Name: 官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学ぶスピロ環複素環の固相合成法とMTTアッセイによる細胞毒性評価。COS7細胞を用いて新規化合物の細胞生存率を測定し、がん研究や創薬開発への貢献を示す実験手法を解説します。

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この研究は、ファカルティリサーチカウンシルからK.S.H.(アズサパシフィック大学研究助成金局-米国)への助成金によって資金提供されました。A.N.G.とJFMは、学術学部研究経験(SURE)フェローシップの受賞者です。S.K.M.とB.M.R.は、STEM研究フェローシップ助成金(米国アズサパシフィック大学科学研究センター)の受賞者です。バイオアッセイの指導をしてくれたマシュー・ベレズク博士とフィリップ・コックス博士に感謝します。

注:このプロトコルで使用されるいくつかの化学物質および生物学的試薬は、有毒で発がん性があります。使用する前に、関連する製品安全データシート(MSDS)を参照してください。実験を開始する前に、適切な個人用保護具(労働安全衛生局が承認した安全ゴーグル、適切な手袋、白衣、フルレングスのズボン、つま先の開いた靴)を使用してください。さらに、合成を行い、有毒な化学物質や試薬(ヒュームフード)を取り扱う際には、適切な安全対策を講じてください。
1. スピロ環式複素環6および7の固相合成
注:合成は以前に発表された研究11,12に基づいていました。更新されたプロトコルは、三環式複素環のテトラブチルアンモニウムフルオリド触媒開環が不要であり、したがってその除去が合成手順を短縮することを明らかにしている。
<ol><li>REMリンカーへのフルフリルアミンのマイケル添加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。<ol><li>1 g(1当量[当量])のREM樹脂、20 mL(20当量)のジメチルホルムアミド(DMF)、および2.4 mLのフルフリルアミンを25 mLの固相反応容器に加えます。反応開始後24時間室温で反応容器を撹拌する。 メモ: レジンが容器の底に収まらないように、十分に混合してください。</li>
		<li>反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、ジクロロメタン(DCM)とメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>タンデムマイケル付加/1,3-双極子環化付加を実行します(持続時間:25分のセットアップ+ 48時間の反応時間)。<ol><li>乾燥樹脂に、1.48 mL (5当量) のトリエチルアミン (TEA)、0.637 g (2当量) のニトロオレフィン、および 10 mL の乾燥トルエンを反応容器に加えます。</li>
		<li>次に、1.085 mL(4当量)のトリメチルシリルクロリド(TMSCl)を、換気の良いドラフト内の反応容器に追加します。 注意: この反応はHClガスを生成するため、ガスがヒュームフードの下で放出されるまで反応容器に蓋をしないでください。</li>
		<li>反応容器にしっかりと蓋をし、室温で48時間撹拌する。 注:樹脂と試薬を完全に混合してください。</li>
		<li>5 mLのメタノールを使用して反応を停止します。</li>
		<li>容器を排水して溶液を除去し、DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>樹脂結合複素環の N-アルキル化を行い、第4級アミンを形成します(持続時間:10分のセットアップ+24時間の反応時間)。<ol><li>反応容器内の乾燥樹脂に、DMF5mLとハロゲン化アルキル10当量を加え、室温で24時間撹拌する。 注:試薬と樹脂を完全に混合してください。</li>
		<li>反応終了後、樹脂をDMF 1xで洗浄します。次に、DCMとメタノールを交互に使用して4回洗浄します。洗浄後、反応容器内の樹脂を乾燥させる。</li>
	</ol></li>
	<li>ポリマー支持体からの切断のために第四級アミンのβ脱離を実行します(持続時間:15分のセットアップ+ 24時間の反応時間)。<ol><li>反応容器内の乾燥樹脂に、3 mLのDCMと1.49 mL(5当量)のTEAを加えて、ポリマー支持体から複素環を切断します。</li>
		<li>反応混合物を24時間攪拌して、樹脂と溶液を完全に混合します。DCMとメタノールを交互に4回洗浄します。すべての洗浄液から溶出物を収集し、回転蒸発によって濃縮します。</li>
		<li>メタノールで粉砕して、スピロ環状オキシムを精製します。洗浄後、反応容器内で樹脂を完全に乾燥させ、将来の実験で再利用します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. MTT 14を用いた細胞毒性アッセイ
<ol><li>希釈剤として滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、水中0.9%NaCl)を使用して、20 mLの5 mg/mL MTT溶液を調製します。ろ過し、-20°Cで保存します。 次に、ステップ2.1のMTT溶液の1:1希釈液を無血清細胞培養培地(DMEM)で調製します。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド(DMSO)中の100 mM、10 mM、100 μM、10 μM、1 μM、1 μM、0.1 μM、および0.01 μMの試験化合物の1.5 mLマイクロ遠心チューブに各1 mLのストック溶液を調製します。-20°Cで保存してください。 1.5 mLチューブの無血清培地でストック濃度を1:1000に希釈することにより、試験化合物の作業溶液の用量あたり200 μLを調製します。</li>
	<li>組織培養フード内で、COS-7細胞(アフリカミドリザル腎細胞、 セルコピテクス・エチオプス 腎臓)を完全培地[10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM]に播種し、マルチチャンネルピペッターを使用して、ウェルあたり4 ×10 3 細胞/200 μLの濃度で平底の組織培養処理96ウェルプレートに播種します。COS-7細胞が選ばれた理由は、(1)細胞毒性アッセイに一般的に使用される細胞であり、(2)これらはすでに施設内で利用可能であったためです。</li>
	<li>COS-7細胞を5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>ウェルから上清を吸引するには、真空ポンプに取り付けられたガラス製パスツールピペットを使用します。ステップ2.2で調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3連で細胞に投与します(表1を参照)。ステップ2.4に記載されているように細胞をインキュベートします。</li>
	<li>ウェルから上清を吸引します。200 μLのMTT溶液を各ウェルに加えます。5%CO2 を含む雰囲気中で37°Cで4時間インキュベートします。</li>
	<li>紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200 μLのDMSOを加えて、紫色のホルマザン結晶を溶解します。室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの590 nm14 または600 nmでの吸光度を測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。各処理ウェルの吸光度値からバックグラウンド値の平均吸光度を差し引く。データを平均ゼロ線量値のパーセンテージとして正規化します(3つのゼロ線量値を平均します)。y軸にデータをプロットします:線形(%相対細胞生存率);X軸:ログ(濃度)。各系列を個別の曲線としてプロットします(たとえば、三重データには3つの曲線が必要です)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

スピロ環状化合物の合成は、本研究室が実施した先行研究に基づいていましたが、いくつかの変更が加えられています(図1)11,12。各反応工程の進行をIR分光法によりモニターした。REMリンカー1とフルフリルアミンのマイケル添加により、ポリマー結合2が得られました(IR 1722 cm-1→ 1731 cm-1)。前回の報告から、TMS基(IR 1214 cm-1)の検出によって確認されたように、2のISOCは三環式複素環化合物3を生成した。ISOCは生成物の必要な位置選択性および立体選択性を提供するため、これは合成の重要なステップです。TMS官能基の周波数の代わりに3500cm-1の水酸基伸長頻度が観察...

E3ユビキチン-リガーゼマウスダブルミニッツ2ホモログ(MDM2)とp53との相互作用の低分子阻害は、腫瘍細胞アポトーシスのp53媒介誘導を回復させることが知られている1,2,3。MDM2はp53経路の負の調節因子であり、癌細胞でしばしば過剰発現している4、5、6、7、8、9。最近の結晶学的および生化学的研究は、スピロ環状フレームワークを含む小分子がMDM2-p53相互作用を効果的に阻害できることが明らかになりました10。スピロサイクリックフレームワーク(図1、青の網掛け)は、この剛直交環系の誘導体化が新しい治療薬の発見につながったため、特権的なモチーフと考えられています。この興味深いアーキテクチャにアクセスすることは、従来の有機合成技術を使用する場合に課題をもたらします。生体系におけるスピロ環状分子の治療効果は研究されているが、これらの分子の合成は依然として煩雑なプロセスである。過酷な条件を使用した不要な副産物、および危険な遷移金属はしばしば問題になります。
医薬品開発におけるスピロサイクリックモチーフの潜在的な使用は、他の交換可能な官能基に加えてモチーフを有する分子のライブラリを生成するための固相合成を利用するプロトコルの開発につながった11,12。ステップ間の生成物と反応物の分離は、樹脂ビーズと固相フィルター容器に取り付けられたREMリンカーを利用するだけで実現できます。これにより、ステップが削減され、歩留まりが向上する可能性があります。この合成アプローチは、潜在的な薬剤候補の大規模な配列を生成する可能性があります。ただし、生物学的システムにおけるこれらの分子の有効性には、さらなる調査が必要です。
これらのスピロ環状化合物の細胞毒性を決定するために、MTTアッセイ13、14 を採用した。この方法は、細胞生存率を測定し、細胞傷害性を間接的に決定するために使用できます。異なる濃度の阻害剤を96ウェルプレートの培養細胞に添加し、紫色ホルマザン化合物に対するミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる黄色MTTの減少の程度を比色分析により生細胞の割合を測定しました(図2)。活性は、ほとんどの場合、IC50 値(未処理の対照と比較して細胞増殖が50%阻害される濃度)として報告されます。この論文では、MTTアッセイのプロトコルと、これらの新しいスピロ環式分子の予備的な結果について説明します。

<table><tbody><tr><td>CELLS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS-7細胞(ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td>アフリカ<td>ミドリザル腎臓細胞</td></tr><tr><td>CHEMICALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ブロモオクタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td>アル<td>キルハライド</td></tr><tr><td>アリルブロミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>ハロゲン化アルキル</td></tr><tr><td>ベンジル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>ハロゲン化アルキル-ハロゲン化</td></tr><tr><td>物 シスプラチン</td><td>ケイマン化学</td><td>13119</td><td>細胞毒性制御</td></tr><tr><td>ジクロロメタン (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、L-グルタミン配合</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-500</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>フルフリルアミン</td><td>Acros Organics 119800050</td><td></td><td>試薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ヨードメタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>ハロゲン化アルキル</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>MTT ((3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)</td><td>EMD Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>試薬</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>細胞培養培</td></tr><tr><td>地 REM 樹脂</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>ポリマー担体; 0.500 mmol/g ローディング</td></tr><tr><td>trans-&β;-ニトロスチレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>ニトロオレフィン試薬</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>トリエチルアミン (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>ベータ除去</td></tr>トリ<tr><td>メチルシリルクロリド (TMSCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529</td><td>試薬;注意 - 揮発性が高い。HCl gas</td></tr><tr><td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 固相反応容器</td>を作成 <td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>フィルター付きガラス器具</td></tr><tr><td>96 ウェルプレートリーダー</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td></td></tr><tr><td>Instrument AVANCE III NMR Spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>Instrument; 300 MHz;溶媒:CDCl3およびCD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>機器</td></tr><tr><td>手首アクションシェーカー</td><td>Burrell Scientific</td><td>757950819</td><td>機器</td></tr></tbody></table>

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

スピロ環式複素環は、癌治療のための潜在的な薬物であることが最近文献で報告されている。これらの新しい直交環系の合成は困難である。これらの化合物を合成するための効率的な方法論が最近発表され、以前に報告された5つのステップではなく4つのステップで固相合成が説明されました。この短い合成の利点は、有毒な試薬の使用を排除することです。低負荷再生マイケル(REM)リンカーベースの樹脂は、高負荷バージョンではかさばるフェニルおよび芳香族側鎖を含む試薬の添加が妨げられるため、合成に重要であることがわかりました。比色3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して、これらの新規スピロ環式分子のマイクロモル濃度の細胞毒性をin vitroで調べました。MTTは市販品として容易に入手でき、比較的高速で信頼性の高い結果を生成するため、このアッセイはこれらのスピロ環式複素環に最適です。直交環構造ならびにフルフリルアミン(類似の5員環モチーフを含む合成法の前駆体)を試験した。

スピロ環式オキシム6および7は、改変されたプロトコルを用いて合成した(図1)。REMリンカー1bへのフルフリルアミンのマイケル付加により、ポリマー結合樹脂2を得た。反応の進行は、1722 cm-1でのα,β-不飽和エステルの消失を検出することにより、赤外(IR)分光法によってモニターされました(図3)。スピロ環結合樹脂4は、一過性中間体3を介して2から形成された。4のメタノール加水分解により,3-[(3E)-(2S,4R)-2-フェニル-3-ヒドロキシイミノ4-ヒドロキシメチル-ピロリジン-1-イル]-プロピオン酸メチルエステル7が生成し,アルキル化とそれに続くβ脱離により(3E)-(2S,4R)-4-ヒドロキシメチル-1-メチル-2-フェニル-3-ピロリジンオキシム6が得られた。スピロ環式オキシムの同一性は1Hおよび13C核磁気共鳴分光分析によって決定され、純度は...

ここでは、以前に合成したスピロ環式オキシムをテストするために、3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を使用するバイオアッセイについて説明します。

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

このプロトコルは、スピロ環式化合物を製造する際にリサイクル可能で修正された方法を利用しています。MTTアッセイは、これらの新規分子の細胞毒性に関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は、再生出発物質を用いて新規な修飾可能な分子を生成する。MTTアッセイは、以前に実証したように、比較的迅速で、かつ容易に分析できる生物学的結果を提供するスピロ環式ヘテロサイクル6および7の固相合成を行うことから始める。希釈剤として滅菌PBSを使用して、20ミリリットルの5ミリグラム/ミリリットルのMTT溶液を調製します。溶液をろ過し、摂氏マイナス20度で保管します。次に、DMEMでMTT溶液の1対1希釈液を調製する。DMSO中の試験化合物の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに各1ミリリットルのストック溶液を調製する。マイナス20°Cで保管してください。ストック濃度を希釈することによって、試験化合物の作業溶液の用量あたり200マイクロリットルを調製する。無血清培地で1〜1000。組織培養種子において、平底組織培養上の完全培地中の7細胞を、1ウェルあたり200マイクロリットルあたり4,000細胞の濃度で処理した96ウェルプレート上にCOSした。マルチチャンネルピペッターを使用する。5%二酸化炭素を含む雰囲気中で摂氏37度で24時間細胞をインキュベートします。翌日、真空ポンプに取り付けられたガラス製牧草ピペットを用いてウェルから上清を吸引する。事前に調製した作業溶液を使用して、試験化合物を3回で細胞に投与します。その後、細胞をインキュベーターに戻します。24時間後、ウェルから上清を吸引し、各ウェルに200マイクロリットルのMTT溶液を加えます。プレートを4時間インキュベートします。紫色のホルマザン結晶を乱すことなく、ウェルから上清を穏やかに吸引します。各ウェルに200マイクロリットルのDMSOを加えて結晶を溶解します。次に、プレートを室温で15分間インキュベートします。96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を590または600ナノメートルで測定します。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用し、吸光度値を平均します。スピロサイクリックゴックスシーム6および7は、修正されたプロトコルを用いて合成された。反応の進行は、赤外分光法を用いてアルファベータ不飽和エステルの消失を検出することによってモニターした。MTTアッセイは、細胞生存率を決定するために使用されました。高濃度で細胞死を誘導することが知られているシスプラチンは、ポジティブコントロールとして機能しました。予想通り、シスプラチンの濃度が高いほど、細胞生存率は低くなります。次いで、MTTアッセイを用いて、スピロ環状化合物6および7ならびにフルフリルアミンを試験した。フルフリルアミンおよびスピロサイクリックゴックスシームシックスは、同様の細胞毒性を示した。しかし、スピロ環状化合物7の毒性は、フルフリルアミンおよび6の毒性よりも著しく大きかった。このプロトコルを試みる場合、かさばるハロゲン化アシルを使用して実行されるN-アルキル化は、ベータ除去の速度を低下させ、したがって生成物収率を低下させることがわかったことに留意してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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クレイゼン-シュミット凝縮反応はメチンブリッジ結合二環芳香族化合物の生成のための重要な方法論である。アルドール反応の塩基媒介バリアントを利用することにより、蛍光および/または生物学的に関連する分子の範囲は、一般的に安価で運用的に簡単な合成アプローチを通じてアクセスすることができます。...

クレイゼン・シュミット凝縮アプローチによるpH依存性ピラゾール、イミダゾール、イソインドロネジピロンフルオロフォアの合成

チオフェネスルホンアミド化合物は、 ビブリオ クォーラムセンシングレギュレーターLuxR/HapRの強力で特異的な阻害剤であり、 in vivoでの活性を阻害し、病原性、運動性、およびバイオフィルムの遺伝子の転写を防ぎます。このプロトコールでは、これらの化合物がどのように合成され、 in silicoでモデル化され、in vivo...

ビブリオクォーラムセンシング阻害剤の合成とアッセイ

ここでは、新薬発見に不可欠なサングリフェリンAとシクロフィリンA/ガノデリオール-F間のタンパク質-リガンド結合相互作用の構造誘導設計プロトコルを提示します。配子-受容体複合体の安定性は分子動力学シミュレーションを用いて評価されました。...

新規シクロフィリンA阻害剤およびガノデリオールF誘導体の構造誘導設計と開発: シリコ 内アプローチ

このプロトコルは、タンパク質合成における天然産物/小分子阻害剤の特定に最適化されたフルオロメトリックスクリーニング手法を導入します。その実用性から、学部生向けの創薬技術教育や医薬品化学キャンペーンへの応用に適しています。...

天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。...

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

学ぶスピロ環複素環の固相合成法とMTTアッセイによる細胞毒性評価。COS7細胞を用いて新規化合物の細胞生存率を測定し、がん研究や創薬開発への貢献を示す実験手法を解説します。

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

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