植による治療薬の開発および様々な条件および要因を調べることができる細胞再生の研究に有用であることを示している。

3次元モードにおけるMSCのインビトロ移行は、トランスウェルシステムまたは従来の創傷治癒法によって評価され、2次元(2D)モード11での移動を観察する。コルティの器官は、ボエッチャー細胞、クラウディウス細胞、Deiters細胞、ピラー細胞、ヘンセン細胞、外毛細胞、内毛細胞、神経線維、バジル膜、および網状層層などの様々な細胞から構成される複雑な構造である。このような複雑な細胞で構成される組織にMSCを移植する場合、細胞がどこでリクルートされ、安定されているかを確かめる技術を使用することは、MSCを用いた細胞療法と再生のメカニズムを理解する上で極めて重要です。また、MSCが損傷の有無に局在する方法を決定するために、創傷治癒法のような2D法は、細胞が一方向にランダムに下方に移動するトランスウェルシステムよりも適している。
本研究では、MSCとコルチの器官との間の障...

本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex vivoインキュベーションによって損傷組織に向かって移動する細胞を観察するリアルタイムイメージング法を提示する。

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

MSCの遊走を調査するための既存のin vitro法には、トランズウェルまたは創傷治癒プロトコルが含まれます。ここで説明する方法は、MSCの外植片への移動をリアルタイムで追跡するために使用できます。外植片の培養に関しては、他の方法と比較してこの方法の利点は、時間とコストの削減、および実験ステップの簡素化を達成することです。この手法は、幹細胞のターゲットへのホーミングをリアルタイムで観察するために使用でき、ホーミング効率を最適化したモデルの開発につながります。経験の浅い研究者にとって、皮膜の除去は困難です。開発段階にもよりますが、このプロトコルを成功させるには、皮膜を切除する適切なタイミングを理解することが重要です。その手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるJeong-Eun Park博士と Dr.Su Hoon Leeです。まず、紫外線を約30分間オンにして、層流組織培養フードを滅菌します。使用前にすべての表面に70%エタノールをスプレーし、乾燥させます。解剖器具を70%エタノールに10分間入れ、乾燥させてから使用してください。生後3〜4日齢のマウスの首を切った後、前方を70%エタノールに浸し、層流フードの連続顕微鏡下に置きます。組織を組織解剖液にすばやく浸して、エタノールを除去します。外科用刃で頭蓋骨の中心線を切断し、次に皮膚を前方に引き下げて耳の外耳道を切断することにより、頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨の前部から後部までアイラインを横切って切り取り、次に頭蓋骨を開き、鈍い鉗子で前脳、小脳、脳幹を切除します。マイクロ鉗子を使用して、蝸牛を側頭骨から分離し、組織解剖液を含むシャーレに移します。蝸牛耳嚢のすべてを慎重に解剖し、内部の蝸牛軟部組織のみを残します。蝸牛のモディオールスを鉗子で保持し、蝸牛管を別の鉗子のペアで保持し、次に2つの組織をゆっくりと分離します。脈筋と皮膜をそっと剥がして取り除きます。滅菌したプラスチックカバースリップを新しい組織解剖液に入れ、次にコルチ器官をカバースリップに置き、基底膜が下を向いていることを確認します。.ライスナーの膜と残りのモディオルス組織を鉗子でカバースリップに押し付けて、組織を固定します。ティッシュが埋め込まれたカバーガラスを35mmの共焦点皿の中央に移します。ガラスクローニングシリンダーを皿の中央に配置し、蝸牛外植片を皿の中央に配置し、100マイクロリットルの外植片培養培地をシリンダーに加えます。5, 000骨髄由来のGFPタグ付き間葉系幹細胞またはMSCをガラスシリンダーの外側の2ミリリットルの培養培地に入れ、皿をインキュベーターに入れます。テキスト原稿に記載されているように細胞を培養した後、シリンダーの内側と外側のすべての培地を吸引し、ガラスシリンダーを共焦点皿から取り出します。2ミリリットルの新鮮な培地を皿に加えます。分析の準備ができるまで、加湿インキュベーターに入れます。ステージトップインキュベーターを備えた共焦点顕微鏡システムを使用してください。共焦点顕微鏡、蛍光灯、コンピューターの電源を入れます。ステージトップインキュベーターの条件を摂氏37度、二酸化炭素雰囲気5%に設定します。サンプル皿を皿固定容器に置き、皿固定蓋で覆い、上部ヒーター蓋でチャンバーを閉じます。ズームとフォーカスを調整して、視野内のコルチとMSCの臓器を位置合わせします。画像処理ソフトウェアを開きます。位置決めオプションで、20倍プランアポクロマート対物レンズまたは開口数0.8と0.5倍のクロップエリアを選択します。acquisitionで、smart setupをクリックし、EGFPを選択します。「アクイジション」の下の「チャンネル」タブを開き、レーザー出力を0.2%、ピンホールを44マイクロメートル、マスターゲインを750ボルト、デジタルゲインを1.0に設定します。イメージング設定の下のESIDをクリックし、ESIDゲインを4に、デジタルゲインを7.5に設定します。タイルをクリックして賭けると、210枚のタイルが生成されます。フォーカス戦略を開き、フォーカスモードを選択します。[時系列] で、期間を 24 時間に設定し、間隔を 10 分に設定します。[集録] で、フレーム サイズを 512 x 512 ピクセル、スキャン速度を 8、方向を双方向、平均を 4X、ピクセルあたりのビット数を 16 に設定します。[実験の開始] をクリックして実験を開始します。間葉系幹細胞またはMSCの二次元経路は、MSCとコルチ器官との間のバリアとしてガラスシリンダーを使用することにより、創傷治癒法で追跡されました。コルチの器官を培養すると、線維芽細胞は最外層の外側の有毛細胞から非常に急速に外側に成長しました。ほとんどのGFP標識MSCは、急速に成長する線維芽細胞によって押し出されました。それにもかかわらず、一部は線維芽細胞の層を貫通し、コルチ器官にうまく移動しました。72時間のインキュベーションの結果、MSCはコルチ器官に移動し、主にモディオールスとモディオルスから分離した蝸牛神経線維のある領域に局在していることが示されました。MSCの形態は、神経線維の形態に似た放射状に変化しました。細胞は、有毛細胞の領域ではなく、辺縁部線に沿って直線状に形質転換されました。MSCは、さまざまな細胞層と物理的障壁を貫通することにより、神経線維収集領域内を移動および成長することができました。カナマイシンによる16時間の治療により有毛細胞への損傷を誘発し、カナマイシンの除去後さらに72時間細胞を培養したところ、MSCはモディオールスだけでなく、外側の有毛細胞にも局在していました。組織を固定することは、コルチの器官が付着しているこのプロトコルの重要なステップです。簡単には落ちません。これは些細なことですが、外植片の培養を成功させるためのヒントです。この方法は、MSCから分泌されるエクソソームの有効性を研究するために適応できる可能性があります。

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出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

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神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。...

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

細胞移植、細胞骨格標識、機能喪失/獲得アプローチを組み合わせて、このプロトコルは、移動するゼブラフィッシュの有望な脊索前板を使用して、in vivo細胞移動における候補遺伝子の機能を分析する方法を説明しています。...

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶコルチ器官への間葉系幹細胞移動のリアルタイムイメージング法。共焦点顕微鏡を用いて損傷組織への細胞ホーミングを追跡し、時間とコストを削減する効率的なプロトコルを提供します。

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

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